Summary
Quantitative Nahrungsaufnahme Assays mit gefärbten Lebensmittel bieten eine robuste und Hochdurchsatz-Mittel zur Fütterung Motivation zu bewerten. Kombination des Lebensmittel Verbrauch Tests mit thermogenetischen und optogenetische Bildschirme ist ein leistungsfähiger Ansatz zu untersuchen, die neuronale Schaltkreise, die zugrunde liegenden Appetit bei Erwachsenen Drosophila Melanogaster.
Abstract
Verzehr von Lebensmitteln ist unter strenge Kontrolle des Gehirns, die die physiologischen Zustand, Schmackhaftigkeit und Ernährung Inhalt der Ernährungs- und Themen-Befehle zum Starten und stoppen Fütterung integriert. Entschlüsseln die Verfahren für die Beschlussfassung rechtzeitig und moderate Hauptimplikationen trägt in unserem Verständnis der physiologischen und psychologischen Erkrankungen im Zusammenhang mit der Kontrolle Fütterung Fütterung. Robustere, einfach und quantitative Methoden sind erforderlich, um die Nahrungsaufnahme der Tiere nach experimentelle Manipulation, wie die zwangsweise Erhöhung der Aktivitäten von bestimmten Ziel-Neuronen zu messen. Hier führten wir ein Farbstoff-Kennzeichnung-basierte Fütterung Assays zur Erleichterung die neurogenetic Studie der Fütterung Kontrolle bei Erwachsenen Fruchtfliegen. Wir überprüfen zur Verfügung Fütterung Assays, und dann beschreiben unsere Methoden Schritt für Schritt von Setup zur Analyse, die thermogenetischen kombinieren und optogenetische Manipulation von Neuronen Steuern Fütterung Motivation mit Farbstoff-markierten Lebensmittel Aufnahme Assay. Wir diskutieren auch die Vorzüge und Grenzen unserer Methoden, im Vergleich zu anderen Fütterung Assays, wählen Sie einen entsprechenden Assay Lesern helfen.
Introduction
Die Menge der aufgenommenen Nahrung die Quantifizierung ist wichtig für die Bewertung mehrere Aspekte der Steuerung durch das Gehirn reagiert auf die internen Bedürfnisse (z. B. Hunger Staaten) und externe Faktoren (z. B. Lebensmittelqualität und Schmackhaftigkeit)1, Fütterung 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. in den letzten Jahren die Bemühungen der Entzifferung der neurale Substrate der Fütterung Kontrolle in Drosophila führen zu die Entwicklung von mehreren Assays direkt die Menge der aufgenommenen Nahrung zu quantifizieren oder dienen als Indikator für die Fütterung von Motivation 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
Die Kapillare Einzug (CAFE) Assay12,13 wurde entwickelt, um die Menge des Konsums von flüssigen Lebensmitteln in ein Glas Microcapillary zu messen. Die CAFE-Assay ist sehr empfindlich und reproduzierbare17 und vereinfacht die Messung der Verzehr von Lebensmitteln, vor allem zur Quantifizierung der langfristige Fütterung18. Dieser Test erfordert jedoch die fliegen an der Spitze der Microcapillary Klettern und füttern verkehrt, die eignet sich nicht für alle Stämme. Zusätzlich, da die fliegen, mit CAFE-Assay getestet werden auf flüssige Nahrung aufgezogen werden müssen, bleibt die Wirkung dieser Aufzuchtsbedingungen auf Stoffwechsel-Status oder die möglichen Unterernährung ermittelt werden.
Der Rüssel Erweiterung Antwort (PER) Assay11,14 zählt die Häufigkeit der Rüssel Erweiterung Antworten auf sanfte Berührungen von Lebensmittel Tropfen. PRO Test erwies sich als eine hervorragende Möglichkeit, bewerten Fütterung Motivation der einzelnen Fliege und Esel den Einfluss der Schmackhaftigkeit und Inhalt der Nahrung18,19. Es ist jedoch keine direkte Quantifizierung der Einnahme-Menge.
Vor kurzem wurde ein halbautomatisches Verfahren, die manuelle Zuführung Assay (MAFE)15, entwickelt. In MAFE wird eine Fliege immobilisierte manuell mit einem Microcapillary mit Essen zugeführt. Angesichts der Tatsache, dass Rüssel Erweiterung Antworten und Verzehr von Lebensmitteln gleichzeitig überwacht werden können, eignet sich MAFE für die Beurteilung der Nährwerte und die Auswirkungen der pharmakologischen Manipulation. Jedoch könnte eine Fliege Immobilisierung seine Verhaltensstörungen Leistung, einschließlich Fütterung beeinträchtigen.
