Summary
Protocolos de criopreservação de maturação e esperma de enguia Europeia foram melhorados nos últimos anos. Este artigo descreve o melhor protocolo disponível usando gonadotrofina coriônica humana (hCG) para induzir a maturação e metanol como crioprotetor.
Abstract
Durante os últimos anos, diversos grupos de pesquisa têm trabalhado no desenvolvimento e aperfeiçoamento de novos protocolos para o tratamento de enguia europeia e maturação. A partir de ainda, injeções semanais de gonadotrofina coriônica humana (hCG) demonstraram maturate machos após apenas 5-6 semanas de tratamento, produzindo grandes volumes de espermatozoides de alta qualidade durante várias semanas. Além disso, protocolos de criopreservação de esperma usando diferentes extensores, crioprotectores e refrigeração e descongelamento vezes foram anteriormente descritas para a enguia europeia. Aqui, nós mostramos que solução de extensor de Tanaka´s pode ser usada diretamente para a fertilização ou para criopreservação, tornando desnecessária a utilização de diferentes tipos de soluções e diluições. Além disso, o uso do metanol como um crioprotetor faz este protocolo fácil de usar como metanol tem baixa toxicidade e não ativa o esperma. O esperma não precisa ser criopreservado imediatamente após a adição do crioprotetor, e pode ser usado muito tempo depois de ser descongelado. Além disso, é ainda alta motilidade espermática pós-descongelação embora seja menor do que de esperma fresca. O objetivo deste trabalho é mostrar o melhor protocolo disponível para a enguia europeia, manipulação, maturação e criopreservação de esperma.
Introduction
Nos últimos 25 anos, o número da enguia europeia (Anguilla anguilla) chegando no litoral europeu diminuíram progressivamente 90% 1,2,3. Existem vários fatores que explicam essa queda drástica, incluindo a poluição, infecções, destruição de sobrepesca e habitat. Tudo isso teve um efeito profundo sobre esta espécie, levando à inclusão da enguia europeia na União Internacional para a lista de conservação da natureza (IUCN) como em perigo crítico 4. Consequentemente, o desenvolvimento de técnicas e protocolos para a reprodução em cativeiro são necessárias.
A maturação da enguia europeia em cativeiro é alcançada pelo tratamento hormonal 5,6,7 , mas a produção de gametas em ambos os sexos é difícil sincronizar a 8. Mesmo que o desenvolvimento de novos implantes de andrógeno tem mostrado para acelerar a ovogênese em enguias 9,10, o tempo de maturação final nas fêmeas ainda é altamente variável e difícil de controlar 11. Portanto, a curto prazo armazenamento de esperma 12,13,14 e criopreservação técnicas são necessárias para a gestão da reprodução, tornando o gameta sincronização desnecessária 8.
Criopreservação de esperma de enguia europeia tem sido desenvolvida desde 2003 15,16. Vários pesquisadores projetado protocolos bem sucedidos usando dimetilsulfóxido (DMSO) ou metanol como crioprotectores 16,17,18,19,20. Embora ambos os protocolos têm sido utilizados com sucesso, a viabilidade de células obtidas de espermatozoides descongelados criopreservadas com DMSO é inferior com metanol 20,21. Além disso, a enguia esperma é ativada em contato com DMSO e requer mais tedioso esperma manipulação 19, portanto o metanol é um crioprotetor mais adequado para que o esperma de enguia europeia que DMSO.
Aqui, o protocolo de tratamento ideal e tratamento hormonal da enguia europeia será descrito abaixo. Além disso, o melhor protocolo de criopreservação de esperma de enguia europeia utilizando metanol como um crioprotetor e um protocolo para a avaliação da qualidade do esperma nesta espécie também será descrito.
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Protocol
Todos os procedimentos para trabalhar com enguia europeia descrita neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de ética da experimentação do Animal na Universitat Politécnica de València, seguindo as leis espanholas e regulamentos controlando as experiências e procedimentos em animais vivos.
1. peixe de manutenção
- Trazer as enguias europeias para uma instalação de pesquisa e colocá-los em um aquário de 200 L com um sistema de recirculação. Uso de termostatos e refrigeradores para manter uma temperatura constante de 20 ° C.
- Mantenha o peixe no escuro para evitar stress22 e sem comida durante o experimento.
