Summary
Protocoles pour la cryoconservation de maturation et de sperme anguille d’Europe ont été améliorés ces dernières années. Cet article décrit le meilleur protocole disponible à l’aide de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) pour induire la maturation et le méthanol comme cryoprotectant.
Abstract
Au cours des dernières années, plusieurs groupes de recherche ont travaillé sur le développement et l’amélioration de nouveaux protocoles pour la manipulation de l’anguille européenne et de la maturation. En encore, des injections hebdomadaires de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) sont sont révélés maturate mâles après seulement 5-6 semaines de traitement, produire des volumes élevés de qualité de sperme pendant plusieurs semaines. En outre, protocoles de cryoconservation de sperme en utilisant différentes matières de charge, cryoprotecteurs et refroidissement et dégels ont été décrits précédemment pour l’anguille européenne. Ici, nous montrons que Tanaka´s la solution d’extension peut être directement utilisée pour la fertilisation ou pour la cryoconservation, ce qui rend inutile l’utilisation de différents types de solutions et dilutions. En outre, l’utilisation du méthanol comme un cryoprotecteur, ce protocole facile à utiliser comme méthanol a une toxicité faible et ne s’active pas le sperme. Le sperme n’a pas à être cryoconservés immédiatement après l’ajout de la cryoprotecteur, et il peut être utilisé longtemps après être décongelés. En outre, la motilité des spermatozoïdes est encore élevée après décongélation même s’il est inférieur à celui du sperme frais. Le but de ce travail est de montrer le meilleur protocole disponible pour l’anguille européenne, une maturation et une cryoconservation de sperme.
Introduction
Au cours des 25 dernières années, le nombre d’anguille européenne (Anguilla anguilla) arrivant sur les côtes européennes ont diminué régulièrement par 90 % 1,2,3. Il y a plusieurs facteurs qui expliquent cette baisse drastique, notamment la pollution, les infections, destruction d’habitat et de la surpêche. Tout cela a eu un effet profond sur cette espèce, conduisant à l’inscription de l’anguille européenne à l’Union internationale pour la liste de la Conservation de la Nature (UICN) comme en danger critique 4. Par conséquent, le développement des techniques et des protocoles pour la reproduction en captivité sont nécessaires.
La maturation de l’anguille européenne en captivité est obtenue par un traitement hormonal 5,6,7 , mais la production de gamètes chez les deux sexes est difficile à synchroniser 8. Même si le développement de nouveaux implants d’androgènes a montré pour accélérer l’ovogenèse chez les anguilles 9,10, le moment de la maturation finale chez les femmes est encore très variable et difficile à contrôler 11. Stockage à court terme de sperme 12,13,14 cryopreservation techniques et sont donc nécessaires pour gestion de reproduction, faire des gamètes synchronisation inutile 8.
Cryoconservation du sperme de l’anguille européenne a été développée depuis 2003 15,16. Plusieurs chercheurs ont conçu réussies protocoles utilisant le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou méthanol comme cryoprotecteurs 16,17,18,19,20. Bien que les deux protocoles ont été utilisées avec succès, la viabilité des cellules obtenues de sperme décongelé cryopréservé avec le DMSO est inférieure avec méthanol 20,21. En outre, sperme anguille est activée au contact de DMSO et exige plus fastidieux de manipulation de sperme 19, donc le méthanol est un cryoprotecteur plus adapté pour les spermatozoïdes de l’anguille européenne de DMSO.
Ici, le protocole de manipulation optimale et un traitement hormonal de l’anguille européenne est décrites ci-dessous. En outre, le meilleur protocole de cryoconservation de sperme anguille européenne à l’aide de méthanol comme un cryoprotecteur et un protocole pour l’évaluation de la qualité du sperme chez cette espèce seront également décrit.
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Protocol
Toutes les procédures permettant de travailler avec des anguilles européennes décrites dans le présent protocole a étaient approuvés par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale à l’Universitat Politècnica de València, suivant les lois espagnoles et règlements contrôlant les expériences et procédures sur les animaux vivants.
1. Maintenance de poisson
- Porter les anguilles européennes à un centre de recherche et les mettre dans un aquarium de 200 L avec un système de recirculation. Utiliser des thermostats et des glacières pour maintenir une température constante de 20 ° C.
- Garder le poisson dans l’obscurité afin d’éviter le stress22 et sans nourriture pendant l’expérience.
- Garder le poisson dans l’eau douce pendant les 3 premiers jours. Ensuite changez 1/3 de l’eau et remplir avec de l’eau de mer tous les deux jours jusqu'à arriver à une salinité de 37,0 ± 0,3 g/L.
