Summary
توفير فحوصات تناول الطعام الكمية مع الأغذية المصبوغة قوية والفائق يعني تقييم الدافع التغذية. الجمع بين تحليل استهلاك الغذاء مع ثيرموجينيتيك وشاشات أوبتوجينيتيك نهج قوية للتحقيق في الدوائر العصبية الكامنة وراء الشهية في تعليم الكبار melanogaster المورفولوجية.
Abstract
استهلاك المواد الغذائية يتم تحت رقابة صارمة من الدماغ، والذي يدمج في الحالة الفسيولوجية واستساغة والمحتويات الغذائية للأغذية، والمسائل الأوامر لبدء تشغيل أو إيقاف التغذية. فك رموز العمليات الأساسية لصنع القرار في الوقت المناسب والمعتدل التغذية يحمل آثار كبيرة في فهمنا للاضطرابات الفسيولوجية والنفسية ذات الصلة بالتغذية عنصر التحكم. أساليب بسيطة، والكمية والقوية مطلوبة لقياس ابتلاع أغذية الحيوانات بعد التلاعب التجريبية، مثل زيادة أنشطة معينة من الخلايا العصبية المستهدفة قسراً. هنا، قمنا بعرض العلامات صبغي فحوصات التغذية لتسهيل دراسة الجينوم تغذية التحكم في ذبابة الفاكهة الكبار. نستعرض فحوصات التغذية المتاحة، وثم وصف أساليب عملنا خطوة بخطوة من الإعداد للتحليل، التي تجمع بين ثيرموجينيتيك والتلاعب أوبتوجينيتيك للسيطرة على الدافع التغذية مع المقايسة المدخول الغذائي المسمى صبغ الخلايا العصبية. نحن أيضا مناقشة مزايا وقيود لأساليب عملنا، بالمقارنة مع فحوصات التغذية الأخرى، لمساعدة القراء على اختيار فحص مناسبة.
Introduction
تقدير كمية الأغذية التي تناولها مهم لتقييم الجوانب المتعددة لتغذية عناصر التحكم بالدماغ في الاستجابة للاحتياجات الداخلية (مثل حالات الجوع) والعوامل الخارجية (مثل نوعية المواد الغذائية واستساغة)1، 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9-في السنوات الأخيرة الجهود لفك رموز ركائز العصبية لتغذية التحكم في المورفولوجية تؤدي إلى تطوير فحوصات متعددة تقدير كمية الأغذية التي تناولها مباشرة أو بمثابة مؤشر لتغذية الدافع 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
12،المقايسة الشعرية المغذية (مقهى)13 وضعت لقياس كمية استهلاك الغذاء السائل في ميكروكابيلاري زجاج. والرزن مقهى حساسة للغاية واستنساخه17 ويبسط بقياس استهلاك الغذاء، خاصة بالنسبة للتحديد الكمي لتغذية طويلة الأجل18. ومع ذلك، يتطلب هذا الفحص الذباب الصعود إلى غيض ميكروكابيلاري وتغذية رأسا، التي ليست مناسبة لجميع سلالات. بالإضافة إلى ذلك، بسبب الذباب اختبار باستخدام مقايسة مقهى يجب أن تكون تربيتها على الغذاء السائل، يبقى تأثير هذه تربية الظروف في حالة التمثيل الغذائي أو سوء التغذية المحتملة يجب تحديد.
11،المقايسة استجابة ملحق ململه (في)14 حساب تواتر ململه ملحق الاستجابات تجاه لمسات رقيقة من قطرات الغذاء. كل مقايسة ثبت كوسيلة ممتازة لتقييم تغذية الدافع للطيران الفردي وتقويم تأثير استساغة والمحتوى الغذائي،من18إلى19. بيد أنه ليس إجراء تقييم كمي مباشرة من المبلغ المتحصل.
في الآونة الأخيرة، تم تطوير أسلوب شبه تلقائي، دليل تغذية المقايسة (ماف)15،. في ̯͡، ويتم تغذية ذبابة المعطل تداولها واحد يدوياً مع ميكروكابيلاري التي تحتوي على الأغذية. نظراً لأن يمكن رصد ردود ملحق ململه والاستهلاك الغذائي في نفس الوقت، ̯͡ مناسبة لتقييم القيم الغذائية والآثار للمعالجة الدوائية. ومع ذلك، أن شل حركة الطيران قد تؤثر سلبا على أدائها السلوكية، بما في ذلك التغذية.
