Summary
Kwantitatieve voedselinname testen met geverfd voedsel bieden een robuuste en high-throughput betekent om voeding motivatie. De voedsel consumptie-bepaling te combineren met thermogenetic en optogenetic schermen is een krachtige aanpak van de onderzoeken van de neurale circuits die ten grondslag liggen aan de eetlust in volwassen Drosophila melanogaster.
Abstract
De voedselconsumptie is onder de strakke controle van de hersenen, die integreert de fysiologische status, smakelijkheid en voeding inhoud van de voedingsmiddelen, en kwesties opdrachten starten of stoppen van de voeding. Ontcijferen van de processen die ten grondslag liggen aan de besluitvorming van tijdige en matig voeden draagt grote gevolgen in ons begrip van de fysiologische en psychologische aandoeningen gerelateerd aan het voeden van de controle. Robuuste, eenvoudige en kwantitatieve methoden zijn vereist voor het meten van de inname van het voedsel van dieren na experimentele manipulatie, zoals gedwongen het verhogen van de activiteiten van bepaalde doel neuronen. Hier, introduceerden we kleurstof labeling-gebaseerde voeding tests om te vergemakkelijken de neurogenetic studie van het voederen van controle in volwassen fruitvliegjes. Wij bekijken beschikbaar voeding testen en vervolgens beschrijven onze stap voor stap van setup analyse, die combineren thermogenetic en optogenetic manipulatie van neuronen controleren voeding motivatie met kleurstof-geëtiketteerden voedsel inname test methoden. Ook bespreken we de voordelen en beperkingen van onze methodes, in vergelijking met andere voeding testen, om te helpen lezers kiezen van een passende bepaling.
Introduction
Kwantificeren van de hoeveelheid geconsumeerd voedsel is belangrijk voor de evaluatie van meerdere aspecten van het voederen van controles door de hersenen in reactie op de interne behoeften (zoals honger de Staten) en externe factoren (zoals voedselkwaliteit en smakelijkheid)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. in de afgelopen jaren, de inspanningen van het ontcijferen van de neurale substraten controle te voeden in Drosophila leiden tot de ontwikkeling van meerdere tests rechtstreeks kwantificeren van de hoeveelheid voedsel geconsumeerd of dienen als een indicator van het voederen van motivatie 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
De capillaire FEeder (CAFE) assay12,13 werd ontwikkeld voor het meten van de hoeveelheid verbruik van vloeibaar voedsel in een glas microcapillary. De CAFE-bepaling is zeer gevoelig en reproduceerbare17 en vereenvoudigt de meting van de voedselconsumptie, vooral voor het kwantificeren van de lange termijn voeding18. Deze test vereist echter de vliegen te klimmen naar het uiteinde van de microcapillary en feed ondersteboven, die is niet geschikt voor alle stammen. Bovendien, omdat de vliegen te worden getest met behulp van de CAFE-bepaling worden gehouden op vloeibaar voedsel moeten, het effect van deze voorwaarden op metabolisme status of de potentiële ondervoeding fokken moet nog worden bepaald.
De reactie van de uitbreiding van Proboscis (PER) assay11,14 telt de frequentie van proboscis extensie reacties naar zachte aanrakingen van voedsel druppels. PER assay bewezen als een uitstekende manier om te evalueren door motivatie van individuele fly en ezels te voeden de invloed van de smakelijkheid en inhoud van voedsel18,19. Het is echter niet een directe kwantificering van inname bedrag.
Onlangs, een semi-automatische methode, de handleiding voederen assay (MAFE)15, werd ontwikkeld. In MAFE, wordt een enkele geïmmobiliseerdet vlieg handmatig gevoed met een levensmiddel bevatten microcapillary. Gezien het feit dat proboscis extensie reacties en voedselconsumptie kunnen gelijktijdig worden gecontroleerd, leent MAFE zich voor de beoordeling van de nutriënten waarden en de effecten van farmacologische manipulatie. Echter immobilizing een vlieg kan negatieve gevolgen hebben zijn gedrags prestaties, met inbegrip van voeding.