- Manter o peixe em água doce durante os 3 primeiros dias. Então mudar 1/3 da água e encha novamente com água do mar todos os dias até atingir uma salinidade de 37,0 ± 0,3 g/L.
2. tratamento hormonal
Nota: O tratamento hormonal consiste em injeções semanais de gonadotrofina coriônica humana (hCG) durante toda a duração inteira (nove semanas) do experimento.
- Preparar o hormônio hCG antecipadamente em uma concentração de 1 IU / µ l diluindo o hormônio em solução salina (0,9% NaCl).
Nota: O hormônio pode ser preservado diluído nessa concentração para mais de uma semana a-18 ° C. - Para anestesiar o peixe, prepare um balde de flexível de 40 L com 5 L de água do sistema.
- Em um balão de 250 mL, dilua 300 mg de benzocaína em 100 mL de etanol a 70%.
- Despeje a benzocaína diluída na caçamba (concentração final 0,36 mM) e misture bem. Isto é para uma concentração final de benzocaína de 60 mg/L.
- Transfira o peixe, individualmente, para a água com benzocaína e aguarde alguns segundos até que a benzocaína entra em vigor e o peixe está devidamente anestesiado.
Nota: Para confirmar que o peixe é anestesiado, coloque o peixe em posição supina e verificar que ela permaneça ainda nessa posição.
- Para administrar o hormônio, pesar o peixe e preparar o hormônio hCG na dose de 1,5 UI/g de peixe, um tubo de plástico de 1,5 mL.
- Encha uma seringa de 1 mL com o hormônio hCG do tubo de plástico.
- Coloque o peixe anestesiado, em posição supina e com a assistência ou a seringa, injetar o hormônio cuidadosamente na área intraperitoneal.
- Devolver o peixe para o aquário e monitorá-lo até que se recuperou totalmente.
Nota: A administração hormonal tem que ser realizados semanalmente durante o experimento. Normalmente, as enguias europeus começam spermating após 6-7 semanas de tratamento hormonal.
3. esperma amostragem
- Para obter as melhores amostras de qualidade, extrair esperma 24 h após a administração hormonal6,23.
- Anestesia o peixe com benzocaína, conforme descrito no passo 2.2.
- Coloque o peixe anestesiado em posição supina, limpe a área genital com um esguicho de água destilada e seque cuidadosamente com papel, para evitar a contaminação de fezes presente na área genital ou ativação acidental esperma pelo contato com água do mar vem as aquários.
- Colocando os dedos de ambos os lados laterais do peixe, massagem cuidadosamente pressionando lateralmente das barbatanas peitorais para a área genital para forçar o esperma para fora.
- Repita a massagem até que não mais esperma sai da abertura genital.
- Colete o esperma em tubos de plástico de 15 mL usando uma bomba de vácuo.
- Dilua o esperma extraído 01:10 em modificados Tanaka´s extensor solução24 (137 mM NaCl, NaHCO3, em água destilada de 76,2 mM) a 4 ° c.
Nota: O esperma na solução extensor deve ser mantido a 4 ° c.
4. avaliação da qualidade de esperma
- Preparar a água do mar artificial13 (em mM: NaCl 354.7, MgCl2 52,4, CaCl2 9.9, Na2SO4 28,2, 9,4 de KCl, em água destilada) com 2% albumina de soro bovino (BSA) (w:v), ajustar o pH a 8.2, osmolalidade mOsm/kg de 1100 e manter é a 4 ° c para evitar o crescimento bacteriano.
- Abra o software para análise de esperma assistida por computador (CASA) e selecione o módulo do esperma de peixe.
- Clique em Propriedades para abrir a configuração do software do sistema. Lá, defina as opções de captura em 60 imagens por segundo. Selecione fase negativa óptica, câmara de Makler e escala de X 10.
- Os valores de análise, selecione peixes como espécie e área de partículas maiores que 2 µm2 e menor que 20 µm2.
- Sobre os parâmetros de velocidade, definida como lenta quando as células mover-se entre 10 e 45 µm/s, definido como médio , quando se deslocam entre 45 e 100 µm/s e definida como rápida quando se movendo mais rápido do que 100 µm/s.
Nota: Espermatozoides com mais lento do que 10 µm/s de velocidade foram considerados fixa. - Selecione os valores progressivos como 80% da retidão (STR) e salvar as propriedades.
- Clique no Campo de captura (uma janela com as imagens ao vivo da câmera será aberta).