بالإضافة إلى ذلك، تطير ململه و "كشف النشاط" (فليباد)10 وضعت لقياس سلوك التغذية تلقائياً. استخدام أساليب الرؤية آلة، فليباد السجلات التفاعلات الفيزيائية بين الطيران والأغذية لتحديد تواتر ومدة التمديد ململه كمؤشر لتغذية الدافع. فليباد يوفر نهجاً الفائق لرصد سلوكيات التغذية من ذبابة التحرك الحر، على الرغم من حساسية ومتانة هذا النظام ما زال كذلك يؤكده أكثر الدراسات12.
كثيرا ما تستخدم استراتيجيات التوسيم لتقدير ابتلاع الغذاء في الذباب. ومن الشائع تسمية الغذاء مع تتبع المواد الكيميائية، وبعد الرضاعة، قياس مقدار الراسم بلعها لحساب كمية الاستهلاك الغذائي. تتبع المشعة16،17،20،21،،من2223،24،25 تسمح للكشف عن طريق بشرة دون تجانس الذباب. هذا الأسلوب يوفر تقلب منخفضة بشكل ملحوظ وحساسية عالية18، وهو عمليا لدراسة طويلة الأجل لتناول الطعام. ومع ذلك، توفر النظائر المشعة للاستخدام ومعدلات مختلفة لامتصاص وإفراز ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند العمل مع هذا التحليل.
التالي، وتعقب تناول الطعام مع ألوان الطعام غير سامة هي أكثر أماناً وأكثر بساطة بديل2،3،26،،من2728. هي تجانس الذباب بعد الرضاعة مع الأغذية التي تحتوي على الأصباغ القابلة للذوبان وغير الامتصاص، ومقدار الصبغة بلعها هو كمياً في وقت لاحق باستخدام جهاز المطياف الضوئي3،،من2428،29 . من السهل القيام باستراتيجية التوسيم ويوفر كفاءة عالية، ولكن مع تحذير. حجم الحصة الغذائية المقدرة من الصبغة بلعها أصغر من الحجم الفعلي لأن يبدأ إفراز أقرب 15 دقيقة بعد بدء الذباب تغذية17. بالإضافة إلى ذلك، يقيم الإنزيم هضم الغذاء عادة في غضون 60 دقيقة، وفقط مناسبة للتحقيق في المدى القصير تغذية السلوك24،28. وعلاوة على ذلك، عوامل داخلية وخارجية متعددة، مثل النمط الوراثي17،17من الجنسين، تزاوج الدولة17، تربية كثافة30وإيقاع سيركاديان31،32و نوعية الأغذية3 , 8 , 16، تأثير تناول الطعام. ولذلك، قد تحتاج مدة الرضاعة تعديلها وفقا لظروف تجريبية محددة. إلى جانب تسهيل التحديد الكمي لتناول الطعام، كما تستخدم ألوان الطعام لتقييم الأغذية الخيارات2،،من1927، وتصور غضروف في ميكروكابيلاري في مقهى المقايسة12.
وهنا، نقدم تلاعب بروتوكول جنبا إلى جنب لنشاط الخلايا العصبية مع نهج صبغ العلامات. هذه الاستراتيجية قد أثبتت جدواها في دراستنا الجينوم على تغذية التحكم في ذبابة الفاكهة الكبار24. يسمح أسلوب التهديف البصرية لإجراء تقدير سريع لاستهلاك الأغذية؛ وهكذا، أنها مفيدة للفحص من خلال عدد كبير من السلالات في الوقت مناسب. ثم يتم تحليل المرشحين من الشاشة بالتفصيل باستخدام أسلوب قياس ألوان لتقديم الهدف وتحديد كمي دقيق في دراسة إضافية.
وإلى جانب فحوصات التغذية، يصف لنا أيضا أساليب36 ثيرموجينيتيك27،35 وأوبتوجينيتيك34،33،لتنشيط الخلايا العصبية المستهدفة في المورفولوجيةقسراً. لتنشيط الخلايا العصبية التي ثيرموجينيتيك عملية بسيطة ومريحة مع المورفولوجية عابر مستقبلات محتملة أنكيرين 1 (dTRPA1)، وهي قناة الأيونات الموجبة عن طريق بوابة درجة الحرارة والجهد الذي يزيد من استثارة الخلايا العصبية عند المحيطة ترتفع درجة الحرارة 23 درجة مئوية33،37؛ ومع ذلك، اختبار الحيوانات في درجات حرارة عالية قد ينتج آثار سلبية على السلوك. تستخدم نهج فعال آخر لتنشيط الخلايا العصبية في المورفولوجية أوبتوجينيتيكس مع كشريمسون36، هو البديل الأحمر تحول من تشانيلرهودوبسين التي تزيد من استثارة الخلايا العصبية عند التعرض للضوء. ويقدم أوبتوجينيتيكس أعلى الأزمنة واضطرابات أقل للسلوكيات من ثيرموجينيتيكس. الجمع بين قياس كمي لتناول الطعام مع التلاعب بنشاط الخلايا العصبية تمثل نهجاً فعالاً لدراسة الآليات العصبية للتغذية.