Bovendien vliegen Proboscis en activiteit Detector (FlyPAD)10 werd ontwikkeld om de voeding gedrag automatisch te kwantificeren. Met behulp van machine vision methoden registreert FlyPAD fysieke interactie tussen een vlieg en voedsel te kwantificeren van de frequentie en duur van proboscis extensies als een indicator van het voederen van motivatie. FlyPAD biedt een high-throughput benadering te volgen van de voeding gedrag van een gratis voortbewegende vliegen, hoewel de gevoeligheid en de degelijkheid van dit systeem moet nog verder worden bevestigd door meer studies12.
Labeling strategieën worden vaak gebruikt om te schatten van voedsel inname in vliegen. Het is gebruikelijk om voedsel van een label met chemische verklikstoffen en meten na de voeding, de hoeveelheid geconsumeerde tracer voor het berekenen van de hoeveelheid voedselinname. Radioactieve tracers16,17,20,21,22,23,24,25 voldoende zijn voor de detectie via de cuticula zonder de homogenisering van de vliegen. Deze methode biedt opmerkelijk lage variabiliteit en hoge gevoeligheid18, en is haalbaar voor lange termijn studie van de voedselinname. Echter, de beschikbaarheid van de bruikbare radioactieve isotopen en de verschillende tarieven van absorptie en excretie moeten rekening worden gehouden bij het werken met deze test.
Labelen en tracering van de voedselinname met niet-giftig voedsel kleuren is een veiliger en eenvoudiger alternatief2,3,26,27,28. Vliegen zijn gehomogeniseerd na de voeding met levensmiddelen die oplosbare en niet-absorbeerbare kleurstoffen bevatten, en het bedrag van de geconsumeerde kleurstof is later gekwantificeerd aan de hand van een spectrofotometer3,24,28,29 . De labeling strategie is gemakkelijk uit te voeren en biedt hoge efficiëntie, maar met een waarschuwing. Het volume van de voedselinname geschatte vanuit de geconsumeerde kleurstof is kleiner dan het werkelijke volume omdat uitscheiding zo spoedig 15 min begint na het vliegen beginnen eten van17. Bovendien beoordeelt de assay voedsel inname meestal binnen een termijn van 60-min, die alleen geschikt voor onderzoek van kortlopende voeding gedrag24,28 is. Bovendien meerdere interne en externe factoren, zoals genotype17, gender17, gekruist staat17, fokken dichtheid30, circadiane ritme31,32, en voedsel kwaliteit3 , 8 , 16, invloed voedselinname. Daarom is de voeding duur wellicht worden aangepast volgens specifieke experimentele omstandigheden. Naast het vergemakkelijken van de kwantificering van de voedselinname, worden voedsel kleuren ook gebruikt om te beoordelen van voedsel keuzes2,19,27, en visualiseren van de meniscus in een microcapillary in CAFE assay12.
Hier introduceren we een protocol gecombineerd manipulatie van neuronale activiteit met kleurstof-labeling aanpak. Deze strategie heeft bewezen nuttig in onze neurogenetic studie op het vervoederen aan controle in volwassen fruitvliegjes24. De visuele scoren methode zorgt voor een snelle schatting van de voedselconsumptie; het is dus nuttig voor screening door middel van een groot aantal stammen in een tijdig. De kandidaten van het scherm worden vervolgens geanalyseerd in detail met behulp van een colorimetrische methode om objectieve en precieze kwantificering in aanvullende studie.
Naast de voeding testen, we ook thermogenetic27,33,34,35 en optogenetic36 worden de methoden beschreven doel neuronen in Drosophilaonder dwang om te activeren. Activeren van neuronen met thermogenetic bediening is eenvoudig en handig met Drosophila voorbijgaande Receptor potentiële Ankyrin 1 (dTRPA1), die een temperatuur - en spanning-gated catie kanaal dat neuronale prikkelbaarheid verhoogt wanneer de omgevingstemperatuur temperatuur stijgt boven 23 ° C33,37; testen van dieren bij hoge temperaturen kan produceren echter bijwerkingen op het gedrag. Een andere doeltreffende benadering van neuronen in Drosophila activeren is met behulp van optogenetics met CsChrimson36, die is een rood-verschoven variant van channelrhodopsin die een toename van de prikkelbaarheid van neuronen bij blootstelling aan licht. Optogenetics biedt hogere temporele resolutie en minder verstoring om gedrag dan thermogenetics. De kwantitatieve meting van de voedselinname te combineren met de manipulatie van neuronale activiteit geeft een effectieve aanpak voor het bestuderen van de neurale mechanismen van voeding.