Darüber hinaus fliegen Rüssel und Aktivität-Detektor (FlyPAD)10 wurde entwickelt, um automatisch Fressverhalten zu quantifizieren. Mit Machine Vision Methoden zeichnet FlyPAD physikalische Wechselwirkungen zwischen einer Fliege und Lebensmittel, die Häufigkeit und Dauer der Rüssel Erweiterungen als Indikator der Fütterung Motivation zu quantifizieren. FlyPAD bietet ein Hochdurchsatz-Ansatz für die Fütterungen Verhalten einer frei beweglichen Fliege zu überwachen, wenn auch die Empfindlichkeit und die Robustheit dieses Systems noch mehr weiter bestätigt werden12Studien.
Kennzeichnung Strategien werden häufig verwendet, um Nahrungsaufnahme fliegen zu schätzen. Es ist üblich, beschriften Sie Lebensmittel mit chemischen Tracer und nach der Fütterung, Messen Sie die Menge des aufgenommenen Tracer, die Menge der Nahrungsaufnahme zu berechnen. Radioaktiver Tracer16,17,20,21,22,23,24,25 ermöglichen die Erkennung durch die Kutikula ohne Homogenisierung der fliegen. Diese Methode bietet bemerkenswert geringe Variabilität und hohe Empfindlichkeit18und ist für Langzeit-Studie der Nahrungsaufnahme möglich. Allerdings sollte die Verfügbarkeit von nutzbaren Radioisotopen und verschiedene Sätze von Absorption und Ausscheidung berücksichtigt werden bei der Arbeit mit dieser Assay.
Kennzeichnung und Rückverfolgung Nahrungsaufnahme mit ungiftige Lebensmittelfarben ist eine sicherere und einfachere alternative2,3,26,27,28. Fliegen werden nach der Fütterung mit Lebensmitteln, die nicht resorbierbaren und lösliche Farbstoffe homogenisiert und die Menge des aufgenommenen Farbstoffs ist später quantifiziert mit einem Spektrophotometer3,24,28,29 . Die Kennzeichnung Strategie ist einfach durchzuführen und bietet eine hohe Effizienz, aber mit einer Einschränkung. Das Volumen der Nahrungsaufnahme geschätzt aus den aufgenommenen Farbstoff ist kleiner als das tatsächliche Volumen weil Ausscheidung bereits 15 Minuten beginnt nach dem Fliegen fressen17. Darüber hinaus bewertet der Assay Nahrungsaufnahme in der Regel binnen 60 Minuten, die nur geeignet für die Untersuchung von kurzfristigen Fütterung Verhalten24,28. Darüber hinaus mehrere interne und externe Faktoren, wie z. B. Genotyp17, Geschlecht17, Stand17, Aufzucht, Dichte30, zirkadianen Rhythmus31,32und Lebensmittel Qualität3 gedeckt , 8 , 16, Einfluss Nahrungsaufnahme. Daher müssen die Fütterung Dauer nach bestimmten experimentellen Bedingungen angepasst werden. Neben die Quantifizierung der Nahrungsaufnahme zu erleichtern, dienen Lebensmittelfarben, Essen Auswahl2,19,27zu bewerten und den Meniskus in einer Microcapillary im CAFE Assay12zu visualisieren.
Hier stellen wir eine Protokoll kombiniert Manipulation von neuronaler Aktivität mit Farbstoff-labeling-Ansatz. Diese Strategie ist in unserer neurogenetic Studie zur Fütterung Kontrolle in Erwachsenen Fruchtfliegen24nützlich erwiesen. Die visuelle scoring-Methode ermöglicht eine schnelle Einschätzung der Verzehr von Lebensmitteln; Daher ist es sinnvoll für das Screening durch eine große Anzahl von Stämmen in einer zeitgemäßen Weise. Die Kandidaten vom Bildschirm werden dann im Detail mit einer kolorimetrischen Verfahren bieten Objektive und präzise Quantifizierung in zusätzliche Studie analysiert.