يصف لنا بالتفصيل إعداد دائرة التغذية والذباب لفحصها. استخدام الذباب Taotie-Gal4 ك نموذج24، يصف لنا تفعيل الخلايا العصبية التي ثيرموجينيتيكس وأوبتوجينيتيكس. كما يتم وصف فحوصات اثنين للتحديد الكمي للاستهلاك الغذائي مع الغذاء صبغ المسمى في البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد دائرة التغذية
ملاحظة: دائرة التغذية للمقايسة تغذية وسم صبغ يتكون من جزئين: الحاوية الخارجي (كغطاء) والداخل الحاوية (كمصدر للغذاء).
- تعديل خارج الحاوية من قنينة زجاج لاستزراع المورفولوجية (قطرها داخلي 31.8 مم) وارتفاع 80 مم (الشكل 1A، ج 1). تغطية الجزء السفلي من الحاوية بطبقة من 1% [اغروس] (5 مل) للحفاظ إعداد التغذية بشكل صحيح هوميديفيد وتكون بمثابة ركيزة لينة للذباب السير عليها (الشكل 1B). وبالتالي يوفر الحاوية إعداد الخاضعة للرقابة ولكن طبيعي يحمل مع حد أدنى من الإجهاد أو اضطرابات للذباب.
- إعداد خارج الحاوية. تعليق ز 0.5 من [اغروس] في 50 مل ماء المقطر مزدوجة، الحرارة مع الانفعالات المتكررة، وغلى حل تماما في محرض مغناطيسي مع لوحة حرارة.
- عندما يبرد [اغروس] 1% إلى حوالي 60 درجة مئوية، بنقل 5 مل من 1% [اغروس] إلى فارغة خارج الحاوية (الشكل 1B)، والسماح للحاوية تبقى مفتوحة حتى يبرد لدرجة حرارة الغرفة تسفر عن جهاز pad [اغروس].
- إعداد الطعام المسمى صبغ. ويختلف تكوين الغذاء صبغ المسمى وفقا لأغراض تجريبية مختلفة. هنا مثال على إعداد الطعام المسمى صبغة تحتوي على السكروز فقط.
- إضافة 0.5 غرام من [اغروس] إلى 50 مل ماء المقطر مزدوجة، الحرارة مع الانفعالات المتكررة، وغلى حل تماما في محرض مغناطيسي مع لوحة حرارة.
- عندما يبرد أعلاه 1% [اغروس] إلى حوالي 60 درجة مئوية، إضافة ز 1.71 السكروز إلى [اغروس] للحصول على السكروز 100 مم.
- إضافة 0.25 غرام صبغة الزرقاء (ثنائي اريوجلوسيني) إلى الحل [اغروس] للحصول على الغذاء المسمى صبغ 0.5% (w/v).
- إعداد الداخل الحاوية. وضعت داخل حاويات الفارغة على سطح مسطح أفقي، ثم إضافة 750 ميليلتر الطعام الأزرق المسمى صبغ إلى حاوية الغذائية الفردية، وليكن يصلب لمدة 5 دقائق على الأقل.
ملاحظة: الداخل الحاوية طبق بلاستيكية صغيرة قطر داخلي 13.6 مم وارتفاع 7.5 مم (الشكل 1A، ج 1). أنه مليء بالطعام المسمى صبغ، وثم وضع في مركز لوح [اغروس] خارج الحاوية. - نقل شغلها داخل حاوية في حاوية خارج معدّة ووضعه في مركز لوح [اغروس]. السماح لدوائر التغذية تبقى مفتوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة حتى يتحرر من التكثيف الجدار خارج الحاوية.
ملاحظة: الجدار الجاف ضروري لمنع الذباب من تمسك يجري على الجدار عن طريق الاتصال بقطرات الماء. - إعداد دوائر تغذية مع أغذية خالية من صبغة (تكوين نفسه لكن من دون صبغ) للطرح الخلفية.
