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Behavior

मात्रात्मक भोजन के संयोजन-परख और जबरन सक्रिय ंयूरॉंस में भूख का अध्ययन करने के लिए Drosophila

doi: 10.3791/56900 Published: April 24, 2018
* These authors contributed equally

Summary

मात्रात्मक भोजन-रंगे भोजन के साथ सेवन परख एक मजबूत और उच्च प्रवाह का मतलब है खिलाने के लिए प्रेरणा का मूल्यांकन प्रदान करते हैं । thermogenetic और optogenetic स्क्रीन के साथ खाद्य उपभोग परख के संयोजन एक शक्तिशाली करने के लिए वयस्क Drosophila melanogaster में भूख अंतर्निहित तंत्रिका सर्किट की जांच दृष्टिकोण है ।

Abstract

भोजन की खपत मस्तिष्क के तंग नियंत्रण में है, जो शारीरिक स्थिति, तालु, और भोजन के पोषण की सामग्री को एकीकृत करता है, और मुद्दों को शुरू करने के लिए या खिला बंद करो । समय पर और उदारवादी भोजन बनाने के निर्णय अंतर्निहित प्रक्रियाओं को समझने शारीरिक और मनोवैज्ञानिक खिला नियंत्रण से संबंधित विकारों की हमारी समझ में प्रमुख निहितार्थ किया जाता है । सरल, मात्रात्मक, और मजबूत तरीकों प्रयोगात्मक हेरफेर के बाद पशुओं के भोजन की घूस को मापने के लिए आवश्यक हैं, ऐसे जबरन कुछ लक्ष्य ंयूरॉंस की गतिविधियों में वृद्धि के रूप में । यहां, हम डाई लेबलिंग-आधारित खिला परख वयस्क फल मक्खियों में खिला नियंत्रण के neurogenetic अध्ययन की सुविधा शुरू की । हम उपलब्ध खिला परख की समीक्षा, और फिर हमारे तरीकों का वर्णन द्वारा कदम-सेटअप से कदम विश्लेषण करने के लिए, जो thermogenetic और optogenetic डाई-लेबल खाद्य सेवन परख के साथ खिला प्रेरणा को नियंत्रित करने के न्यूरॉन्स के हेरफेर गठबंधन । हम भी हमारे तरीकों के लाभों और सीमाओं पर चर्चा, अंय खिला परख के साथ तुलना में, मदद करने के लिए पाठकों को एक उचित परख चुनें ।

Introduction

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घूस की मात्रा को बढ़ाता है आंतरिक जरूरतों का जवाब देने में मस्तिष्क द्वारा नियंत्रण खिला के कई पहलुओं का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है (जैसे भूख राज्यों के रूप में) और बाहरी कारकों (जैसे खाद्य गुणवत्ता और तालु के रूप में)1, 2 , 3 , 4 , 5 , , 7 , 8 , 9. हाल के वर्षों में, कई परख के विकास के लिए Drosophila नेतृत्व में खिला नियंत्रण के तंत्रिका सब्सट्रेटs को समझने के प्रयासों को सीधे भोजन की मात्रा को बढ़ाता है या खिला प्रेरणा का एक संकेतक के रूप में सेवा 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.

केशिका फीडर (कैफे) परख12,13 एक गिलास microcapillary में तरल भोजन की खपत की मात्रा को मापने के लिए विकसित किया गया था । कैफे परख अति संवेदनशील है और17 reproducible और भोजन की खपत की माप सरल, विशेष रूप से लंबे समय तक बढ़ाता है,18खिला अवधि के लिए । हालांकि, इस परख मक्खियों microcapillary की नोक पर चढ़ने के लिए और उल्टा फ़ीड की आवश्यकता है, जो सभी उपभेदों के लिए उपयुक्त नहीं है । इसके अतिरिक्त, क्योंकि मक्खियों का परीक्षण किया जा करने के लिए कैफे परख का उपयोग करने के लिए तरल भोजन, चयापचय की स्थिति या संभावित कुपोषण पर इन पालन शर्तों के प्रभाव को निर्धारित किया जाना है पर येते हो ।

सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति) परख11,14 भोजन की बूंदों की कोमल छू की ओर सूंड विस्तार प्रतिक्रियाओं की आवृत्ति मायने रखता है । प्रति परख एक शानदार तरीका के लिए व्यक्तिगत मक्खी के खिला प्रेरणा का मूल्यांकन और तालु और खाद्य18,19की सामग्री के प्रभाव का आकलन साबित कर दिया । हालांकि, इसका सेवन राशि का सीधा ठहराव नहीं है ।

हाल ही में, एक अर्द्ध स्वचालित विधि, मैनुअल खिला परख (माफे)15, विकसित किया गया था । माफे में, एक सिंगल मैटीरियल फ्लाई मैन्युअल microcapillary युक्त भोजन के साथ खिलाया जाता है । यह देखते हुए कि सूंड विस्तार प्रतिक्रियाओं और भोजन की खपत एक साथ निगरानी की जा सकती है, माफे पोषक तत्वों के मूल्यों और औषधीय हेरफेर के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयुक्त है । हालांकि, एक मक्खी स्थिर खिला सहित अपने व्यवहार के प्रदर्शन, नकारात्मक प्रभाव हो सकता है ।