Neben der Fütterung Assays erläutern wir im folgenden die thermogenetischen27,33,34,35 optogenetische36 Methoden und Ziel Neuronen in Drosophilagewaltsam zu aktivieren. Neuronen von thermogenetischen aktivieren Bedienung ist einfach und bequem mit Drosophila Transienten Rezeptor potenzielle Ankyrin-Repeat-(AR)-1 (dTRPA1), die eine Temperatur und Spannung-gated kation Kanal, die neuronale Erregbarkeit erhöht wenn die Umgebungstemperatur Temperatur steigt über 23 ° C33,37; jedoch könnte die Tiere bei hohen Temperaturen beim Testen nachteilige Auswirkungen auf Verhalten erstellt. Ein weiteres effektiver Ansatz zur Aktivierung von Neuronen in Drosophila nutzt optogenetik mit CsChrimson36, das ist eine rot-verschoben Variante des Channelrhodopsin, das erhöht die Erregbarkeit der Neuronen bei Lichteinfall. Optogenetik bietet höhere zeitliche Auflösung und weniger Störungen für Verhaltensweisen als Thermogenetics. Die quantitative Messung der Nahrungsaufnahme mit der Manipulation von neuronaler Aktivität zu verbinden, stellt einen effektiven Ansatz zur Erforschung der neuronalen Mechanismen der Fütterung.
Wir beschreiben ausführlich die Vorbereitung der Füllraum und die fliegen getestet werden. Mit Taotie-Gal4 fliegen als ein Modell24, beschreiben wir aktivierende Neuronen durch Thermogenetics und optogenetik. Zwei Tests der Quantifizierung der Verzehr von Lebensmitteln mit Farbstoff-markierten Lebensmittel werden ebenfalls im Protokoll beschrieben.
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Protocol
1. Vorbereitung der füllraum
Hinweis: Der Füllraum für Farbstoff-Kennzeichnung Fütterung Assay besteht aus zwei Teilen: der Außen Container (als Deckel) und innen Container (als Nahrungsquelle).
- Ändern den außen Container von einem Glasfläschchen für die Kultivierung von Drosophila mit (einem Innendurchmesser von 31,8 mm) und einer Höhe von 80 mm (Abb. 1A, 1 C). Abdeckung der Unterseite des Behälters mit einer Schicht von 1 % Agarose (5 mL) auf die Fütterung Setup ordnungsgemäß zu halten befeuchtet und dienen als weiche Substrat für die fliegen gehen auf (Abbildung 1 b). Der Container bietet damit eine kontrollierte aber naturalistische Einstellung mit minimalem Stress oder Störung, die fliegen.
- Bereiten Sie den äußeren Container. 0,5 g Agarose in 50 mL doppelt destilliertes Wasser, Wärme unter häufigen rühren, suspendieren und Kochen auf einem Magnetrührer mit einer Heizplatte vollständig auflösen.
- Wenn das 1 % Agarose kühlt auf ca. 60 ° C, 5 mL 1 % Agarose ein leeres außerhalb Containers (Abbildung 1 b), und lasse Sie den Container bleiben offen, bis auf Raumtemperatur bringen eine Agarose-Pad abgekühlt.
- Farbstoff-markierten Essen zubereiten. Zusammensetzung der Farbstoff-markierten Lebensmittel variiert je nach verschiedenen experimentellen Zwecken. Hier ist ein Beispiel der Vorbereitung der Farbstoff-markierten Lebensmittel enthalten nur Saccharose.
- 0,5 g Agarose in 50 mL doppelt destilliertem Wasser, Wärme unter häufigen Rühren hinzufügen und Kochen auf einen Magnetrührer mit einer Heizplatte vollständig auflösen.
- Wenn die oben genannten 1 % Agarose auf etwa 60 ° C abkühlt, fügen Sie 1,71 g Saccharose die Agarose, 100 mM Saccharose zu erhalten hinzu.
- Die Agarose-Lösung 0,5 % (w/V) Farbstoff-markierten Lebensmittel erhalten fügen Sie 0,25 g blauer Farbstoff (Erioglaucine binatrium hinzu).
- Bereiten Sie das innere Container. Setzen Sie die leere im Inneren von Behältern auf einer flachen Unterlage, dann 750 µL der blaue Farbstoff-markierten Lebensmittel an einzelne Lebensmittel-Container, lassen Sie es mindestens 5 min lang zu festigen.
Hinweis: Der innere Container ist eine kleine Plastikschale mit einem Innendurchmesser von 13,6 mm und einer Höhe von 7,5 mm (Abb. 1A, 1 C). Es ist gefüllt mit Farbstoff-markierten Essen und ist dann in der Mitte des Agarose-Pads des äußeren Containers positioniert. - Übertragen Sie einer gefüllten Container in eine vorbereitete außen Container und positionieren Sie es in der Mitte des Agarose-Pad. Lassen Sie die Fütterungen Kammern bei Raumtemperatur für 40 min geöffnet bleiben, bis die Wand des äußeren Containers frei von Kondensation ist.