2-إعداد الذباب
ملاحظة: أنثى راشدة الذباب بعد اكلوسيون وعادة ما تستخدم لتغذية فحوصات يوم 5 إلى 10. من المستحسن إعداد الذباب من الأنماط الجينية المختلفة، بما في ذلك عناصر التحكم الوراثي، واختبار في نفس الوقت. توليد الذباب 20 (من دائرة التغذية واحدة) نقطة بيانات واحدة.
- تعتبر الكثافة السكانية لتربية الذباب الكبار. نموذجياً، التحكم في الكثافة السكانية بعدد الذباب الأبوية وفقا للضغوط وأبعاد زجاجات ثقافة مختلفة. على سبيل مثال، نقل 15 من الذكور والإناث 30 في كانتون-S باستخدام زجاجة ثقافة مع (قطره 31.8 مم) وارتفاع 80 مم وترك الإناث وضع البيض ليوم واحد ثم إزالة الذباب الكبار.
- إعداد الذباب لتنشيط ثيرموجينيتيك.
- استخدام نظام Gal4/UAS38 للتعبير عن dTRPA133 في الخلايا العصبية المختلفة بعبور الذباب UAS-dTrpA1 مع خطوط سائق GAL4 مختلفة (الشكل 2).
- يبقى الذباب الكبار في الغذاء القياسية 22 درجة مئوية، والرطوبة النسبية 60% ودورة ضوء الظلام ح 12/12 ساعة.
- يومين قبل تغذية الاعتداء، وفرز وجمع الذباب على لوح2 CO يطير تحت مجهر ستيريو إلى قنينة المواد غذائية طازجة والاحتفاظ بها بكثافة الذباب 20 لكل قنينة.
- إعداد الذباب لتنشيط أوبتوجينيتيك.
- استخدام نظام Gal4/UAS38 للتعبير عن كشريمسون36 في الخلايا العصبية المختلفة بعبور الذباب UAS-كشريمسون مع GAL4 برنامج تشغيل خطوط مختلفة.
- جمع حديثا من الذباب اكلوسيد (في غضون 24 ساعة) وتحويلها إلى قنينة مع الغذاء القياسية التي تحتوي على 400 ميكرون كل-ترانس-الشبكية.
- لمنع التنشيط سابقا لأوانه والتفاف قارورة تربية مع رقائق الألومنيوم وثم وضعها في مربع الظلام لحماية الذباب من التحفيز الخفيفة غير المرغوب فيها. يبقى الذباب عند 25 درجة مئوية، الرطوبة 60% في الظلام لمدة 4-6 أيام.
- يومين قبل الفحص التغذية، فرز أنثى الذباب على CO2 لوحة يطير تحت مجهر ستيريو. جمع الذباب 20 إلى فيال واحد من الطعام والاحتفاظ بها في الظلام قبل اختبار التغذية.
- إجراء جميع العمليات تحت ضوء خافت، في أسرع وقت ممكن لتجنب الآثار الناجمة عن الإضاءة المحيطة. استخدام مصباح LED توضع بعيداً عن منطقة العمل، والكثافة في منطقة عمل 5 µW/سم2.
ملاحظة: استخدام التجويع S كانتون الذباب كعنصر إيجابي للمقايسة التغذية. تحرم هذه الذباب من الطعام والحفاظ على 1% [اغروس] ل 24 ساعة قبل الاختبار التغذية. مستويات استهلاك الأغذية من الذباب هذه المساعدة في تقييم التقلبات اليومية.
3-تنشيط ثيرموجينيتيك
- إجراء تجارب تغذية جميع في نفس الوقت من اليوم، وحول زيتجيبير الوقت 4-631،32، للتقليل من الاختلافات بسبب إيقاعات سيركاديان.
- إعداد حاضنة (أو غرفة صغيرة مع التحكم في درجة حرارة سخان) كالبيئة التدفئة.
- قبل التجارب السلوكية، وحجته دوائر التغذية مستعدة عند درجة حرارة التجريبية (30 درجة مئوية) ح 2 للتأكد من درجة حرارة موحدة النسبية في دائرة التغذية.
- لبدء تشغيل عملية التغذية، بعناية نقل الذباب 20 من قنينة بهم المنزل إلى غرفة تغذية مسخن بالتنصت على لطيف. تستمر عملية التغذية عند 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ( الشكل 3A) .