इसके अतिरिक्त, सूंड और गतिविधि डिटेक्टर मक्खी (FlyPAD)10 को स्वचालित रूप से खिला व्यवहार मात्रा में विकसित किया गया था । मशीन विजन तरीकों का प्रयोग, FlyPAD रिकॉर्ड एक मक्खी और भोजन के बीच शारीरिक बातचीत की आवृत्ति और सूंड एक्सटेंशन की अवधि के लिए खिला प्रेरणा का एक संकेतक के रूप में । FlyPAD एक उच्च प्रवाह के लिए एक मुक्त चलती मक्खी के खिला व्यवहार पर नजर रखने के दृष्टिकोण प्रदान करता है, हालांकि संवेदनशीलता और इस प्रणाली की मजबूती के लिए और अधिक अध्ययन द्वारा पुष्टि की है12रहता है ।

लेबलिंग रणनीतियों अक्सर मक्खियों में खाद्य घूस का अनुमान लगाया जाता है । यह रासायनिक अनुरेखकों के साथ भोजन लेबल करने के लिए आम है और, भोजन के सेवन की मात्रा की गणना करने के लिए घूस अनुरेखक की राशि को मापने के बाद, खिलाने के बाद. रेडियोधर्मी अनुरेखकों16,17,20,21,22,23,24,25 छल्ली के माध्यम से पता लगाने के लिए अनुमति दें बिना मक्खियों के homogenization । इस विधि उल्लेखनीय कम परिवर्तनशीलता और उच्च संवेदनशीलता18प्रदान करता है, और भोजन के सेवन के दीर्घकालिक अध्ययन के लिए व्यवहार्य है । हालांकि, प्रयोज्य radioisotopes और अवशोषित और उत्सर्जन के विभिंन दरों की उपलब्धता को ध्यान में रखा जाना चाहिए जब इस परख के साथ काम कर रहे ।

लेबल और गैर विषैले खाद्य रंग के साथ खाद्य सेवन अनुरेखण एक सुरक्षित और सरल विकल्प है2,3,26,27,28। मक्खियों घुलनशील और गैर अवशोषित रंजक युक्त भोजन के साथ खिलाने के बाद homogenized हैं, और घूस डाई की मात्रा बाद में quantified एक spectrophotometer का उपयोग कर रहा है3,24,28,29 . लेबलिंग रणनीति प्रदर्शन करने के लिए आसान है और उच्च दक्षता प्रदान करता है, लेकिन एक चेतावनी के साथ । भोजन की मात्रा का अनुमान लगाया डाई से कम वास्तविक मात्रा से छोटी है, क्योंकि उत्सर्जन के रूप में जल्दी शुरू होता है के रूप में 15 मिनट के बाद मक्खियों17खिला शुरू करते हैं । इसके अतिरिक्त, परख आम तौर पर एक ६०-ंयूनतम अवधि है, जो केवल अल्पकालिक खिला व्यवहार की जांच के लिए उपयुक्त है के भीतर खाद्य घूस का आकलन24,28। इसके अलावा, कई आंतरिक और बाह्य कारकों, जैसे जीनोटाइप17, लिंग17, साथी राज्य17, पालन घनत्व30, circadian ताल31,३२, और खाद्य गुणवत्ता3 , 8 , 16, खाद्य सेवन को प्रभावित करते हैं । इसलिए, फीडिंग अवधि को विशिष्ट प्रायोगिक शर्तों के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । भोजन के सेवन के ठहराव को सुविधाजनक बनाने के अलावा भोजन के रंग भी भोजन के विकल्प2,19,27का आकलन करने के लिए, और कैफे12में एक microcapillary में meniscus कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता है ।

यहां, हम डाई लेबलिंग दृष्टिकोण के साथ एक ंयूरॉन गतिविधि के हेरफेर प्रोटोकॉल संयुक्त परिचय । यह रणनीति वयस्क फल में खिला नियंत्रण पर हमारे neurogenetic अध्ययन में उपयोगी साबित हो गया है24मक्खियों. दृश्य स्कोरिंग विधि भोजन की खपत का एक त्वरित आकलन के लिए अनुमति देता है; इस प्रकार, यह एक समय पर फैशन में उपभेदों की एक बड़ी संख्या के माध्यम से स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी है । इसके बाद स्क्रीन से अभ्यर्थियों को अतिरिक्त अध्ययन में वस्तुनिष्ठ एवं सटीक ठहराव प्रदान करने के लिए एक वर्णमिति विधि का प्रयोग करते हुए विस्तार से विश्लेषण किया जाता है ।

खिला परख के अलावा, हम भी thermogenetic27,३३,३४,३५ और optogenetic३६ तरीकों का वर्णन जबरन सक्रिय करने के लक्ष्य ंयूरॉंस में Drosophila। thermogenetic आपरेशन द्वारा न्यूरॉन्स को सक्रिय करने के लिए सरल और सुविधाजनक है के साथ Drosophila क्षणिक रिसेप्टर संभावित Ankyrin 1 (dTRPA1), जो एक तापमान और वोल्टेज-gated कटियन चैनल है कि न्यूरॉन उत्तेजना बढ़ जाती है जब परिवेश तापमान 23 ° c३३,३७से ऊपर उगता है; हालांकि, उच्च तापमान पर जानवरों के परीक्षण व्यवहार पर प्रतिकूल प्रभाव का उत्पादन हो सकता है । एक और प्रभावी दृष्टिकोण Drosophila में न्यूरॉन्स सक्रिय करने के लिए CsChrimson३६के साथ optogenetics का उपयोग कर रहा है, जो एक लाल channelrhodopsin के संस्करण स्थानांतरित कर दिया है कि जब प्रकाश के संपर्क में न्यूरॉन्स की उत्तेजक बढ़ जाती है. Optogenetics thermogenetics से व्यवहार करने के लिए उच्च लौकिक संकल्प और कम अशांति प्रदान करता है । ंयूरॉन गतिविधि के हेरफेर के साथ भोजन के सेवन के मात्रात्मक माप के संयोजन खिला के तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है ।