Hinweis: Die Trockenmauer ist notwendig, um zu verhindern, dass die fliegen durch Kontaktaufnahme mit Wassertropfen an der Wand stecken. - Bereiten Sie Fütterung Kammern mit Farbstoff-freie Lebensmittel (gleiche Zusammensetzung aber ohne Farbstoff) für Hintergrundabzug.
2. Vorbereitung der fliegen
Hinweis: Erwachsenes Weibchen fliegt 5 bis 10 Tag nach bewegungsapparate dienen normalerweise zur Fütterung Assays. Es empfiehlt sich, fliegt der verschiedenen Genotypen, einschließlich genetischen Kontrollen vorzubereiten und parallel zu testen. 20 fliegen (von einem Füllraum) erzeugen einen Datenpunkt.
- Betrachten Sie die Bevölkerungsdichte für die Aufzucht von Erwachsener Flies. In der Regel steuern Sie die Bevölkerungsdichte durch Variation der Anzahl der Eltern fliegen nach den Strapazen und die Dimensionen von Kultur-Flaschen. Als Beispiel 15 Männer und 30 Frauen des Kantons-S eine kulturflasche mit (31,8 mm Durchmesser) und einer Höhe von 80 mm und lasse Sie die Weibchen legen von Eiern für einen Tag, dann entfernen Sie die Erwachsenen fliegen.
- Thermogenetischen Aktivierung fliegen vorbereiten.
- Verwenden Sie die Gal4/UAS-System38 dTRPA133 in verschiedenen Neuronen durch Kreuzung zum Ausdruck zu bringen, die FH-dTrpA1 mit verschiedenen GAL4 Fahrer Linien (Abb. 2 b) fliegt.
- Halten Sie die Erwachsenen fliegen auf standard-Food bei 22 ° C, 60 % relativer Luftfeuchtigkeit und einer 12 h/12 h Hell-Dunkel-Zyklus.
- Zwei Tage vor der Fütterung assay, Sortieren und fliegt auf eine CO2 fliegen Pad unter dem Stereo-Mikroskop in eine frische Lebensmittel Durchstechflasche zu sammeln und eine Dichte von 20 fliegen pro Fläschchen halten.
- Optogenetische Aktivierung fliegen vorbereiten.
- Verwenden Sie die Gal4/UAS-System38 CsChrimson36 in verschiedenen Nervenzellen durch Kreuzung UAS-CsChrimson fliegen mit verschiedenen GAL4 Fahrer Linien zum Ausdruck zu bringen.
- Neu sammeln Sie geschlüpften (innerhalb von 24 h) fliegen zu und übertragen Sie sie in ein Fläschchen mit standard-Food mit 400 µM All-Trans-Retinal.
- Zur Vermeidung von vorzeitigen Aktivierung der Aufzucht Fläschchen mit Alu-Folie wickeln und dann steckte sie in eine dunkle Kiste fliegen vor unerwünschten Lichtstimulation zu schützen. Halten Sie die fliegen bei 25 ° C, 60 % Luftfeuchtigkeit in der Dunkelheit für 4-6 Tage.
- Zwei Tage vor der Fütterung Assay fliegt Art weiblich auf CO2 fliegen Pad unter dem Stereo-Mikroskop. Sammeln Sie 20 fliegen in einem Lebensmittel Durchstechflasche und halten sie in der Dunkelheit vor der Fütterung Test.
- Führen Sie alle Operationen unter schwachem Licht so schnell wie möglich, die Auswirkungen durch Umgebungslicht zu vermeiden. Verwenden Sie eine LED-Lampe weit weg aus dem Arbeitsbereich platziert, die Intensität auf den Arbeitsbereich 5 µW/cm2.
Hinweis: Verwendung verhungert Kanton-S fliegt als Positivkontrolle für die Fütterung Assay. Diese fliegen von Lebensmitteln zu berauben und pflegen auf 1 % Agarose für 24 h vor der Fütterung Test. Die Ebenen der Nahrungsaufnahme dieser fliegen helfen die täglichen Schwankungen zu bewerten.
(3) thermogenetischen Aktivierung
- Führen Sie alle Fütterungsversuche zur gleichen Zeit des Tages, um Zeitgeber Zeit 4-631,32, um Abweichungen aufgrund zirkadianen Rhythmen zu minimieren.
- Inkubator (oder einen kleinen Raum mit einer Temperatur-kontrollierten Heizung) als die Heizung Umwelt vorbereiten.
- Vor Verhaltensexperimente equilibrate der vorbereiteten Fütterungen Kammern an die experimentelle Temperatur (30 ° C) für 2 h um sicherzustellen, dass die Temperatur relativ Uniform in den Füllraum ist.