2. hormonothérapie
Remarque : Le traitement hormonal consiste en des injections hebdomadaires de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) pendant toute la durée (neuf semaines) de l’expérience.
- Préparer l’hormone hCG à l’avance à une concentration de 1 IU/µL en diluant l’hormone dans du sérum physiologique (0,9 % NaCl).
Remarque : L’hormone peut être préservée dilué à cette concentration pendant plus d’une semaine à-18 ° C. - Pour anesthésier les poissons, préparer un seau flexible de 40 L avec 5 L d’eau du système.
- Dans un ballon jaugé de 250 mL, diluer 300 mg de benzocaïne dans 100 mL d’éthanol à 70 %.
- Versez la benzocaïne diluée dans le seau (concentration finale 0,36 mM) et mélanger bien. Il s’agit pour une concentration finale de benzocaïne de 60 mg/L.
- Transférer le poisson, individuellement, dans l’eau avec la benzocaïne et attendez quelques secondes jusqu'à ce que la benzocaïne prend effet et le poisson est correctement anesthésié.
Remarque : Pour confirmer que le poisson est anesthésié, placer le poisson dans une position en décubitus dorsal et vérifier qu’il reste toujours dans cette position.
- Pour administrer l’hormone, peser le poisson et préparer l’hormone hCG à une dose de 1,5 UI/g de poisson, dans un tube en plastique de 1,5 mL.
- Remplissez une seringue de 1 mL avec l’hormone hCG dans le tube en plastique.
- Placez les poissons anesthésiés en décubitus dorsal et avec l’aide ou la seringue, injecter de l’hormone soigneusement dans la zone intrapéritonéale.
- Retourner le poisson à l’aquarium et surveiller jusqu'à ce que complètement guéri.
NOTE : L’administration hormonale doit être effectué chaque semaine pendant toute l’expérience. Normalement, les anguilles européennes commencent spermating après 6-7 semaines de traitement hormonal.
3. prélèvement de sperme
- Pour obtenir les meilleurs échantillons de qualité, extrait sperme 24 h après l’administration hormonale6,23.
- Anesthésier les poissons avec la benzocaïne comme décrit dans l’étape 2.2.
- Placez les poissons anesthésiés en décubitus dorsal, nettoyer les parties génitales avec une giclée d’eau distillée et sécher soigneusement avec du papier, pour éviter la contamination de fèces présente dans la région génitale ou l’activation accidentelle de sperme par le contact avec l’eau de mer de l’aquarium.
- Placer les doigts sur les deux côtés latérale du poisson, massez soigneusement appuyant latéralement de ses nageoires pectorales à la région génitale pour forcer le sperme sortir.
- Répéter le massage jusqu'à ce qu’aucuns plus de sperme ne sort de l’ouverture génitale.
- Recueillir le sperme dans des tubes en plastique 15 mL à l’aide d’une pompe à vide.
- Diluer le sperme extrait 01:10 mis à jour le Tanaka´s extender solution24 (137 mM NaCl, 76,2 mM NaHCO3, dans l’eau distillée) à 4 ºC.
Remarque : Le sperme dans la solution d’extension devrait être maintenu à 4 ºC.
4. évaluation de la qualité de sperme
- Préparer l’eau de mer artificielle13 (en mM : NaCl 354,7, MgCl2 52,4, CaCl2 9,9, Na2SO4 28.2, KCl 9.4, dans l’eau distillée) avec 2 % sérum d’albumine bovine (BSA) (filtrantes), ajuster le pH à 8,2, osmolalité à 1100 mOsm/kg et de maintenir Il est à 4 ° c pour éviter la croissance bactérienne.
- Ouvrez le logiciel pour l’analyse du sperme assistée par ordinateur (CASA) et sélectionnez le module de sperme du poisson.
- Cliquez sur Propriétés pour ouvrir la configuration du logiciel du système. Là, définissez les options de capture à 60 images par seconde. Optique de phase négative Select, Makler chambre et échelle de X 10.
- Sélectionnez ensuite les valeurs de l’analyse, poisson comme espèce et zone de particules plus grand que 2 µm2 et inférieure à 20 µm2.
- Sur les paramètres de la vitesse, la valeur lente lorsque les cellules se déplacent entre 10 et 45 µm/s, défini sur moyen lors du déplacement entre 45 et 100 µm/s et valeur rapide lors d’un déplacement plus rapide que 100 µm/s.
Remarque : Les spermatozoïdes d’une vitesse plus lente que 10 µm/s étaient considérés comme immobiles. - Sélectionnez les valeurs progressistes que 80 % de la rectitude (STR) et enregistrer les propriétés.