We beschrijven in detail de bereiding van de voeding zaal en de vliegen te beproeven. Met behulp van Taotie-Gal4 vliegen als een model24, beschrijven we activerende neuronen door thermogenetics en optogenetics. Twee tests van kwantificering van de voedselconsumptie met kleurstof-geëtiketteerden voedsel worden ook beschreven in het protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van de voeding zaal
Opmerking: De voeding zaal voor voeding assay kleurstof-labeling bestaat uit twee delen: de buiten container (als een cover) en de binnenkant container (als bron van voedsel).
- Wijzigen van de buiten container uit een flesje van glas voor het kweken van Drosophila met (een inwendige diameter van 31.8 mm) en een lijfhoogte van 80 mm (figuur 1A, 1 C). Dekking de onderkant van de container met een laagje van 1% agarose (5 mL) te houden van de voeding setup goed bevochtigde en dienen als een zachte ondergrond voor de vliegen om te lopen op (figuur 1B). De container biedt daarmee een setting van het gecontroleerde maar naturalistische uitvoering met minimale stress of verstoring van de vliegen.
- De buiten container voor te bereiden. Suspendeer 0,5 g agarose in 50 mL dubbel gedestilleerd water, warmte met frequente agitatie, en kook te ontbinden volledig op een magneetroerder met een warmte-plaat.
- Wanneer de 1% agarose koelt tot ongeveer 60 ° C, 5 mL van de 1% agarose overbrengen in een lege buiten container (figuur 1B), en laat de container blijven open tot afgekoeld tot kamertemperatuur aan opbrengst een agarose pad.
- Kleurstof-geëtiketteerden eten bereiden. Samenstelling van de levensmiddelen kleurstof-geëtiketteerden hangt af van verschillende experimentele doeleinden. Hier is een voorbeeld van het bereiden van de kleurstof-geëtiketteerden voedsel met alleen sacharose.
- Voeg 0,5 g agarose aan 50 mL dubbel gedestilleerd water, warmte met frequente agitatie, en kook te ontbinden volledig op een magneetroerder met een warmte-plaat.
- Wanneer de bovenstaande 1% agarose tot ongeveer 60 ° C koelt, 1,71 g van sacharose aan de agarose verkrijgen van 100 mM sacharose toevoegen.
- 0,25 g blauwe kleurstof (erioglaucine Dinatrium) toevoegen aan de agarose oplossing om 0,5% (w/v) kleurstof-geëtiketteerden voedsel te verkrijgen.
- Voorbereiden van de binnenkant container. Zet de lege in containers op een vlakke horizontale ondergrond, dan toevoegen van 750 µL van blauwe kleurstof-geëtiketteerden voedsel aan individuele voedsel container, laat het stollen voor minstens 5 min.
Opmerking: De binnenkant container is een klein kunststof schotel met een inwendige diameter van 13,6 mm en een hoogte van 7.5 mm (figuur 1A, 1 C). Het is gevuld met kleurstof-geëtiketteerden voedsel, en vervolgens is gepositioneerd in het midden van het agarose stootkussen van de buiten container. - Pipetteer een ingevuld in container in een bereid buiten container en plaats deze in het midden van de agarose pad. Laat de voeding kamers blijven open bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten tot de muur van de buiten container condensatie is.
Opmerking: De droge muur is noodzakelijk om te voorkomen dat de vliegen door contact met waterdruppels vast te zitten op de wand. - Bereiden van voeding kamers met kleurstof-vrij voedsel (dezelfde samenstelling maar zonder kleurstof) voor achtergrond aftrekken.