- Um die Fütterung zu starten, übertragen Sie sorgfältig 20 fliegen aus ihrer Heimat Fläschchen in einem vorgeheizten Füllraum durch sanftes antippen. Fahren Sie fort, Fütterung bei 30 ° C für 60 min ( Abbildung 3A) .
Hinweis: Häufige Aufregungen, sollte wie z. B. Öffnen und Schließen der Tür Inkubator beeinträchtigen das Fressverhalten somit minimiert werden. - 30 min nicht mehr in der Fütterung bei 60 min durch das Einfrieren der Fütterungen Kammern bei-80 ° C (oder-20 ° C).
Hinweis: Einfrieren hilft, um Fütterungen in allen Kammern gleichzeitig zu stoppen. Fliegen bei-80 ° C Einfrieren dient zwei Zwecken, für die fliegen euthanizing und Einlagerung bis Homogenisierung bis zu einer Woche. - Übertragen Sie für die Kontrollgruppe Temperatur 20 fliegen in einer Fütterung Kammer mit Farbstoff gefärbte Lebensmittel mit der Fütterung beginnen bei 22 ° C für 60 min. Temperatur.
- 30 min nicht mehr in der Fütterung der Kontrollgruppe Temperatur durch das Einfrieren der Kammern bei-80 ° C (oder-20 ° C).
4. Optogenetische Aktivierung
- Führen Sie alle Fütterungsversuche zur gleichen Zeit des Tages, um Zeitgeber Zeit 4-631,32, um Abweichungen aufgrund zirkadianen Rhythmen zu minimieren.
- Sorgfältig 20 fliegen aus einem Fläschchen in einem Füllraum durch sanftes antippen, und setzen Sie dann die Kammer seitlich auf die Beleuchtung Setup (Abbildung 4A, 4 b).
- Für optogenetische Manipulation, verwenden Sie ein Array von orange LEDs (607 nm) als Quelle der Lichtstimulation und Fix eine horizontale Plexiglasplatte über die LEDs, die Fütterung unterstützen Kammern während der Beleuchtung. Halten Sie das Setup in einem Inkubator bei 25 ° C mit 60 % Luftfeuchtigkeit (Abbildung 4A, 4 b).
- Stimulieren die genetische Kontrolle fliegen parallel zu den Taotie > CsChrimson fliegt, aber füttern in verschiedenen Kammern.
- Fortfahren Sie der Fütterung für 60 min mit der hinteren Beleuchtung durch das Orange Licht.
- Bestimmen Sie die optimale Beleuchtung Intensitäten für optogenetik experimentell36. Für die Taotie > CsChrimson fliegen, eine Intensität von 2,2 mW/mm2 induziert Lähmung (Einstellung der Fortbewegung) und Verlust der posturalen Kontrolle daher, eine mittlere Intensität 0,1 mW/mm2 verwenden, um die Taotie stimulieren > CsChrimson fliegt während der Fütterung Test.
- 30 min nicht mehr in der Fütterung durch Einfrieren Fütterung Kammern bei-80 ° C (oder-20 ° C).
5. visuelle Einschätzung der Verzehr von Lebensmitteln
Hinweis: Die visuelle scoring Ansatz bietet eine semi-quantitative Abschätzung der Nahrung Verbrauch. Es ist, zwar nicht so objektiv wie die optische Methode ermöglicht diese Methode durchläuft eine große Anzahl von fliegen-Stämme in einer zeitgemäßen Weise, eignet sich für die erste Runde eine genetische Bildschirm, um die Liste der Kandidaten für weitere Tests schnell eingrenzen.
- Nach der Fütterung Prozess zu betäuben und Gäste die fliegen auf einen CO2 fliegen Pad unter dem Stereo-Mikroskop. Jede Fliege anhand der Lautstärke und Intensität der Farbstoff gefärbte Lebensmittel in ihren Bauch (Abbildung 2A) verleihen Sie Einzelnote.
Hinweis: Kriterien für visuelle Einschätzung: Score-System verfügt über 4 Ebenen der Nahrungsaufnahme entsprechend unterschiedliche Volumina und Intensitäten der farbigen Nahrung im Bauch.- Partitur fliegt ohne nachweisbare Farbstoff gefärbte Lebensmittel eine Punktzahl von 0; Gib denen mit schwacher (kaum erkennbar) blauen Farbstoff oder mit Farbstoff-farbigen essen weniger als ein Drittel des Volumens des Bauches besetzen einen Wert von 1.
- Partitur fliegt mit intensiven Farbstoff gefärbte Lebensmittel besetzen Hälfte des Bauches eine Punktzahl von 2.