ملاحظة: الثورات المتكررة، مثل فتح وإغلاق الباب حاضنة، تؤثر سلبا على سلوك التغذية، وبالتالي ينبغي تدنية. - الكف عن التغذية في 60 دقيقة بتجميد دوائر التغذية في-80 درجة مئوية (أو-20 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: تجميد يساعد على وقف اﻹطعام في جميع الدوائر في نفس الوقت. تجميد الذباب في-80 درجة مئوية يخدم غرضين، يوثانيزينج الذباب والتخزين حتى التجانس لمدة تصل إلى أسبوع واحد. - لمجموعة مراقبة درجة الحرارة، نقل الذباب 20 في درجة حرارة الغرفة تغذية الدائرة مع الصبغ الملون الغذائي لبدء عملية التغذية عند 22 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- وقف تغذية مجموعة مراقبة درجة الحرارة بتجميد الدوائر في-80 درجة مئوية (أو-20 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
4-أوبتوجينيتيك التنشيط
- إجراء تجارب تغذية جميع في نفس الوقت من اليوم، وحول زيتجيبير الوقت 4-631،32، للتقليل من الاختلافات بسبب إيقاعات سيركاديان.
- نقل بعناية الذباب 20 من قنينة واحدة في دائرة تغذية عن طريق التنصت لطيف، ومن ثم وضع قاعة جانبية على الإعداد الإضاءة (الشكل 4A, 4B).
- للتلاعب في أوبتوجينيتيك باستخدام صفيف مصابيح البرتقالي (607 nm) كمصدر لتحفيز الخفيفة، وإصلاح لوحة شبكي أفقية أعلاه المصابيح لدعم تغذية الدوائر خلال الإضاءة. الاحتفاظ الإعداد في حاضنة عند 25 درجة مئوية مع رطوبة 60% (الشكل 4A, 4B).
- حفز الذباب التحكم الوراثي بالتوازي مع Taotie > كشريمسون الذباب، ولكن التغذية في مختلف الدوائر.
- تستمر عملية التغذية لمدة 60 دقيقة مع الإضاءة الخلفية باللون البرتقالي الخفيفة.
- تحديد كثافة الإضاءة الأمثل أوبتوجينيتيكس تجريبيا36. Taotie > كشريمسون الذباب وشدتها من 2.2 ميغاواط/مم2 يستحث الشلل (وقف الحركة) وفقدان السيطرة الوضعي، ولذلك، تستخدم كثافة متوسطة من 0.1 ميغاواط/مم2 إلى حفز Taotie > كشريمسون الذباب أثناء اختبار التغذية.
- وقف تغذية قبل تجميد دوائر التغذية في-80 درجة مئوية (أو-20 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
5-البصرية تقدير استهلاك الأغذية
ملاحظة: ويوفر نهج التسجيل المرئي تقدير شبه كمي لاستهلاكها الغذائي. على الرغم من أنها ليست موضوعية كأسلوب البصرية، يسمح هذا الأسلوب للذهاب من خلال عدد كبير من سلالات يطير في الوقت مناسب، يجعلها مناسبة للأول جولة من شاشة الوراثية بسرعة تضييق قائمة المرشحين لإجراء مزيد من التجارب.
- بعد عملية التغذية، تخدير ونقاط الذباب على أول أكسيد الكربون2 لوحة يطير تحت مجهر ستيريو. إعطاء نقاط الفردية لكل الطيران استناداً إلى حجم وكثافة الغذاء الصبغ الملون في البطن (الشكل 2A).
ملاحظة: معايير لتقدير البصرية: نقاط النظام يحتوي على 4 مستويات لتناول الطعام المقابلة لوحدات التخزين المختلفة وكثافة المواد الغذائية الملونة في البطن.- نقاط الذباب دون كشفها الصبغ الملون الغذائي برصيد 0؛ تعطي تلك الصبغة الزرقاء (بالكاد يمكن كشفها) باهتة أو مع الغذاء صبغ لون الاحتلال أقل من ثلث حجم البطن نقاط 1.
- نقاط الذباب مع الغذاء صبغ لون مكثفة الاحتلال من البطن نصف عدد نقاط 2.
- نقاط تلك مع الاحتلال المحتوى مصبوغ مكثفة أكثر من نصف البطن نقاط 3 (الشكل 2A).
- حساب نسبة الذباب بدرجات مختلفة في كل حالة تجريبية (الشكل 2).
6-قياس ألوان التحديد الكمي للاستهلاك الغذائي
- بعد وقف التغذية، صب جميع الذباب 20 من التغذية الدائرة على قطعة من وزن الورق، ثم تحويلها إلى أنبوب 1.5 مل باستخدام فرشاة ناعمة.