2. voorbereiding van vliegen
Opmerking: Volwassen vrouwtje vliegt 5 tot 10 overmorgen eclosion worden normaal gesproken gebruikt voor het voederen van testen. Het wordt aanbevolen te bereiden vliegen van verschillende genotypen, met inbegrip van genetische controles, en in parallel te testen. 20 vliegen (vanaf één voeding kamer) genereren van één gegevenspunt.
- Overwegen de bevolkingsdichtheid voor het opfokken van volwassen vliegen. Typisch, bepalen de bevolkingsdichtheid door het variëren van het aantal ouderlijke vliegen volgens de spanningen en de afmetingen van flessen van de cultuur. Als voorbeeld, 15 mannen en 30 vrouwen van Canton-S overbrengen in een fles van de cultuur met (een diameter van 31.8 mm) en een lijfhoogte van 80 mm en laat de vrouwtjes leggen eieren voor een dag dan verwijderen die de volwassene vliegt.
- Bereiden vliegen voor thermogenetic activering.
- Gebruik de Gal4/UAS systeem38 uitspreken dTRPA133 in verschillende neuronen door Overstekende die UAS-dTrpA1 met verschillende GAL4 stuurprogramma lijnen (figuur 2B vliegt).
- Houd de volwassen vliegen op standaard voedsel op 22 ° C, relatieve vochtigheid van 60% en een 12/12 uur licht-donker cyclus.
- Twee dagen voorafgaand aan het voederen assay, sorteren en vliegen op een CO2 vlieg pad onder een stereo microscoop in een flesje vers voedsel te verzamelen en een bevolkingsdichtheid van 20 vliegen houden per flacon.
- Bereiden vliegen voor optogenetic activering.
- Gebruik de Gal4/UAS systeem38 uitspreken CsChrimson36 in verschillende neuronen door Overstekende UAS-CsChrimson vliegen met verschillende GAL4 stuurprogramma lijnen.
- Nieuw eclosed (binnen 24u) vliegen verzamelen en ze vervolgens overbrengen naar een flacon met standaard voedsel met 400 µM all-trans-retinal.
- Voorkom voortijdige activering en wikkel de steigerend flesjes met aluminiumfolie en zet ze dan in een donkere kast te vliegen behoeden voor ongewenste lichte stimulatie. Houden de vliegen bij 25 ° C, 60% vochtigheid in het donker voor 4-6 dagen.
- Twee dagen voorafgaand aan de voeding assay, vliegt soort vrouwtje op CO2 vlieg pad onder een stereomicroscoop. 20 vliegen verzamelen in één voedsel flesje en houd ze in het donker voorafgaand aan de voeding test.
- Uitvoeren van alle operaties onder schemerige licht zo spoedig mogelijk de effecten veroorzaakt door omgevingslicht te vermijden. Gebruik een LED-lamp geplaatst ver weg van het werkgebied, de intensiteit in het werkgebied is 5 μW/cm2.
Opmerking: Gebruik uitgehongerd Canton-S vliegt als positieve controle voor de voeding assay. Ontnemen van deze vliegen van voedsel en handhaven op 1% agarose gedurende 24 uur voorafgaand aan de voeding test. De niveaus van de voedselconsumptie van deze vliegen helpen evalueren de dagelijkse schommelingen.
3. thermogenetic activering
- Uitvoering van alle voeding experimenten op hetzelfde moment van de dag, rond Zeitgeber tijd 4-631,32, om te minimaliseren van schommelingen als gevolg van circadiane ritmen.
- Een incubator (of een kleine kamer met een temperatuurgevoelig kachel) voor te bereiden als het milieu van de verwarming.
- Equilibreer voordat gedrags experimenten, de bereide voeding kamers bij de experimentele temperatuur (30 ° C) voor 2 h om ervoor te zorgen dat de temperatuur is relatief uniform in de voeding zaal.
- De voeding proces te beginnen, zorgvuldig Pipetteer 20 vliegen uit hun huis ampul in een voorverwarmde voeding kamer door zacht te onttrekken. Doorgaan met de voeding bij 30 ° C gedurende 60 minuten ( figuur 3A) .
Opmerking: Frequente gemoedsbewegingen, moeten zoals openen en sluiten van de deur van de incubator, negatieve invloed hebben op de voeding gedrag, dus worden geminimaliseerd. - Ophouden voeden op 60 min door bevriezing van de voeding kamers bij-80 ° C (of -20 ° C) gedurende 30 minuten.