- Gäste die mit intensiv gefärbten Inhalte besetzen mehr als die Hälfte des Bauches eine Kerbe von 3 (Abbildung 2A).
- Berechnen Sie den Anteil von Fliegen mit verschiedenen Punktzahlen in jeder versuchsbedingung (Abb. 2 b).
6. farbmetrischen Quantifizierung der Verzehr von Lebensmitteln
- Gießen Sie nach Beendigung der Fütterung alle 20 fliegen von einem Füllraum auf ein Stück mit einem Gewicht von Papier, dann übertragen sie in 1,5 mL Tube mit einer weichen Bürste.
Hinweis: Nehmen Sie alle Kammern aus-80 ° C Lagerung nicht zur gleichen Zeit fliegen festhalten an der Kammerwand wegen Kondenswasser auf der Kältekammer zu vermeiden. - Das Rohr 500 µL PBST hinzu und homogenisieren die fliegen mit eine Mühle bei 60 Hz für 5 s.
- Bestätigen Sie ausreichende Homogenisierung durch Beobachtung, gibt es keine nachweisbaren Fragmente von Körperteilen.
- Drehen Sie die Rohre mit Homogenates für 30 min bei 13.000 u/min um die Trümmer zu löschen.
- Übertragen Sie nach Zentrifugation 100 µL des Überstandes auf einen Brunnen einer 96-Well-Platte.
- Nachdem alle Samples geladen werden, setzen die Platte in einen Teller Reader zur Messung der Extinktion der Proben bei 630 nm.
- Entfernen die Hintergrund-Absorption, subtrahieren die Extinktion der Überstände von fliegen gefüttert Lebensmittel ohne Farbstoff aus der Extinktion des Überstands von der blauen Nahrung gefüttert fliegen.
Hinweis: Dieser Schritt ist optional, abhängig von den Kompositionen des Essens verwendet. Wenn eine Fliege Essen (ohne den Farbstoff) erzeugt Extinktion bei 630 nm, ist es notwendig, führen Sie diesen Schritt, um den Hintergrund zu eliminieren.
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Representative Results
Thermogenetischen Bildschirm.
Abnorm gesteigerter Appetit führt zu erhöhter Nahrungsaufnahme, unabhängig von physiologischen Bedürfnissen. Wir nutzten diese Regelung zu einer Hochdurchsatz-design Verhaltens Bildschirm zu genetischen Griffe von Neuronen im Zusammenhang mit hunger und satt Staaten (Abbildung 1). Der Bildschirm hat Taotie-Gal424ergeben. Bei aktiviertem Taotie-Gal4 Neuronen gewaltsam bei 30 ° C waren die Taotie > TrpA1 fliegt aufgenommene größere Mengen an Nahrung als die Kontrollen (Abbildung 2, Abbildung 3).
Visuell erzielte die Nahrungsaufnahme.
Weil einige Neurotransmitter und Neuropeptide bei der Regulierung der Fressverhalten mitgeteilt haben, haben wir die entsprechenden GAL4-Linien, einschließlich NPF20, sNPF39, Octopamin21, Dopamin27, getestet. 40, Serotonin41,42, AKH35und Dilp27,8,35. Zur Quantifizierung der Fütterungen Antwort wir optisch inspiziert und erzielte dabei fliegen mit verschiedenen Mengen nachweisbar Farbstoff im Darm (Abbildung 2A). Nach der Aktivierung von Taotie Neuronen, etwa 58 % des Taotie > dTrpA1 fliegen ausgestellt, starke Fütterung Verhaltensweisen und 23 % zeigte leichte Fütterung Verhaltensweisen (Abb. 2 b). Im Gegensatz dazu nur Marginalie Fütterung Verhaltensweisen beobachtet bei fliegen mit anderen Neuronen aktiviert über dTrpA1 (Abb. 2 b).
Farbmetrische Quantifizierung der Nahrungsaufnahme.
Quantifizierung der Nahrungsaufnahme mit hoher Präzision und Objektivität gemessen wir die Extinktion der Fliege Extraktion bei einer bestimmten Wellenlänge auf die zusätzlichen Farbstoff in der Nahrung2,27,28. Um eine Extinktion-Wert mit dem Volumen der Nahrungsaufnahme korrelieren, erhielt eine Standardkurve durch Messung der Extinktion der Probelösungen (den gleichen Puffer für die fliegen, PBST Homogenisieren) gemischt mit unterschiedlichen Mengen von Farbstoffen). Wie unsere Ergebnisse zeigen, aktiviert akute Taotie-GAL4 Neuronen durch TRPA1 drastisch erhöhte Nahrungsaufnahme im Vergleich mit genetischen Steuerung und Kontrolle der Temperatur während der gleichen Testphase (Abb. 3 b), was darauf hindeutet, dass die Taotie-GAL4 beschriftete Neuronen an Regulierung der Nahrungsaufnahme der Erwachsenen Drosophilateilnehmen.