ملاحظة: لا تأخذ كل الدوائر خارج مخزن-80 درجة مئوية في نفس الوقت لتجنب الذباب تتمسك بالجدار الدائرة بسبب مياه التكثيف في غرفة باردة. - إضافة 500 ميليلتر من ببست للأنبوب وتجانسه الذباب باستخدام مطحنة طحن عند تردد 60 هرتز ل 5 s.
- تأكيد التجانس كافية بالمراقبة عندما تكون هناك لا الأجزاء القابلة للاكتشاف من أجزاء الجسم.
- وتدور هذه الأنابيب مع هوموجيناتيس لمدة 30 دقيقة 13,000 لفة في الدقيقة لإزالة الأنقاض.
- بعد الطرد المركزي، بنقل 100 ميليلتر من المادة طافية إلى بئر صفيحة 96-جيدا.
- بعد أن يتم تحميل جميع العينات ووضع اللوحة في قارئ لوحة لقياس امتصاص عينات في 630 نيوتن متر.
- لإزالة امتصاص الخلفية، طرح امتصاص supernatants من الذباب يتغذى على الغذاء دون صبغ من امتصاص للمادة طافية من الذباب الأزرق التي تغذيها الغذاء.
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية، اعتماداً على تركيبة من المواد الغذائية المستخدمة. عندما يولد غذاء ذبابة (بدون الصبغ) امتصاص في 630 شمال البحر الأبيض المتوسط، من الضروري القيام بهذه الخطوة للقضاء على الخلفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشاشة ثيرموجينيتيك.
عادي زيادة الشهية الأسباب تناول الطعام مرتفعة، بغض النظر عن الاحتياجات الفسيولوجية. نحن استخدام هذا المخطط لتصميم الفائق الشاشة السلوكية للحصول على مقابض الوراثية للخلايا العصبية ذات الصلة بالجوع والإشباع الدول (الشكل 1). الشاشة أثمر Taotie-Gal424. عندما تم تنشيط الخلايا العصبية Taotie Gal4 قسراً عند 30 درجة مئوية، Taotie > TrpA1 الذباب بلعها كميات أكبر من المواد الغذائية من عناصر التحكم (الشكل 2و الشكل 3).
بصريا وسجل استهلاك الأغذية.
لأنه تم إبلاغ بعض أجهزة الإرسال العصبية و neuropeptides في تنظيم تغذية السلوك، لدينا اختبار خطوط GAL4 المقابلة، بما في ذلك صندوق التوفير الوطني20, توها39, أوكتوباميني21, الدوبامين27، 40و41،السيروتونين42، اكة35، و Dilp27،،من835. لتحديد حجم الاستجابة التغذية، نحن بصريا فتشت وسجل الذباب مع كميات مختلفة من صبغة يمكن اكتشافها في القناة الهضمية (الشكل 2A). بعد تنشيط الخلايا العصبية Taotie ، حوالي 58 في المائة من Taotie > dTrpA1 الذباب معارضها سلوكيات التغذية القوية، ونسبة 23% من هذه السلوكيات تغذية خفيف يبين (الشكل 2). على النقيض من ذلك، لوحظت سلوكيات التغذية هامشية فقط في الذباب مع الخلايا العصبية الأخرى تنشيط عن طريق dTrpA1 (الشكل 2).
قياس الألوان الكمي لتناول الطعام.
للتحديد الكمي لتناول الطعام مع عالية الدقة والموضوعية، قمنا بقياس امتصاص لاستخراج يطير على طول موجي معين لصبغ المضافة في الأغذية2،،من2728. الربط بين قيمة امتصاص حجم الحصة الغذائية، تم الحصول على منحنى قياسي عن طريق قياس امتصاص من عينة حلول (نفس المخزن المؤقت للمجانسة الذباب، ببست) مختلطة مع كميات مختلفة من الأصباغ). كما تدل على ذلك النتائج التي توصلنا إليها، الحاد تنشيط الخلايا العصبية Taotie-GAL4 طريق TRPA1 تناول الطعام زيادة كبيرة مقارنة مع التحكم الوراثي، والتحكم في درجة الحرارة أثناء فترة الاختبار نفسه (الشكل 3B)، مما يوحي بأن Taotie-GAL4 الخلايا العصبية المسماة المشاركة في تنظيم تناول الطعام للكبار المورفولوجية.
تفعيل أوبتوجينيتيك لتشجيع تناول الطعام في المورفولوجية.