हम विस्तार से खिला चैंबर की तैयारी का वर्णन और मक्खियों का परीक्षण किया जाएगा । Taotie-Gal4 का प्रयोग एक मॉडल24के रूप में मक्खियों, हम thermogenetics और optogenetics द्वारा सक्रिय ंयूरॉंस का वर्णन । डाई-लेबल वाले भोजन के साथ खाद्य उपभोग की ठहराव की दो परख भी प्रोटोकॉल में बताई गई हैं ।

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Protocol

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1. फीडिंग चैंबर की तैयारी

नोट: डाई लेबलिंग खिला परख के लिए खिला चैंबर दो भागों के होते हैं: बाहर कंटेनर (एक कवर के रूप में) और अंदर कंटेनर (खाद्य स्रोत के रूप में) ।

  1. संवर्धन Drosophila के लिए एक कांच की शीशी से बाहर कंटेनर को संशोधित करें (३१.८ mm की आंतरिक व्यास और ८० mm की ऊंचाई के साथ) (चित्र 1a, 1C) । 1% agarose (5 मिलीलीटर) की एक परत के साथ कंटेनर के नीचे कवर करने के लिए खिला सेटअप ठीक से humidified रखने के लिए और मक्खियों के लिए एक नरम सब्सट्रेट के रूप में सेवा पर चलने के लिए (चित्र 1b) । कंटेनर इस तरह एक नियंत्रित लेकिन प्राकृतिक ंयूनतम तनाव या मक्खियों को अशांति के साथ ले जाने की स्थापना प्रदान करता है ।
    1. बाहर कंटेनर तैयार करें । agarose के ०.५ जी निलंबित डबल आसुत जल के ५० मिलीलीटर में, अक्सर आंदोलन के साथ गर्मी, और एक गर्मी थाली के साथ एक चुंबकीय सरगर्मी पर पूरी तरह से भंग करने के लिए फोड़ा ।
    2. जब 1% agarose के बारे में ६० ° c करने के लिए ठंडा, एक खाली बाहर कंटेनर (आंकड़ा 1b) के लिए 1% agarose के 5 मिलीलीटर हस्तांतरण, और कंटेनर खुले रहने जब तक कमरे के तापमान के लिए नीचे ठंडा करने के लिए एक agarose पैड उपज ।
  2. डाई-लेबल वाले भोजन तैयार करें । डाई लेबल भोजन की संरचना अलग प्रयोगात्मक प्रयोजनों के अनुसार बदलता रहता है । यहाँ केवल सुक्रोज युक्त डाई-लेबल वाले भोजन तैयार करने का एक उदाहरण है.
    1. डबल आसुत जल के ५० मिलीलीटर के लिए agarose के ०.५ ग्राम जोड़ें, लगातार आंदोलन के साथ गर्मी, और एक गर्मी थाली के साथ एक चुंबकीय सरगर्मी पर पूरी तरह से भंग करने के लिए फोड़ा ।
    2. जब ऊपर 1% agarose के बारे में ६० डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा, १०० mM सुक्रोज प्राप्त करने के लिए agarose के लिए सुक्रोज के १.७१ ग्राम जोड़ें ।
    3. जोड़ें ०.५% (w/v) डाई-लेबल खाद्य प्राप्त करने के लिए agarose समाधान के लिए ब्लू डाई (erioglaucine disodium) के ०.२५ जी ।
  3. अंदर कंटेनर तैयार करें । एक फ्लैट क्षैतिज सतह पर खाली अंदर कंटेनरों रखो, तो व्यक्तिगत खाद्य कंटेनर के लिए ब्लू डाई-लेबल भोजन के ७५० µ एल जोड़ने के लिए, इसे कम से कम 5 मिनट के लिए जमना ।
    नोट: अंदर कंटेनर १३.६ mm के एक आंतरिक व्यास और ७.५ mm की ऊंचाई के साथ एक छोटा सा प्लास्टिक डिश है (चित्र 1a, 1C) । यह डाई लेबल भोजन से भर जाता है, और फिर बाहर कंटेनर के agarose पैड के केंद्र में तैनात है ।
  4. एक तैयार बाहर कंटेनर में एक भरा अंदर कंटेनर हस्तांतरण और agarose पैड के केंद्र पर यह स्थिति । दो खिला कक्षों ४० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खुले रहने जब तक बाहर कंटेनर की दीवार संघनित्र से मुक्त है ।
    नोट: सूखी दीवार के लिए पानी की बूंदों से संपर्क करके दीवार पर अटक जा रहा से मक्खियों को रोकने के लिए आवश्यक है ।
  5. डाई मुक्त भोजन के साथ खिला कक्षों तैयार (एक ही रचना लेकिन डाई के बिना) पृष्ठभूमि घटाव के लिए.