Nota: O sistema de análise de esperma assistida por computador é formado por um microscópio, uma câmera e um software de análise de imagem.
- Na câmara de contagem, coloque 4 µ l de água do mar artificial e adicione 0,5 µ l de solução de esperma (esperma diluída em solução de extensor).
- Focar a imagem com o microscópio com ampliação de 10x na fase negativa. 15 s após a ativação, clique em capturar - de vídeo do software de análise de esperma assistida por computador.
- Analise cada amostra em triplicado e selecionadas amostras com uma mobilidade superior a 70% para criopreservação.
Nota: É muito importante selecionar apenas espermatozoides de alta qualidade para o sucesso do presente protocolo de criopreservação.
5. método de congelamento de esperma
- Prepare antecipadamente o nitrogénio (aproximadamente 2,5 L) em um 34 x 34 cm x 30 cm e grossa caixa de isopor de 5 cm.
Nota: Manter um nível de nitrogênio líquido de 4-5 cm de altura em todos os momentos.- Construa uma estrutura flutuante para pre-congelar o esperma. Use 2 pedaços de isopor (20 cm x 5 cm), ligá-los com 2 tubos de plástico e coloque a estrutura sobre o nitrogênio líquido. Essa estrutura precisa flutuar sobre o nitrogênio líquido a uma altura aproximada de 3 cm sobre a superfície (Figura 1).
Figura 1 . Esquemático, desenho da estrutura flutuante usada para pré-congelamento com nitrogênio líquido. A estrutura é composta de duas peças de baixa densidade de isopor de 20 cm x 4 cm x 5 cm conectado com tubos de plástico de 14 cm. As palhetas são colocadas sobre os tubos de plástico a 3 cm sobre o nitrogênio líquido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Preparar a solução de criopreservação misturando esperma, solução de extensor e metanol na proporção de 1:8:1 em plástico de 1,5 mL a tubos e mexa delicadamente.
- Com a ajuda de uma pipeta, adicione 480 µ l da solução de criopreservação nos 500 canudos µ l e se necessário, marcá-los, fechando uma extremidade com argila de modelagem.
- Colocar a palha no dispositivo flutuante a uma altura de 3 cm sobre o nitrogênio líquido por 3 min. Em seguida, coloque a palha para o nitrogênio líquido.
- Após 10-15 min, transfira os canudos em um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido usando pinça longa e mantê-los submersos em nitrogênio líquido em todos os momentos. Aqui, o esperma pode ser armazenado indefinidamente.
6. método de descongelamento
- Preparar uma caixa de isopor com nitrogênio líquido, conforme descrito na etapa 5.1 e preparar um banho de água usando um copo de 3 L com água da torneira a 40 ° c.
- Transferi o palitinho com esperma congelado do tanque de armazenamento na caixa de isopor com nitrogênio líquido, usando pinça longa.
- Coloque cada palha em um banho de água a 40 ° c para 13 s.
- Despeje o esperma em um tubo de plástico de 1,5 mL cortando as extremidades fechadas da palha com uma tesoura.
- Analise a mobilidade do esperma, usando o sistema de análise de esperma assistida por computador, como explicado no passo 4.1.
- Manter 100 µ l de esperma para analisar a viabilidade de espermatozoides com um citômetro de fluxo.
7. fluxo Cytometry
- Use um kit fluorescente contendo iodeto de propidium (PI), que é um composto fluorescente vermelho que mancha os núcleos das células mortas e um membrana-permeant nuclear composto fluorescente, que verde manchas os núcleos das células vivas.
- Prepare a solução de coloração verde fluorescente, diluindo-a partir da solução-mãe (1mm) 01:10 Tanaka´s médio para uma solução de trabalho de 100 µM.
- Não dilua a solução de PI. A solução é a 2,4 mM.
- Para cada amostra, tomar 50 µ l de esperma fresca ou descongelada e adicione 0,5 µ l de verde fluorescente, manchando a solução de trabalho (concentração final de 1 µM) e 2 µ l da solução de PI (concentração final de 100 µM).
- Incube as amostras contendo os corantes (PI e a coloração verde fluorescente) no escuro por 5 min.
- Diluir as amostras em 500 µ l de solução de Tanaka´s extensor e analisar com o citômetro de fluxo.