كنا UAS-كشريمسون لتنشيط الخلايا العصبية Taotie بالإضاءة اللون برتقالي خفيفة36 (الشكل 4A, 4B). عندما Taotie > كشريمسون الذباب كانت تحفزها مصابيح LED في 607 شمال البحر الأبيض المتوسط، التي تناولها الغذاء أكثر بكثير من عناصر التحكم (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، يرتبط الكميات من المواد الغذائية المستهلكة جيدا مع كثافة الضوء التحفيز (الشكل 4). وهكذا، بالإضافة إلى ثيرموجينيتيكس مع dTrpA1، يعزز تنشيط أوبتوجينيتيك مع كشريمسون في الخلايا العصبية Taotie أيضا الدافع التغذية في الإشباع الذباب.
الشكل 1 . نموذج تغذية لتحليل الشهية في الذباب الكبار- (أ) تغذية الدائرة يتضمن داخل حاوية مليئة بصبغ لون الغذاء وحاوية خارج مبطن مع 1% [اغروس]. من اليسار إلى اليمين، الداخل الحاوية والحاوية خارج دائرة تغذية كاملة. (ب) الداخل حاوية يجلس على أعلى لوحة المفاتيح [اغروس] في الجزء السفلي من خارج الحاوية. (ج) عرض أعلى لدائرة التغذية. (د) التخطيطي تبين التجربة "شهية الشاشة". الذباب الإشباع الطبيعي نادراً ما يأكلون الطعام (قنينة الأيسر)، بينما قسراً تفعيل بعض الخلايا العصبية مراقبة التغذية بسبب الذباب الإشباع استيعاب غذائية إضافية، وبالتالي نستعرض الصبغ الملون الغذائي في البطن (قنينة الحق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . تقدير البصرية من ابتلاع الغذاء. صور أنموذج (A) لإظهار المعايير للتهديف المحتوى الغذائي في البطن. (ب) توزيع التغذية عشرات في الذباب مع الخلايا العصبية المشار إليه يتم تفعيلها من خلال dTrpA1 في 30 درجة مئوية. لا-Gal4: UAS-dTrpA1 (التحكم الوراثي)؛ صندوق التوفير الوطني-GAL4: نيوروبيبتيدي و الخلايا العصبية الإيجابية؛ توها GAL4: قصيرة نيوروبيبتيدي و الخلايا العصبية الإيجابية؛ TDC1-GAL4 و TDC2-GAL4: أوكتوباميني الخلايا العصبية؛ ث-GAL4: الدوبامين من الخلايا العصبية؛ 5-HT: الخلايا العصبية السيروتونين؛ اكة: هرمون أديبوكينيتيك العصبية الإيجابية؛ dip2: مثل الأنسولين الببتيد 2 الخلايا العصبية الإيجابية؛ Taotie-GAL4: Taotie GAL4 تسميات الخلايا العصبية (n = 120 الذباب كل حالة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . ثيرموجينيتيك--تنشيط الخلايا العصبية Taotie يزيد استهلاك الغذاء في الذباب الكبار- (أ) صورة يظهر الإعداد لتجربة التنشيط ثيرموجينيتيك. وأجرى اختبار التغذية في حاضنة في 30 درجة مئوية. (ب) اختبار استهلاك الغذاء بالقياس الكمي اللونية في الذباب الإشباع في 30 درجة مئوية أو 22 درجة مئوية ح 1. تم حساب كمية الاستهلاك الغذائي من ذبابة واحدة من أن الذباب 20 في دائرة التغذية واحدة (n = 6). يشير إلى نوفاسكوتيا لا يعتد (p > 0.05)؛ ف < 0.001. واستخدمت أحادي الاتجاه ANOVA اتباعها مع اختبار توكي الوظائف المخصصة لتحليل مقارنات متعددة. أشرطة الخطأ تشير إلى متوسط ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . أوبتوجينيتيك--تنشيط الخلايا العصبية Taotie يزيد من كمية تناول الطعام بطريقة تعتمد على كثافة. (أ وب) طريقتي للإعداد لتفعيل أوبتوجينيتيك. دوائر التغذية زرعت جانبية على لوحة داعمة ومضاءة من الأسفل مجموعة الأضواء البرتقالية. تمت إزالة الجانب الأمامي من مربع الإضاءة لإظهار الداخل المصابيح. وأجريت التجارب السلوكية داخل حاضنة في 25 درجة مئوية، ورطوبة نسبية 60%. (ج) الاستهلاك الغذائي من الذباب الإشباع من الأنماط الجينية المشار إليها عند اختبارها تحت إضاءة أوبتوجينيتيك أو في الظلام ح 1 (n = 6). (د) المواد الغذائية الابتلاع الإشباع Taotie > كشريمسون الذباب كان يرتبط بشدة الإضاءة (ن = 6). يشير إلى نوفاسكوتيا لا يعتد (p > 0.05)؛ ف < 0.001، استخدمت أحادي الاتجاه ANOVA اتباعها مع اختبار توكي الوظائف المخصصة لتحليل مقارنات متعددة، الطالب t-اختبار لاثنين مجموعة مقارنات. أشرطة الخطأ تشير إلى متوسط ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويركز هذا التقرير على عملية وسم صبغ فحوصات التغذية لاستهلاك الأغذية في السياق ثيرموجينيتيك التقنية وتفعيل أوبتوجينيتيك للتلاعب بالخلايا العصبية مراقبة التغذية. سيساعد هذا البروتوكول بسيطة ويمكن الاعتماد عليها توضيح وظيفة الخلايا العصبية المرشح في تغذية التحكم، لقياس تفضيل الأغذية من الذباب، وتحديد اللاعبين الرواية في دوائر مراقبة التغذية عبر الشاشات الوراثية على أساس التغذية24.