- Cliquez sur le Champ de Capture (une fenêtre avec les images en direct de la caméra s’ouvrira).
Remarque : Le système d’analyse de sperme assistée par ordinateur est formé par un microscope, une caméra et un logiciel d’analyse image.
- Le comptage de la chambre, mettre 4 µL d’eau de mer artificielle et ajouter 0,5 µL de solution de sperme (spermatozoïdes dilués dans la solution d’extension).
- Mettre l’image au microscope au grossissement de 10 X dans la phase négative. 15 s après l’activation, cliquez sur Capture - à partir de vidéo dans le logiciel d’analyse de sperme assistée par ordinateur.
- Analyser tous les échantillons dans des échantillons en triple et sélectionnez une mobilité supérieure à 70 % pour la cryoconservation.
Remarque : Il est très important de sélectionner seulement qualité de sperme pour la réussite de ce protocole de cryoconservation.
5. méthode de congélation de sperme
- Se préparer à l’azote liquide à l’avance (environ 2.5 L) dans un 34 x 34 cm x 30 cm et la boîte de styromousse épaisseur 5 cm.
Remarque : Maintenir un niveau d’azote liquide de 4-5 cm de hauteur en tout temps.- Construire une structure flottante pour les congeler le sperme. Utiliser 2 morceaux de polystyrène (20 cm x 5 cm), liez-les avec 2 tubes en plastique et la structure sur l’azote liquide. Cette structure doit flotter au-dessus de l’azote liquide à une hauteur approximative de 3 cm sur toute la surface (Figure 1).
Figure 1 . Schéma de la structure flottante utilisée pour la pré congélation dans l’azote liquide. La structure se compose de deux pièces de faible densité de mousse de polystyrène de 20 cm x 4 cm x 5 cm, reliées par des tubes en plastique de 14 cm. Les paillettes sont placés sur les tubes en plastique à 3 cm au-dessus de l’azote liquide. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Préparer la solution de cryoconservation par le mélange de sperme, de la solution d’extension et de méthanol au ratio de 1:8:1 en plastique de 1,5 mL tubes et mélanger doucement.
- Avec l’aide d’une pipette, ajouter 480 µL de la solution de cryoconservation dans les 500 pailles µL et si nécessaire, marquez-les en fermant une extrémité avec la pâte à modeler.
- Mettre la paille sur le dispositif flottant à une hauteur de 3 cm au-dessus de l’azote liquide pendant 3 min. Ensuite, placer la paille dans l’azote liquide.
- Après 10-15 min, transférer les pailles dans un réservoir de stockage d’azote liquide à l’aide de longues pinces et gardez-les immergées dans l’azote liquide à tout moment. Ici, les spermatozoïdes peuvent être conservés indéfiniment.
6. méthode de décongélation
- Préparez une boîte de mousse de polystyrène à l’azote liquide comme indiqué au point 5.1 et préparez un bain d’eau à l’aide d’un bécher 3 L d’eau du robinet à 40 ºC.
- Transférer les paillettes de sperme congelé de la cuve de stockage dans la boîte de styromousse à l’azote liquide à l’aide de longues pinces.
- Mettre chaque paille dans un bain d’eau à 40 ° c pendant 13 s.
- Verser le sperme dans un tube en plastique de 1,5 mL en coupant l’extrémité fermée de la paille avec des ciseaux.
- Analyser la motilité des spermatozoïdes à l’aide de système d’analyse de sperme assistée par ordinateur, comme expliqué dans le point 4.1.
- Gardez 100 µL de sperme pour analyser la viabilité des spermatozoïdes avec un cytomètre en flux.
7. cytométrie en flux
- Utiliser un kit fluorescent contenant de l’iodure de propidium (PI), qui est un composé fluorescent rouge qui taches les noyaux des cellules mortes et un membrane perméable composé fluorescent nucléaire, que les taches de vert les noyaux des cellules vivantes.
- Préparer la solution de coloration verte fluorescente en diluant il de la solution mère (1 mM) 01:10 dans un milieu Tanaka´s à une solution de travail de 100 µM.
- Ne pas diluer la solution PI. La solution est à 2,4 mM.
- Pour chaque échantillon, prendre 50 µL de sperme frais ou dégelés et ajouter 0,5 µL de vert fluorescent, la coloration de la solution de travail (concentration finale 1 µM) et 2 µL de solution de PI (concentration finale 100 µM).
- Incuber les échantillons contenant des colorants (PI et une coloration fluorescente verte) dans l’obscurité pendant 5 min.
- Diluer les échantillons dans 500 µL de solution d’extension Tanaka´s et d’analyser avec le cytomètre en flux.