Optogenetische Aktivierung Nahrungsaufnahme in Drosophilazu fördern.
Wir haben FH -CsChrimson um Taotie Neuronen durch Beleuchtung mit einem orangefarbenen Licht36 (Abbildung 4A, 4 b) zu aktivieren. Wenn Taotie > CsChrimson fliegen wurden angeregt durch LED-Leuchten bei 607 nm, verschluckt sie deutlich mehr Nahrung als Steuerelemente (Abbildung 4). Darüber hinaus die Beträge der aufgenommenen Nahrung korreliert gut mit den Intensitäten der Stimulation Licht (Abbildung 4). So fördert er neben Thermogenetics mit dTrpA1, optogenetische Aktivierung mit CsChrimson in Taotie Neuronen Fütterung Motivation in satt fliegen.
Abbildung 1 . Eine Fütterung Paradigma für die Analyse der Appetit bei Erwachsenen fliegen. (A) die Fütterung Kammer enthält eine innere Behälter gefüllt mit Farbstoff-farbigen Speisen und eine außen Container mit 1 % Agarose gepolstert. Von links nach rechts, innen-Container, der Außen Container und die komplette Füllraum. (B) innen Behälter sitzt oben auf die Agarose-Pad an der Unterseite des äußeren Containers. (C) Draufsicht auf den Füllraum. (D) A Schaltplan zeigt das Experiment "Appetit Bildschirm". Normale satte fliegen selten gegessen (linke Vial), bei der zwangsweise Aktivierung bestimmter Fütterung Kontrolle Neuronen verursacht satt fliegt zusätzliche Nahrung, damit ausstellenden Farbstoff-farbige Lebensmittel in den Bauch (richtige Fläschchen) einnehmen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Visuelle Einschätzung der Nahrungsaufnahme. (A) Exemplar Bilder, um die Kriterien zur Bewertung von Lebensmittel in den Bauch zu zeigen. (B) die Verteilung der Fütterung Noten im fliegen mit angegebenen Neuronen aktiviert wird durch dTrpA1 bei 30 ° C. No-Gal4: FH-dTrpA1 (genetische Kontrolle); NPF-GAL4: Neuropeptid F positive Neuronen; sNPF-GAL4: kurze Neuropeptid F positive Neuronen; TDC1-GAL4 und TDC2-GAL4: Octopamin Neuronen; TH-GAL4: Dopamin-Neuronen; 5-HT: Serotonin-Neuronen; AKH: Adipokinetic Hormon positive Neuronen; DIP2: Insulin-Like-Peptid 2 positive Neuronen; Taotie-GAL4: Taotie-GAL4 Etiketten Neuronen (n = 120 fliegen pro Zustand). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Thermogenetischen-Aktivierung Taotie Neuronen erhöht Nahrungsaufnahme bei Erwachsenen fliegen. (A) ein Bild zeigt den Aufbau des Experiments thermogenetischen Aktivierung. Die Fütterung durchgeführt wurde in einem Inkubator bei 30 ° C. (B) Verzehr von Lebensmitteln von farbmetrischen Quantifizierung in satt fliegen getestet bei 30 ° C oder 22 ° C für 1 h. Die Menge der Nahrungsaufnahme der eine Fliege errechnete sich aus, dass der 20 fliegen in einem Füllraum (n = 6). n.s. zeigt nicht signifikant (p > 0,05); p < 0,001. Einfache ANOVA mit Tukey post Hoc Test gefolgt wurde verwendet, um mehrere Vergleiche zu analysieren. Fehlerbalken zeigen Mittelwert ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Optogenetische-Aktivierung von Neuronen Taotie erhöht die Menge der Nahrungsaufnahme in einer Intensität-abhängigen Weise. (A, B) Zwei Ansichten des Setups für die optogenetische Aktivierung. Die Fütterungen Kammern wurden durch eine Reihe von orange LEDs seitlich auf eine Trägerplatte und von unten beleuchtete gelegt. Die Vorderseite der Box Beleuchtung wurde entfernt, um innen zu zeigen LEDs. Die Verhaltensexperimente waren in einem Inkubator bei 25 ° C, 60 % RH ausgeführt. (C) Verzehr von Lebensmitteln satt fliegen angegebenen Genotypen als unter optogenetische Beleuchtung oder in der Dunkelheit für 1 h getestet (n = 6). Essen (D) Einnahme von satt Taotie > CsChrimson fliegen korrelierte mit der Beleuchtungsstärke (n = 6). n.s. zeigt nicht signifikant (p > 0,05); p < 0,001, einfache ANOVA mit Tukey post Hoc Test gefolgt wurde zum Analysieren der multiple Vergleiche, Student t-test für zwei gruppenvergleiche. Fehlerbalken zeigen Mittelwert ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieser Bericht konzentriert sich auf den technischen Prozess der Farbstoff-Kennzeichnung Fütterung Assays der Verzehr von Lebensmitteln im Rahmen von thermogenetischen und optogenetische Aktivierung von Neuronen zu manipulieren controlling Fütterung. Dieses einfache und zuverlässige Protokoll wird dazu beitragen, die Funktion der Kandidat Neuronen in der Fütterung kontrollieren, Essen bevorzugt fliegen zu messen und zu identifizieren, neue Spieler in der Fütterung Steuerstromkreisen über Fütterung-basierten genetischen Bildschirme24aufzuklären.