2. मक्खियों की तैयारी

नोट: वयस्क महिला eclosion के बाद 5 से 10 दिन मक्खियों आम तौर पर खिला परख के लिए उपयोग किया जाता है । यह अलग पादी की मक्खियों को तैयार करने की सिफारिश की है, आनुवंशिक नियंत्रण सहित, और समानांतर में परीक्षण करने के लिए । 20 मक्खियों (एक खिला चैंबर से) एक डेटा बिंदु उत्पन्न करते हैं ।

  1. वयस्क मक्खियों के पालन के लिए जनसंख्या घनत्व पर विचार करें । आमतौर पर, उपभेदों और संस्कृति की बोतलों के आयामों के अनुसार पैतृक मक्खियों की संख्या अलग करके जनसंख्या घनत्व को नियंत्रित । एक उदाहरण के रूप में, स्थानांतरण 15 पुरुषों और गुआंगज़ौ के 30 महिलाओं-एस एक संस्कृति की बोतल के लिए (३१.८ मिमी के व्यास और ८० मिमी की ऊंचाई के साथ) और मादा एक दिन के लिए अंडे देना तो वयस्क मक्खियों को दूर करने के लिए ।
  2. thermogenetic सक्रियण के लिए मक्खियों को तैयार करें ।
    1. Gal4/यूएएस सिस्टम३८ का उपयोग करें dTRPA1३३ एक्सप्रेस विभिंन ंयूरॉंस में यूएएस-dTRPA1 के साथ पार करके विभिंन Gal4 चालक लाइनों (चित्रा बी) के साथ मक्खियों ।
    2. वयस्क रखें 22 ° c, ६०% सापेक्षिक आर्द्रता पर मानक भोजन पर मक्खियों, और एक 12 ज/12 एच प्रकाश अंधेरे चक्र ।
    3. दो दिन पहले खिला परख करने के लिए, सॉर्ट करें और एक सह2 मक्खी पैड पर एक ताजा भोजन की शीशी में एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत इकट्ठा और शीशी प्रति 20 मक्खियों का घनत्व रखने के लिए ।
  3. optogenetic सक्रियण के लिए मक्खियों को तैयार करें ।
    1. Gal4/यूएएस सिस्टम३८ का उपयोग करें CsChrimson३६ अलग ंयूरॉंस में यूएएस-CsChrimson के साथ विभिंन Gal4 ड्राइवर लाइनों को पार करके व्यक्त करते हैं ।
    2. इकट्ठा नव eclosed (24 घंटे के भीतर) मक्खियों और मानक भोजन के साथ एक शीशी में उंहें हस्तांतरण ४०० µ एम सभी ट्रांस-रेटिना युक्त ।
    3. समयपूर्व सक्रियण को रोकने के लिए, एल्यूमीनियम पंनी के साथ पीछे शीशियों लपेटो और फिर उंहें एक अंधेरे बॉक्स में अवांछित प्रकाश उत्तेजना से मक्खियों की रक्षा के लिए डाल दिया । 25 ° c, 4-6 दिनों के लिए अंधेरे में ६०% आर्द्रता पर मक्खियों रखो ।
    4. दो दिन पहले खिला परख करने के लिए, एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत CO2 मक्खी पैड पर क्रमबद्ध महिला मक्खियों । एक भोजन की शीशी में 20 मक्खियों लीजिए और उंहें खिला परीक्षण करने से पहले अंधेरे में रहते हैं ।
    5. परिवेश प्रकाश की वजह से प्रभाव से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके मंद प्रकाश के तहत सभी आपरेशनों का संचालन । काम क्षेत्र से दूर रखा एक एलईडी लैंप का प्रयोग करें, कार्य क्षेत्र में तीव्रता 5 µW/
      नोट: का प्रयोग भूखे गुआंगज़ौ-एस खिला परख के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में मक्खियों । भोजन की इन मक्खियों से वंचित और 1% agarose पर बनाए रखने के 24 के लिए एच खिला परीक्षण करने से पहले । इन मक्खियों के भोजन की खपत के स्तर में मदद दिन के लिए दिन के उतार चढ़ाव का मूल्यांकन ।

3. Thermogenetic सक्रियण

  1. दिन के एक ही समय में सभी खिला प्रयोगों का संचालन, Zeitgeber समय के आसपास 4-631, ३२, circadian लय के कारण बदलाव को कम करने के लिए.
  2. एक मशीन तैयार (या तापमान नियंत्रित हीटर के साथ एक छोटे से कमरे) हीटिंग वातावरण के रूप में ।
  3. व्यवहार प्रयोगों से पहले, equilibrate तापमान को सुनिश्चित करने के लिए प्रायोगिक तापमान (30 डिग्री सेल्सियस) पर तैयार खिला कक्षों को खिलाने के चैंबर में रिश्तेदार वर्दी है ।
  4. खिलाने की प्रक्रिया शुरू करने के लिए, ध्यान से अपने घर की शीशी से कोमल दोहन द्वारा एक कचौरी खिला चैंबर में 20 मक्खियों हस्तांतरण । ६० मिनट ( चित्र 3ए) के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर खिला प्रक्रिया जारी रखें
    नोट: इस तरह के खोलने और बंद मशीन दरवाजे के रूप में लगातार आंदोलन, प्रतिकूल खिला व्यवहार को प्रभावित, इस प्रकार कम किया जाना चाहिए ।
  5. 30 मिनट के लिए-८० ° c (या-20 ° c) में खिला कक्षों ठंड से ६० मिनट पर खिला संघर्ष ।
    नोट: जमने से सभी मंडलों में एक साथ फीडरों को बंद करने में मदद मिलती है । ठंड में मक्खियों-८० ° c दो प्रयोजनों के लिए, मक्खियों euthanizing के लिए और homogenization तक एक सप्ताह के लिए भंडारण के लिए कार्य करता है ।
  6. तापमान नियंत्रण समूह के लिए, ६० मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर खिलाने की प्रक्रिया शुरू करने के लिए डाई रंग के भोजन के साथ एक कमरे के तापमान खिला कक्ष में 20 मक्खियों हस्तांतरण ।
  7. 30 मिनट के लिए-८० ° c (या-20 डिग्री सेल्सियस) में कक्षों ठंड से तापमान नियंत्रण समूह के खिलाना बंद करो ।