- Ligue o citômetro de fluxo e criar um novo protocolo que contém pelo menos 2 terrenos: SS log log de vs FS e vs FL1 FL3.
Nota: Ambos, verde fluorescente iodeto de coloração e propidium pode ser excitado com comprimento de onda visível luz. Quando ligado ao DNA, a emissão de fluorescência máxima destes corantes são 516 nm e 617 nm, respectivamente.- Ajustar as tensões dos diferentes lasers: SS = 199; FS = 199; FL1 = 377; FL3 = 372
- Configurar o acordo de aquisição configurações para eventos máximos = 5000 ou 15 s (a concentração final da amostra deve ser de aproximadamente 1 milhão de células/mL). Leia a amostra usando um fluxo baixo .
- Selecione o modo de leitura único tubo fixada modo posição.
- Colocar a amostra no número certo de carrossel
- Leia a amostra (pressionando F9) e salvar os dados coletados para um arquivo do excel (pressionando F7) para posterior análise.
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Representative Results
Esperma de 18 enguias com uma mobilidade do esperma de 70% ou superior, foi selecionado para este estudo. Os resultados mostraram uma redução em todos os parâmetros de qualidade após descongelamento comparados de esperma fresca (tabela 1 e Figura 2). Os resultados de motilidade (média ± no MEV mostrou, n = 18) mostrou uma maior motilidade total e uma motilidade progressiva no esperma fresca do que o total mobilidade e motilidade progressiva encontrados nas amostras de esperma pós-descongelamento.
O mesmo padrão foi encontrado na análise de células de esperma rápidas, onde congelado-descongelar amostras apresentaram uma baixa relação de células rápidas do que amostras frescas. Além disso, as velocidades de espermatozoide medidas também foram reduzidas nas amostras após descongelação.
Também, os resultados mostraram a viabilidade celular após descongelamento apresentou uma redução nas células de esperma vivo de 23 ± 3,1% (média ± no MEV mostrou, n = 18) de frescas, congelado-descongelar amostras (tabela 1 e Figura 2).
Figura 2 . Motilidade, velocidade curvilínea e dados de viabilidade da célula de esperma fresca e espermatozoides descongelados (após criopreservação). O esperma estava criopreservado para 24h antes de ser descongelado. Os valores apresentados são meios ± no MEV mostrou de esperma de 18 amostras. Asteriscos indicam diferenças significativas entre as amostras descongeladas e frescas (teste t; p < 0,05). A motilidade do parâmetro indicado o percentual de espermatozoides móveis totais, curvilíneas velocidade indicado a velocidade média de espermatozoides ao longo de uma trajetória curvilínea e viabilidade celular indicado a porcentagem de espermatozoides vivos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Células rápido + médio1 (%) | 70,7 ± 2,8 | 2.1* de 27,5 ± |
| Velocidade curvilínea (VCL; µm/s) | 118.8 ± 2,8 | 101,5 ± 1.8* |
| Velocidade de linha reta (VSI; µm/s) | 53,3 ± 1,9 | 45,6 ± 1.3* |
| Caminho de média velocidade (VAP; µm/s) | 73,3 ± 2,1 | 62,0 ± 1.3* |
| Batendo Cruz frequência (Hz) | 27,9 ± 0,3 | 27,1 ± 0,6 |
| Viabilidade celular (% de células vivas) | 97,7 ± 0,3 | 2.8* de 73,8 ± |
| 1 Células mostrando velocidade curvilínea acima de 40 µm/s. | ||
Tabela 1. Resumo dos resultados dos diferentes parâmetros analisados com sistema de análise de esperma assistida por computador de amostras frescas e descongelados. Amostras descongeladas anteriormente foram criopreservadas para 24h. Todos os valores apresentados como média ± no MEV mostrou (n = 18). Asteriscos indicam diferenças significativas entre as amostras descongeladas e frescas (teste t; p < 0,05). Os parâmetros analisados foram: espermatozoides móveis, definidos como a percentagem de células motile totais; motilidade progressiva definida como porcentagem de espermatozoides que nadar para a frente em uma reta essencialmente; rápido e médias células definidas como porcentagem de espermatozoides com uma velocidade curvilínea média acima de 40 µm/s; velocidade curvilínea, definida como a velocidade média de um espermatozoide através de sua trajetória curvilínea; velocidade de linha recta, definida como a velocidade média de um espermatozoide, medido a partir da primeira posição detectada a sua última posição em linha reta; velocidade média de caminho definida como velocidade média de um espermatozoide ao longo de sua trajetória média espacial; batendo a Cruz frequência definida como a taxa média na qual a trajetória de cabeça curvilínea esperma atravessa sua trajetória do caminho médio; viabilidade celular, definida como a porcentagem de espermatozoides vivos.