Der Farbstoff Kennzeichnung Strategie ist bei der Untersuchung von kurzfristigen Fütter Verhaltensweisen möglich. Der Farbstoff, Erioglaucine binatrium, aufgelöst und mit der die Nahrung aufgenommen ist ein kritischer Indikator der Verzehr von Lebensmitteln. Deshpande Et Al. zeigten, dass der blaue Farbstoff selbst keinen Einfluss zeigte auf die Fütterung der CAFE-Test und das Radioisotop Kennzeichnung Lebensmittel Aufnahme Assay17gemessen. In ähnlicher Weise zufolge unsere pro-Ergebnisse (Stimulation der Fliege Bein mit Farbstoff-markierten oder Farbstoff-freie 100 mM Saccharoselösung) fliegen keinen signifikanten Unterschied in ihrer Antwort auf Farbstoff-markierten oder Farbstoff-frei Essen ausgestellt. Allerdings gibt es noch keine klare Daten darüber, ob der Farbstoff in Drosophilageschmacklos ist.
Außerdem die entscheidenden Schritte in das Protokoll, achten Sie besonders auf die allgemeinen Status der fliegen zu prüfenden angegeben. Abgesehen davon aufgezogen und gepflegt in einer Dichte nicht überfüllt, die Fliegen sollte vorsichtig behandelt werden, und vermeiden unnötige Erschütterungen oder Belastungen, um konsequente Fütterung Ergebnisse zu erzielen.
Die Fütterung Paradigma hier vorgestellten hat gewisse Einschränkungen. Unsere Methoden quantifizieren Erstens Nahrungsaufnahme über einen Zeitraum von 60 Minuten. Um Nahrungsaufnahme über einen längeren Zeitraum, z. B. ein Tag zu bewerten wäre eine andere Methode, wie zum Beispiel CAFE, erforderlich. Zweitens ist im Vergleich mit Quantifizierungsmethoden mit Radioisotopen, der kolorimetrischen Verfahren weniger empfindlich und schwer zu Meinungsverschiedenheiten beizulegen, wenn die Beträge der Verzehr von Lebensmitteln niedrig sind. Drittens: Wenn man bedenkt, dass einige fliegen beginnen würde, um so früh wie 15 Minuten nach Beginn der Fütterung zu entladen, dieses Protokoll misst eigentlich das Nettoergebnis der Nahrungsaufnahme und Ausscheidung in einer Bevölkerung17. Viertens war die kolorimetrischen Quantifizierung der Nahrungsaufnahme, die hier beschriebenen für eine Fliege Gruppe, Abschätzung der Nahrungsaufnahme der eine Fliege auf andere Fütterung Assays, z. B. Kennzeichnung von Radioisotopen, MAFE Assay oder FlyPAD abhängig ist. Dennoch machen es gewisse Vorteile der kolorimetrischen Quantifizierung der Nahrungsaufnahme, z. B. eine einfache, stabile, sichtbar und Hochdurchsatz-Methode, eine erstklassige Wahl für die Quantifizierung einer großen Anzahl von Sorten, vor allem für Fütterung-basierten genetischen Bildschirme und die Follow-up Studien.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch National Basic Research Program of China (2012CB825504), der National Natural Science Foundation of China (91232720 und 9163210042), chinesische Akademie der Wissenschaften (CAS) (GJHZ201302 und QYZDY-SSW-SMC015), Bill und Melinda Gates Stiftung (OPP1119434) und 100-Talente-Programm von CAS, Y. Zhu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
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