4. Optogenetic सक्रियण

  1. दिन के एक ही समय में सभी खिला प्रयोगों का संचालन, Zeitgeber समय के आसपास 4-631, ३२, circadian लय के कारण बदलाव को कम करने के लिए.
  2. ध्यान से एक शीशी से 20 मक्खियों कोमल दोहन से एक खिला चैंबर में स्थानांतरण, और फिर रोशनी सेटअप (चित्र 4a, 4B) पर बग़ल में चैंबर डाल दिया ।
    1. optogenetic हेरफेर के लिए, नारंगी एल ई डी की एक सरणी का उपयोग करें (६०७ एनएम) प्रकाश उत्तेजना के स्रोत के रूप में, और एलईडी के ऊपर एक क्षैतिज सामिल प्लेट तय करने के लिए रोशनी के दौरान भोजन कक्ष का समर्थन । ६०% आर्द्रता (चित्र 4a, 4B) के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में सेटअप रखें ।
    2. उत्तेजित आनुवंशिक नियंत्रण Taotie > CsChrimson मक्खियों के साथ समानांतर में मक्खियों, लेकिन अलग खिला कक्षों में ।
  3. नारंगी प्रकाश द्वारा वापस रोशनी के साथ ६० मिनट के लिए खिलाने की प्रक्रिया जारी रखें ।
    1. optogenetics के लिए इष्टतम रोशनी तीव्रता का निर्धारण प्रयोग३६Taotie > CsChrimson मक्खियों के लिए, २.२ मेगावाट/mm2 की तीव्रता (गतिवान और रुख नियंत्रण के नुकसान की समाप्ति) पक्षाघात लाती है, इसलिए, ०.१ मेगावाट/mm2 के एक मध्यवर्ती तीव्रता का उपयोग करने के लिए उत्तेजित Taotie > खिला परीक्षण के दौरान CsChrimson मक्खियों ।
  4. 30 मिनट के लिए-८० डिग्री सेल्सियस (या-20 डिग्री सेल्सियस) में ठंड खिला मंडलों द्वारा खिला संघर्ष ।

5. खाद्य उपभोग का दृश्य अनुमान

नोट: दृश्य स्कोरिंग दृष्टिकोण भोजन की खपत का एक अर्द्ध मात्रात्मक अनुमान प्रदान करता है । हालांकि यह ऑप्टिकल विधि के रूप में उद्देश्य के रूप में नहीं है, इस विधि एक समय पर फैशन में मक्खी उपभेदों की एक बड़ी संख्या के माध्यम से जाने के लिए अनुमति देता है, यह एक आनुवंशिक स्क्रीन के पहले दौर के लिए उपयुक्त बनाने के लिए जल्दी से आगे परीक्षण के लिए उंमीदवारों की सूची को संकीर्ण ।

  1. खिला प्रक्रिया के बाद, anesthetize और एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत एक सह2 मक्खी पैड पर मक्खियों स्कोर । अपने पेट (चित्रा 2a) में डाई रंग के भोजन की मात्रा और तीव्रता के आधार पर प्रत्येक मक्खी के लिए व्यक्तिगत स्कोर दे ।
    नोट: दृश्य आकलन के लिए मानदंड: स्कोर प्रणाली अलग मात्रा और पेट में रंग का भोजन की तीव्रता के लिए इसी भोजन का सेवन के 4 स्तरों है ।
    1. स्कोर बिना पता लगाने वाला डाई रंग का खाना 0 का एक स्कोर मक्खियों; बेहोश (बमुश्किल जासूसी) नीले रंग के साथ या डाई रंग का खाना पेट की मात्रा के एक तिहाई से कम पर कब्जा के साथ उन दे 1 का स्कोर ।
    2. स्कोर तीव्र डाई रंग का भोजन के साथ मक्खियों पेट के एक आधे पर कब्जा 2 का स्कोर ।
    3. तीव्र रंगे सामग्री के साथ उन स्कोर पेट के आधे से अधिक कब्जा 3 (चित्रा 2a) के स्कोर ।
  2. प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति (चित्रा बी)) में विभिन्न स्कोर के साथ मक्खियों के अनुपात की गणना.

6. खाद्य उपभोग की वर्णमिति ठहराव

  1. दूध पिलाने की समाप्ति के बाद, एक खिला चैंबर से सभी 20 मक्खियों कागज वजन का एक टुकड़ा पर बाहर डालना है, तो उंहें एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण एक नरम ब्रश का उपयोग कर ।
    नोट: एक ही समय में ठंड चैंबर पर पानी संघनित्र के चैंबर दीवार से चिपके हुए मक्खियों से बचने के लिए-८० ° c भंडारण से बाहर के सभी कक्षों का मत लो ।
  2. ट्यूब के लिए PBST के ५०० µ एल जोड़ें और homogenize 5 एस के लिए ६० हर्ट्ज पर एक पीस मिल का उपयोग मक्खियों ।
    1. अवलोकन द्वारा पर्याप्त homogenization की पुष्टि करें जब शरीर के अंगों का कोई पता लगाने के टुकड़े हैं ।
  3. १३,००० rpm पर 30 मिनट के लिए homogenates के साथ ट्यूबों स्पिन को मलबे साफ है ।
  4. केंद्रापसारक के बाद, supernatant के १०० µ एल स्थानांतरण एक अच्छी तरह से एक ९६ की थाली के लिए ।
  5. सभी नमूनों को लोड करने के बाद, एक प्लेट रीडर में प्लेट को ६३० एनएम पर नमूनों के अवशोषण को मापने के लिए डाल दिया ।
  6. पृष्ठभूमि अवशोषण को दूर करने के लिए, नीले खाद्य खिलाया मक्खियों से supernatant के अवशोषण से डाई के बिना भोजन पर खिलाया मक्खियों से supernatants के अवशोषण घटाना.
    नोट: इस कदम का उपयोग भोजन की रचनाओं पर निर्भर करता है, वैकल्पिक है । जब एक मक्खी भोजन (बिना डाई) ६३० एनएम पर अवशोषित उत्पंन करता है, यह इस कदम को प्रदर्शन करने के लिए पृष्ठभूमि को खत्म करने के लिए आवश्यक है ।