Opmerking: Bevriezing helpt om te stoppen met voedingen in alle kamers tegelijk. Bevriezing van vliegen bij-80 ° C dient twee doelen, voor het euthanizing van de vliegen en opslag tot homogenisering voor maximaal een week. - Pipetteer 20 vliegen in een kamertemperatuur voederen kamer met kleurstof gekleurd voedsel om te beginnen met het voederen proces bij 22 ° C gedurende 60 min voor de controlegroep temperatuur.
- Ophouden voeden van de temperatuur controlegroep door bevriezing van de kamers bij-80 ° C (of -20 ° C) gedurende 30 minuten.
4. Optogenetic activering
- Uitvoering van alle voeding experimenten op hetzelfde moment van de dag, rond Zeitgeber tijd 4-631,32, om te minimaliseren van schommelingen als gevolg van circadiane ritmen.
- Zorgvuldig Pipetteer 20 vliegen van één ampul in een voederen kamer door zacht te onttrekken, en zet dan de kamer zijwaarts op de verlichting setup (figuur 4A, 4B).
- Om de optogenetic te manipuleren, gebruik een array of oranje LEDs (607 nm) als de bron van licht stimulatie, en fix een horizontale plexiglas plaat boven de LEDs ter ondersteuning van het voederen chambers tijdens de verlichting. Houd de setup in een incubator bij 25 ° C met 60% vochtigheid (figuur 4A, 4B).
- Stimuleren van de genetische controle vliegen in parallel met de Taotie > CsChrimson vliegt, maar voeden in verschillende kamers.
- Doorgaan met de voeding gedurende 60 minuten met terug verlichting door de oranje licht.
- Bepalen van de optimale verlichting intensiteiten voor optogenetics experimenteel36. Voor de Taotie > CsChrimson vliegen, een intensiteit van 2.2 mW/mm2 induceert verlamming (beëindiging van de motoriek) en verlies van posturale controle, daarom, een tussenliggende intensiteit van 0.1 mW/mm2 gebruiken ter stimulering van de Taotie > CsChrimson vliegt tijdens de voeding test.
- Niet langer de voeding door bevriezing voeding kamers bij-80 ° C (of -20 ° C) gedurende 30 minuten.
5. visuele schatting van de voedselconsumptie
Opmerking: De visuele scoren aanpak biedt een semi-kwantitatieve schatting van de voedsel consumpties. Hoewel het is niet zo objectief de optische methode, voorziet in deze methode gaan door een groot aantal fly stammen in een tijdig, waardoor het geschikt is voor de eerste ronde van een genetische scherm om snel een beperking van de lijst van kandidaten voor verdere tests.
- Na het voeding proces, anesthetize en score de vliegen op een CO2 vlieg pad onder een stereomicroscoop. Individuele score geven elke vliegen op basis van het volume en de intensiteit van de kleurstof-gekleurde voedsel in haar buik (figuur 2A).
Opmerking: Criteria voor visuele schatting: het score-systeem heeft 4 niveaus van voedselinname overeenkomt met verschillende volumes en intensiteiten van gekleurde voedsel in de buik.- Score vliegt zonder detecteerbare kleurstof-gekleurde voedsel een score van 0; Geef degenen met zwakke (nauwelijks detecteerbare) blauwe kleurstof of met kleurstof gekleurd voedsel bezetten van minder dan een derde van het volume van de buik een score van 1.
- Score vliegt met intense kleurstof-gekleurde voedsel bezetten de helft van de buik een score van 2.
- Score die met intens gekleurde inhoud bezetten meer dan de helft van de buik een score van 3 (figuur 2A).
- Bereken het percentage van vliegen met verschillende scores in elk experimentele conditie (figuur 2B).
6. colorimetrische kwantificering van de voedselconsumptie
- Na beëindiging van het voederen van dieren, uitstorten alle 20 vliegt vanaf een voeding kamer op een stuk van het gewicht van papier en ze vervolgens overbrengen naar een 1,5 mL-buis met een zachte borstel.