- Allumez le cytomètre en flux et créer un nouveau protocole contenant au moins 2 parcelles : SS log log vs FS et FL1 vs FL3.
Remarque : Les deux, vert fluorescent iodure de propidium et de coloration peut être excitée avec la lumière de longueur d’onde visible. Lorsqu’elle est liée à l’ADN, l’émission de fluorescence maximale de ces colorants sont 516 nm et 617 nm, respectivement.- Ajuster la tension des différents lasers : SS = 199 ; FS = 199 ; LV1 = 377 ; LV3 = 372
- Mettre en place l’accord de réglages d’acquisition aux événements maximales = 5000 ou 15 s (la concentration finale de l’échantillon devrait être environ 1 million de cellules/mL). Lire l’échantillon à l’aide d’un faible débit.
- Sélectionnez le mode de lecture tube unique mode de position fixé.
- Placer l’échantillon dans le bon numéro du carrousel
- Lire l’échantillon (en appuyant sur F9) et conserver les données collectées dans un fichier excel (en appuyant sur F7) pour une analyse ultérieure.
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Representative Results
Sperme de 18 anguilles avec une motilité des spermatozoïdes de 70 % ou plus, a été choisie pour cette étude. Les résultats ont montré une réduction de tous les paramètres de qualité après que décongélation par rapport à ceux de sperme frais (tableau 1 et Figure 2). Les résultats de la motilité (moyenne ± S.E.M., n = 18) a montré une motilité totale plus élevée et une motilité progressive en sperme frais que la motilité totale et la motilité progressive trouvées dans les échantillons de sperme après décongélation.
La même tendance se retrouve dans l’analyse des spermatozoïdes rapides, congelé-décongelé échantillons présentant un ratio inférieur de cellules rapides que les échantillons frais. En outre, les spermatozoïde de vitesses mesurées ont également été réduits dans les échantillons après décongélation.
En outre, les résultats ont montré que la viabilité cellulaire après décongélation présenté une réduction de spermatozoïdes vivants de 23 ± 3,1 % (moyenne ± S.E.M., n = 18) des échantillons frais congelé-décongelé (tableau 1 et Figure 2).
Figure 2 . Motilité, vitesse curviligne et données de viabilité des cellules de sperme frais et du sperme décongelé (après cryoconservation). Le sperme a été cryoconservé pendant 24 h avant d’être décongelés. Les valeurs présentées sont moyens ± S.E.M. de sperme de 18 échantillons. Les astérisques indiquent des différences significatives entre les échantillons frais et décongelés (test t ; p < 0,05). La motilité de paramètre indique le pourcentage de spermatozoïdes totales, curvilignes vitesse indique la vitesse moyenne des spermatozoïdes le long d’une trajectoire curviligne, et la viabilité des cellules indique le pourcentage de spermatozoïdes vivants. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Les cellules rapide + moyen1 (%) | 70,7 ± 2,8 | 27,5 ± 2,1 |
| Vitesse curviligne (VCL ; µm/s) | 118,8 ± 2,8 | 101,5 ± 1,8 * |
| Vitesse de la ligne droite (VSL ; µm/s) | 53,3 ± 1,9 | 1.3* ± 45,6 |
| Vitesse moyenne des chemins (VAP ; µm/s) | 73,3 ± 2,1 | 1.3* ± 62,0 |
| Battre la fréquence (Hz) | 27,9 ± 0,3 | 27,1 ± 0,6 |
| Viabilité cellulaire (% de cellules vivantes) | 97,7 ± 0,3 | 73.8 ± 2.8* |
| 1 Cellules présentant une vitesse curviligne au-dessus de 40 µm/s. | ||
Tableau 1. Sommaire des résultats des différents paramètres analysés avec système d’analyse de sperme assistée par ordinateur des échantillons frais ou dégelés. Échantillons décongelés ont été précédemment cryoconservés pendant 24 h. Toutes les valeurs présentées comme moyenne ± S.E.M. (n = 18). Les astérisques indiquent des différences significatives entre les échantillons frais et décongelés (test t ; p < 0,05). Les paramètres analysés étaient : spermatozoïdes définies comme le pourcentage de cellules mobiles totales ; motilité progressive définie comme le pourcentage de spermatozoïdes qui nagent avec impatience un essentiellement rectiligne ; cellules rapides et moyens, définis comme le pourcentage de spermatozoïdes avec une vitesse moyenne de curviligne au-dessus de 40 µm/s ; Vitesse curviligne définie comme la vitesse moyenne d’un spermatozoïde par le biais de sa trajectoire curviligne ; Vitesse de ligne droite définie comme la vitesse moyenne d’un spermatozoïde mesurée depuis la première position détectée à sa dernière position en ligne droite ; Vitesse moyenne des chemins définie comme la vitesse moyenne d’un spermatozoïde le long de sa trajectoire moyenne spatiale ; battant la Croix fréquence défini comme le taux moyen au cours de laquelle la trajectoire tête de sperme curvilignes traverse sa trajectoire moyenne des chemins ; viabilité cellulaire définie comme le pourcentage de spermatozoïdes vivants.