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Representative Results

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Thermogenetic स्क्रीन.

असामान्य रूप से वृद्धि की भूख ऊंचा भोजन के सेवन का कारण बनता है, शारीरिक आवश्यकताओं की परवाह किए बिना. हम इस योजना के लिए एक उच्च प्रवाह व्यवहार स्क्रीन डिजाइन करने के लिए भूख और तृप्त राज्यों से संबंधित न्यूरॉन्स के आनुवंशिक संभालती प्राप्त करने के लिए उपयोग (चित्रा 1) । स्क्रीन Taotie-Gal424झुकेंगे । जब Taotie-Gal4 ंयूरॉंस 30 डिग्री सेल्सियस पर जबरन सक्रिय थे, Taotie > TrpA1 मक्खियों (चित्रा 2, चित्रा 3) नियंत्रण से अधिक भोजन की बड़ी मात्रा में किया जाता है ।

नेत्रहीन भोजन की खपत स्कोरिंग ।

क्योंकि कुछ न्यूरोट्रांसमीटर और neuropeptides खिला व्यवहार के विनियमन में संकेत दिया गया है, हम इसी GAL4 लाइनों का परीक्षण किया है, NPF सहित20, sNPF३९, octopamine21,27डोपामाइन, ४०, सेरोटोनिन४१,४२, आख३५, और Dilp27,8,३५. खिला प्रतिक्रिया यों तो, हम नेत्रहीन का निरीक्षण किया और आंत (चित्रा 2a) में detectable डाई के विभिन्न मात्रा के साथ मक्खियों रन बनाए. Taotie न्यूरॉन्स के सक्रियकरण के बाद, Taotie के बारे में ५८% > dTrpA1 मक्खियों मजबूत खिला व्यवहार का प्रदर्शन किया, और इनमें से 23% दिखाया हल्के खिला व्यवहार (आंकड़ा 2 बी). इसके विपरीत, केवल सीमांत खिला व्यवहार अंय ंयूरॉंस के साथ मक्खियों में देखा गया dTrpA1 (चित्रा बी) के माध्यम से सक्रिय ।

भोजन के सेवन से वर्णमिति ठहराव ।

उच्च परिशुद्धता और निष्पक्षता के साथ भोजन का सेवन यों तो, हम एक तरंग दैर्ध्य खाद्य2,27,28में जोड़ा डाई के लिए विशिष्ट पर मक्खी निष्कर्षण के अवशोषण मापा । भोजन के सेवन की मात्रा के साथ एक अवशोषित मूल्य सहसंबंधी बनाना, एक मानक वक्र नमूना समाधान के अवशोषण (मक्खियों, PBST को अनुमन्य के लिए एक ही बफर) अलग मात्रा के साथ मिश्रित मापने के द्वारा प्राप्त किया गया था) । के रूप में हमारे परिणाम प्रदर्शित करता है, तीव्र सक्रिय Taotie-GAL4 न्यूरॉन्स TRPA1 द्वारा नाटकीय रूप से आनुवंशिक नियंत्रण और एक ही परीक्षण की अवधि के दौरान तापमान नियंत्रण के साथ तुलना में भोजन का सेवन बढ़ा (आंकड़ा बी), सुझाव है कि Taotie-GAL4 लेबल न्यूरॉन्स वयस्क Drosophilaके भोजन का सेवन के विनियमन में भाग लेते हैं.

Optogenetic सक्रियण में भोजन की मात्रा को बढ़ावा देने के लिए Drosophila

हम यूएएस-CsChrimson इस्तेमाल किया एक नारंगी प्रकाश३६ (चित्रा 4a, 4B) के साथ रोशनी से Taotie ंयूरॉंस सक्रिय । जब Taotie > CsChrimson मक्खियों ६०७ एनएम पर एलईडी रोशनी से उत्तेजित थे, वे नियंत्रण से काफी अधिक खाना (आंकड़ा 4c) घूस लिया । इसके अलावा, घूस भोजन की मात्रा उत्तेजना प्रकाश (चित्रा 4d) की तीव्रता के साथ अच्छी तरह से संबंधित । इस प्रकार, dTrpA1 के साथ thermogenetics के अलावा, Taotie न्यूरॉन्स में CsChrimson के साथ optogenetic सक्रियण भी तृप्त मक्खियों में प्रेरणा खिला को बढ़ावा देता है.