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Discussion
Este protocolo descreve o processo completo para criopreservação de esperma, a manipulação e a maturação de enguia europeia. As condições de criação descritas aqui são ideais para rápida maturação e produção de grandes volumes de espermatozoides de alta qualidade nesta espécie 6,7,25. O sucesso do presente protocolo de criopreservação e seu uso potencial para a fertilização pós-descongelação dependem grandemente a qualidade do esperma fresco 26. Portanto, a seleção de espermatozoides de alta qualidade é de grande importância. Note que avaliação da qualidade de esperma subjetiva varia de acordo com as habilidades, a percepção e a formação do pesquisador que avalia as amostras 5,,27,28 e pode levar a estimativas de qualidade muito diferente, dependendo do o pesquisador 29. Portanto, o uso da análise de esperma assistida por computador é altamente recomendado para selecionar as melhores amostras de qualidade para criopreservação.
Resultados da qualidade pós-descongelamento esperma apresentado aqui, mostrou uma redução nos parâmetros de motilidade, velocidade e sobrevivência da pilha. Isto é consistente com a bibliografia disponível, apesar de existir uma grande variação entre espécies 26,30. Por exemplo, em um estudo com salmão do Atlântico (Salmo salar), esperma fresca com uma motilidade de 70-95% foi congelada usando diferentes crioprotectores (DMSO e metanol). A motilidade espermática pós-descongelação foi significativamente menor do que em amostras frescas, com valores de motilidade no melhor protocolo de 8,2%, ainda taxa de fertilização com esperma de descongelado foi de 42,8%, que representaram 95% do controle (esperma fresco) 31. Em um estudo diferente com o esperma de alabote Atlântico (Hippoglossus hippoglossus), sem redução significativa na mobilidade do esperma foi encontrada após a criopreservação e a taxa de fertilização com esperma de descongelado foi superior a 95% 32.
Na enguia europeia, estudos anteriores também mostraram uma redução na mobilidade do esperma após criopreservação independentemente o crioprotetor usado 16,18. Além disso, espermatozoides criopreservados de enguia europeia de qualidade semelhante tem sido usada com sucesso para fertilização 8. Nesse estudo, Asturiano et al . usado DMSO como o crioprotetor. O uso de DMSO tem algumas desvantagens de manipulação, desde que esse crioprotetor ativa o esperma e, portanto, precisa ser congelados imediatamente após a adição de DMSO. Também, inseminação com sêmen descongelado precisa ser realizada imediatamente após o descongelamento. A diminuição do pH esperma parcialmente pode resolver este problema 19, mas o protocolo é mais delicado do que o protocolo aqui apresentado com metanol como crioprotetor.
Vários estudos têm demonstrado resultados positivos utilizando metanol como o crioprotetor. Por exemplo, em um estudo realizado com enguia japonesa (japonica do Anguilla) usando um protocolo muito semelhante àquela apresentada aqui, com 10% de metanol como crioprotetor, os autores com êxito fertilizado ovos usando esperma fresca e criopreservada. Neste estudo, obtiveram-se taxas de fertilização de 17%, sem diferenças significativas entre o esperma fresco e criopreservado 33.
O protocolo apresentado aqui revelou-se para preservar a qualidade do esperma suficiente após o descongelamento e mostram características semelhantes de esperma após a descongelação do que protocolos utilizando crioprotectores e extensores diferentes, mas com as vantagens da pré-fácil manuseio e pós-criopreservação. É muito importante seguir com precisão o resfriamento e descongelar vezes descritos aqui, bem como usando o esperma de alta qualidade. Em estudos futuros, ensaios de fertilização serão testados usando este protocolo.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Esta publicação foi financiada pela pesquisa de Horizonte 2020 da União Europeia e o programa de inovação no âmbito do acordo de concessão de Marie Sklodowska-Curie não 642893 (IMPRESS), o escritório de custo (custo de ação FA 1205, AQUAGAMETE) e o centro de excelência em pesquisa- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
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