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Discussion
Ce protocole décrit le processus complet pour la cryoconservation de maturation, de manutention et de sperme anguille européenne. Les conditions d’élevage décrites ici sont optimales pour la maturation rapide et de la production de grands volumes de sperme de qualité dans cette espèce de7, 6,25. Le succès de ce protocole de cryoconservation et son utilisation possible pour la fécondation après décongélation dépend beaucoup de la qualité du sperme frais 26. Par conséquent, la sélection des spermatozoïdes de qualité est d’une grande importance. Noter que l’évaluation sperme subjective de la qualité repose sur les compétences, la perception et la formation du chercheur qui évalue les échantillons 5,27,28 et peut conduire à des estimations de qualité très différente selon le le chercheur 29. Par conséquent, l’utilisation de l’analyse du sperme assistée par ordinateur est fortement recommandée pour sélectionner les meilleurs échantillons de qualité pour la cryoconservation.
Résultats de la qualité du sperme après décongélation présentés ici ont montré une réduction dans les paramètres de la motilité, la vitesse et la survie des cellules. Cela concorde avec la bibliographie disponible, même s’il y a grande variation entre les espèces 26,30. Par exemple, dans une étude avec du saumon atlantique (Salmo salar), du sperme frais avec une motilité de 70 à 95 % a été gelé à l’aide de différents cryoprotecteurs (DMSO et le méthanol). La motilité des spermatozoïdes après décongélation a été significativement plus faible que dans les échantillons frais, avec des valeurs de motilité dans le meilleur protocole de 8,2 %, mais le taux de fécondation avec sperme décongelé s’élevait à 42,8 %, qui représente 95 % de la commande (du sperme frais) 31. Dans une autre étude avec le sperme du flétan de l’Atlantique (Hippoglossus hippoglossus), aucune réduction significative de la motilité des spermatozoïdes a été trouvée après cryoconservation et le taux de fécondation avec sperme décongelé était supérieur à 95 % 32.
Dans l’anguille d’Europe, des études antérieures également a montré une réduction dans la motilité des spermatozoïdes après que cryoconservation indépendamment le cryoprotecteur utilisé 16,18. En outre, les spermatozoïdes cryoconservés d’anguille européenne de qualité similaire a été utilisé avec succès pour la fertilisation, 8. Dans cette étude, DMSO et coll. utilisé Asturiano comme le cryoprotectant. L’utilisation de DMSO présente certains inconvénients de la manipulation puisque cette cryoprotecteur active le sperme et doit donc être congelés immédiatement lors de l’addition de DMSO. L’insémination avec du sperme décongelé doit aussi être effectuée immédiatement après décongélation. La diminution du pH sperme peut résoudre partiellement ce problème 19, mais le protocole est plus délicat que le protocole présenté ici avec le méthanol en tant que cryoprotecteur.
Plusieurs études ont montré des résultats positifs à l’aide de méthanol comme le cryoprotectant. Par exemple, dans une étude menée avec l’anguille du Japon (Anguilla japonica) en utilisant un protocole très similaire à celle présentée ici, avec 10 % de méthanol en tant que cryoprotecteur, les auteurs avec succès des oeufs fécondés à l’aide de sperme frais et cryoconservés. Dans cette étude, ils ont obtenu des taux de fécondation de 17 %, sans différence significative entre le sperme frais et cryoconservés 33.
Le protocole présenté ici s’est avérée pour préserver la qualité du sperme suffisant après décongélation et montrent des caractéristiques semblables de sperme après décongélation que les protocoles à l’aide de différents extenseurs et cryoprotecteurs, mais avec les avantages d’un maniement facile avant et après cryoconservation. Il est très important de suivre avec précision le refroidissement et dégels décrit ici ainsi que l’utilisation de sperme de qualité. Dans de futures études, essais de fertilisation seront testés à l’aide de ce protocole.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Cette publication a été financée par la recherche Horizon 2020 de l’Union européenne et l’innovation des programmes en vertu de la Convention de subvention de Marie Sklodowska-Curie aucun 642893 (IMPRESS), le Bureau de coût (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE) et le Centre d’Excellence en recherche- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
References
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