Figure 1
चित्र 1 . वयस्क मक्खियों में भूख का विश्लेषण करने के लिए एक खिला प्रतिमान । () खिला चैंबर एक अंदर डाई रंग का खाना और एक बाहर 1% agarose के साथ गद्देदार कंटेनर से भरा कंटेनर शामिल हैं । बाएं से दाएं, अंदर कंटेनर, बाहर कंटेनर, और पूरा खिला चैंबर । (B) अंदर का कंटेनर बाहर के कंटेनर के नीचे agarose पैड के ऊपर बैठता है । () फीडिंग चैंबर का शीर्ष दृश्य । (D) एक योजनाबद्ध "भूख स्क्रीन" प्रयोग दिखा रहा है । सामान्य तृप्त मक्खियों शायद ही कभी खाना खाया (बाईं शीशी), जबकि जबरन कुछ खिला नियंत्रण ंयूरॉंस को सक्रिय करने के कारण अतिरिक्त भोजन निगलना मक्खियों, इस प्रकार पेट (सही शीशी) में डाई रंग का भोजन का प्रदर्शन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . खाद्य घूस का दृश्य आकलन । () पेट में खाद्य सामग्री स्कोरिंग के लिए मानदंड दिखाने के लिए अनुकरणीय छवियाँ. () 30 डिग्री सेल्सियस पर dTrpA1 द्वारा सक्रिय किया जा रहा संकेत न्यूरॉन्स के साथ मक्खियों में खिला स्कोर का वितरण । No-Gal4: यूएएस-dTrpA1 (आनुवंशिक नियंत्रण); NPF-GAL4: neuropeptide च सकारात्मक न्यूरॉन्स; sNPF-GAL4: अल् neuropeptide F पॉजिटिव न्यूरॉन्स; TDC1-GAL4 और TDC2-GAL4: octopamine न्यूरॉन्स; TH-GAL4: डोपामाइन न्यूरॉन्स; 5-एचटी: सेरोटोनिन न्यूरॉन्स; आख: adipokinetic हार्मोन पॉजिटिव न्यूरॉन्स; dip2: इंसुलिन की तरह पेप्टाइड 2 सकारात्मक ंयूरॉंस; Taotie-GAL4: Taotie-GAL4 लेबल न्यूरॉन्स (n = १२० शर्त प्रति मक्खियों). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . Thermogenetic-सक्रियकरण के Taotie न्यूरॉन्स वयस्क मक्खियों में भोजन की खपत बढ़ जाती है । (A) कोई छवि thermogenetic सक्रियण प्रयोग के सेटअप को दिखाती है । खिला परीक्षण 30 डिग्री सेल्सियस में एक मशीन में प्रदर्शन किया गया था । () तृप्त मक्खियों में वर्णमिति ठहराव द्वारा भोजन की खपत या तो 30 डिग्री सेल्सियस या 22 डिग्री सेल्सियस पर परीक्षण के लिए 1 एच एक मक्खी के भोजन की खपत की राशि एक खिला चैंबर (n = 6) में 20 मक्खियों की है कि से गणना की गई थी । एन एस इंगित करता है कि (p > 0.05) महत्वपूर्ण नहीं है; p < 0.001 । Tukey की पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ एक-तरफ़ा ANOVA कई तुलना का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया था । त्रुटि पट्टियों का संकेत मतलब ± SEM. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 . Optogenetic-Taotie न्यूरॉन्स के सक्रियकरण एक तीव्रता पर निर्भर तरीके से भोजन के सेवन की मात्रा बढ़ जाती है. (A, B) optogenetic सक्रियण के लिए सेटअप के दो दृश्य । खिला कक्षों एक समर्थन प्लेट पर बग़ल में रखी और नारंगी एल ई डी की एक सरणी द्वारा नीचे से प्रबुद्ध थे । अंदर एलईडी दिखाने के लिए दीप्ति बॉक्स के सामने की तरफ निकली थी । व्यवहार प्रयोगों एक मशीन के अंदर 25 डिग्री सेल्सियस, ६०% आरएच पर प्रदर्शन किया गया । () संकेत पादी की तृप्त मक्खियों के खाद्य उपभोग जब optogenetic रोशनी के तहत या अंधेरे में 1 ज (n = 6) के लिए परीक्षण किया । () तृप्त Taotie द्वारा खाद्य घूस > CsChrimson मक्खियों दीप्ति तीव्रता (n = 6) के साथ संबंधित था । एन एस इंगित करता है कि (p > 0.05) महत्वपूर्ण नहीं है; p < 0.001, Tukey के पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ अनुसरण किए गए एक-तरफा ANOVA का उपयोग दो समूह की तुलना के लिए कई तुलनाएं, विद्यार्थी के t-परीक्षण का विश्लेषण करने के लिए किया गया था । त्रुटि पट्टियों का संकेत मतलब ± SEM. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

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यह रिपोर्ट डाई-लेबलिंग thermogenetic और optogenetic सक्रियण के संदर्भ में भोजन की खपत को खिलाने की परख की तकनीकी प्रक्रिया पर केंद्रित है ंयूरॉंस को नियंत्रित करने में हेरफेर । यह सरल और विश्वसनीय प्रोटोकॉल खिला नियंत्रण में उंमीदवार न्यूरॉन्स के समारोह स्पष्ट करने में मदद, मक्खियों के भोजन की पसंद को मापने के लिए, और खिला नियंत्रण सर्किट के माध्यम से खिलाने में उपंयास खिलाड़ियों की पहचान करने के लिए आधारित आनुवंशिक स्क्रीन24