من الممكن صبغة وصفها استراتيجية في التحقيق في سلوكيات التغذية قصيرة الأجل. الصباغة، ثنائي اريوجلوسيني، حلت في وتناولها مع الطعام، مؤشر حاسم للاستهلاك الغذائي. أظهر ديشباندي et al. أن الصبغة الزرقاء نفسها تبين أي تأثير على الرضاعة عندما تقاس بمقايسة مقهى والنظائر المشعة وسم المقايسة المدخول الغذائي17. وبالمثل، النتائج التي توصلنا إليها في (حفز الساق الطاير مع محلول السكروز المسمى صبغة أو صبغ خالية 100 ملم) أشارت إلى أن الذباب معروضة لا يوجد فرق كبير في استجابتها تجاه الطعام المسمى صبغ أو خالية من الصبغة. ومع ذلك، لا تزال هناك أية بيانات واضحة بشأن ما إذا كان يتم الصبغ المذاق في المورفولوجية.
إلى جانب ذلك ذكر الخطوات الحاسمة في البروتوكول، وإيلاء عناية خاصة للعام حالة الذباب لفحصها. بالإضافة إلى تربيتها والحفاظ على كثافة غير مكتظة، الذباب ينبغي التعامل معها برفق، وتجنب الصدمات غير ضرورية أو تشدد، من أجل إنتاج نتائج التغذية متسقة.
نموذج التغذية المقدمة هنا على بعض القيود. أولاً، لدينا أساليب قياس استهلاك الغذاء لفترة 60 دقيقة. تقييم المتحصلات الغذائية على مدى فترات أطول، مثل يوم، يتطلب أسلوباً مختلفاً، مثل مقهى،. ثانيا، بالمقارنة مع أساليب القياس الكمي باستخدام النظائر المشعة، أسلوب قياس الألوان أقل حساسة وصعبة لحل الخلافات عندما تنخفض كميات الاستهلاك الغذائي. ثالثا، وبالنظر إلى أن بعض الذباب ستبدأ الاضطلاع بأقرب وقت 15 دقيقة بعد بدء الرضاعة، هذا البروتوكول فعلا تدابير النتيجة الصافية لتناول الطعام وإفراز في سكان17. رابعا، كان التحديد الكمي اللونية لتناول الطعام الموصوف هنا لمجموعة يطير، تقدير الغذاء ابتلاع ذبابة واحدة يعتمد على فحوصات التغذية الأخرى، مثل وضع العلامات النظائر المشعة، والفحص ̯͡، أو فليباد. ومع ذلك، تجعل من مزايا معينة للتقدير الكمي اللونية لتناول الطعام، مثل أسلوب بسيط ومستقر، والمرئية، والفائق، ويجري اختيار رئيس الوزراء للتحديد الكمي لعدد كبير من سلالات، خاصة بالنسبة للقائم على تغذية الوراثية شاشات ودراسات المتابعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
هذا العمل كان تدعمها جزئيا الوطنية الأساسية البحث البرنامج الصيني (2012CB825504)، الوطنية الطبيعية مؤسسة العلوم الصينية (91232720 و 9163210042)، والأكاديمية الصينية للعلوم () (GJHZ201302 وقيزدي-شمال-SMC015)، بيل وميليندا غيتس برنامج مؤسسة (OPP1119434)، و 100-مواهب من الأكاديمية الصينية للعلوم أن تشو Y..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels - Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