डाई लेबलिंग रणनीति अल्पकालिक खिला व्यवहार की जांच में संभव है । डाई, erioglaucine disodium, में भंग और भोजन के साथ घूस, भोजन की खपत का एक महत्वपूर्ण संकेतक है । देशपांडे एट अल. प्रदर्शन किया है कि ब्लू डाई ही खिला पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया जब दोनों कैफे परख और रेडियो आइसोटोप लेबलिंग खाद्य सेवन परख 17 से मापा । इसी तरह, हमारे प्रति परिणाम (डाई-लेबल या डाई-मुक्त १०० mM सुक्रोज समाधान के साथ मक्खी पैर उत्तेजक) संकेत दिया है कि मक्खियों डाई लेबल या डाई मुक्त भोजन की ओर उनकी प्रतिक्रिया में कोई महत्वपूर्ण अंतर का प्रदर्शन किया । हालांकि, वहां अभी भी स्पष्ट है कि डाई Drosophilaमें बेस्वाद है के बारे में डेटा नहीं हैं ।

महत्वपूर्ण कदम प्रोटोकॉल में संकेत के अलावा, मक्खियों की सामांय स्थिति के लिए विशेष रूप से ध्यान देने के लिए परीक्षण किया जाएगा । इसके अलावा किया जा रहा है और एक गैर-भीड़ घनत्व पर बनाए रखा जा रहा है, मक्खियों धीरे से नियंत्रित किया जाना चाहिए, और अनावश्यक झटके या तनाव से बचने के लिए, क्रम में अनुरूप खिला परिणाम उत्पादन करने के लिए ।

खिला प्रतिमान यहां प्रस्तुत कुछ सीमाएं हैं । सबसे पहले, हमारे तरीके एक ६० मिनट की अवधि में भोजन की खपत यों तो । लंबी अवधि के लिए भोजन का मूल्यांकन करने के लिए, जैसे एक दिन, कैफे के रूप में एक अलग विधि, की जरूरत होगी । दूसरा, radioisotopes का उपयोग कर ठहराव तरीकों के साथ तुलना में, वर्णमिति विधि कम संवेदनशील और भोजन की खपत की मात्रा कम कर रहे हैं जब मतभेदों को हल करने के लिए मुश्किल है. तीसरा, विचार है कि कुछ मक्खियों को खिलाने के शुरू होने के बाद 15 मिनट के रूप में जल्दी निर्वहन शुरू होता है, इस प्रोटोकॉल वास्तव में एक जनसंख्या17में भोजन के सेवन और उत्सर्जन के शुद्ध परिणाम उपाय । चौथे, भोजन के सेवन के वर्णमिति ठहराव यहां वर्णित एक मक्खी समूह के लिए था, एक मक्खी के भोजन की घूस का आकलन अंय खिला परख पर निर्भर करता है, जैसे रेडियो आइसोटोप लेबलिंग, माफे परख, या FlyPAD । फिर भी, भोजन के सेवन के वर्णमिति ठहराव के कुछ लाभ, जैसे कि एक सरल, स्थिर, दृश्यमान, और उच्च प्रवाह विधि, यह उपभेदों की बड़ी संख्या के ठहराव के लिए एक प्रमुख विकल्प बनाने के लिए विशेष रूप से खिला आधारित आनुवंशिक स्क्रीन और अनुवर्ती अध्ययन ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

इस कार्य में चीन के राष्ट्रीय बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम (2012CB825504), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (९१२३२७२० और ९१६३२१००४२), चीनी विज्ञान अकादमी (कैस) (GJHZ201302 और QYZDY-SSW-SMC015), बिल और मेलिंडा गेट्स द्वारा भाग में समर्थित किया गया था फाउंडेशन (OPP1119434), और १००-कैस के प्रतिभा कार्यक्रम को वाई. झू.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UAS-CsChrimson Bloomintoon 55135
UAS-dTrpA1 Bloomintoon 26263
TDC1-GAL4  Bloomintoon 9312
TDC2-GAL4 Bloomintoon 9313
sNPF-GAL4 Provided by Z. Zhao
NPF-GAL4 Provided by Y. Rao
TH-GAL4 Provided by Y. Rao
5-HT-GAL4 Provided by Y. Rao
AKH-GAL4 Provided by Y. Rao
dip2-GAL4 Provided by Y. Rao
Taotie-GAL4 Provided by J. Carlson
Agarose Biowest G-10
Sucrose Sigma S7903
Erioglaucine disodium salt Sigma 861146
all-trans-retinal  Sigma  R2500 stored in darkness
Triton X-100 Amresco 9002-93-01
Fly food 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH   
 1x PBS buffer  1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4
PBST buffer 1X PBS with 1% Triton X-100
 Grinding mill Shang Hai Jing Xin Tissuelyser-24
Incubator Ning Bo Jiang Nan HWS-80
Magnetic stirrer with a heat plate Chang Zhou Bo Yuan CJJ 78-1
Spectrometer Thorlabs CCS200/M
Microplate Spectrophotometer Thermo Scientific  Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200
Fluorescence stereo microscope  Leica  M205FA
Stereo microscope Leica  S6E
Outside container Jiang Su Hai Men glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension)
Inside container  Beijing Yi Ran machinery factory plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension)
1.5 mL Eppendorf tubes Hai Men Ning Mong
 96 well plate Corning Incorporated  Costar 3599
LEDs Xin Xing Yuan Guangdian 607 nm, 3W  https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058

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References

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मात्रात्मक भोजन के संयोजन-परख और जबरन सक्रिय ंयूरॉंस में भूख का अध्ययन करने के लिए <em>Drosophila</em>
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Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila. J. Vis. Exp. (134), e56900, doi:10.3791/56900 (2018).More

Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila. J. Vis. Exp. (134), e56900, doi:10.3791/56900 (2018).

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