Opmerking: Neem alle van de kamers uit-80 ° C opslag in entrepot niet op hetzelfde moment om te voorkomen dat vliegen vasthouden aan de muur van de kamer vanwege de condensatie van het water op de koelkamer. - Voeg 500 µL van PBST aan de buis en meng het vliegen met behulp van een schuurmachine molen bij 60 Hz voor 5 s.
- Bevestigen voldoende homogenisering door observatie wanneer er geen detecteerbare fragmenten van lichaamsdelen.
- Draai de buizen met homogenates voor 30 min op 13.000 tpm tot duidelijk het puin.
- Breng 100 µL van supernatant aan een putje van een 96-wells-plaat na het centrifugeren.
- Nadat alle monsters zijn geladen, zet de plaat in een afleesapparaat voor het meten van de extinctie van de monsters op 630 nm.
- Aftrekken van de extinctie van het supernatant van vliegen te verwijderen van de achtergrond extinctie gevoed op voedsel zonder kleurstof uit de extinctie van de bovendrijvende substantie van de blauwe voedsel gevoed vliegen.
Opmerking: Deze stap is optioneel, afhankelijk van de samenstelling van het voedsel gebruikt. Wanneer een vliegen eten (zonder de kleurstof) genereert absorptie bij 630 nm, het is noodzakelijk voor het uitvoeren van deze stap te elimineren van de achtergrond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thermogenetic scherm.
Abnormaal verhoogde eetlust veroorzaakt verhoogde voedselinname, ongeacht de fysiologische behoeften. We gebruikt deze regeling voor het ontwerpen van een high-throughput gedrags scherm te verkrijgen van genetische handgrepen van neuronen met betrekking tot honger en verzadigd Staten (Figuur 1). Het scherm leverde Taotie-Gal4-24. Wanneer de Taotie-Gal4 neuronen waren gedwongen geactiveerd bij 30 ° C, de Taotie > TrpA1 vliegt geconsumeerde grotere hoeveelheden voedsel dan de besturingselementen (Figuur 2, Figuur 3).
Visueel scoren de voedselconsumptie.
Omdat sommige neurotransmitters en neuropeptides hebben in de regulatie van de voeding gedrag is aangegeven, hebben we getest met de corresponderende GAL4 regels, met inbegrip van NPF20, sNPF39, octopamine21, dopamine27, 40, serotonine41,42, AKH35en Dilp27,8,35. Om te kwantificeren van de voeding reactie, wij visueel geïnspecteerd en scoorde vliegt met verschillende hoeveelheden detecteerbare kleurstof in de darm (figuur 2A). Na activering van de Taotie neuronen, ongeveer 58% van Taotie > dTrpA1 vliegen tentoongesteld sterke voeding gedrag en 23% van deze bleek mild voeding gedrag (figuur 2B). Daarentegen slechts marginale voeding gedrag werden waargenomen in vliegen met andere neuronen geactiveerd dTrpA1 (figuur 2B).
Colorimetrische kwantificering van de voedselinname.
We gemeten om te kwantificeren voedselinname met hoge precisie en objectiviteit, de extinctie van de extractie van de vliegen bij een specifieke golflengte aan de toegevoegde kleurstof in de voedsel2,27,28. Om de waarde van een extinctie correleren met het volume van de voedsel-inname, is een standaard curve verkregen door het meten van de extinctie van de monsteroplossingen (de dezelfde buffer voor de vliegen, PBST homogenisatie) gemengd met verschillende hoeveelheden kleurstoffen). Zoals onze resultaten tonen, acute geactiveerd Taotie-GAL4 neuronen door TRPA1 dramatisch toegenomen voedselinname vergeleken met genetische controle en de temperatuurregeling in de zelfde testperiode (figuur 3B), wat suggereert dat de Taotie-GAL4 gelabelde neuronen deelnemen aan regulering van de voedselinname van volwassen Drosophila.
De activering van het Optogenetic ter bevordering van de voedselinname in Drosophila.
We UAS -CsChrimson gebruikt om te activeren Taotie neuronen door verlichting met een oranje licht36 (figuur 4A, 4B). Wanneer Taotie > CsChrimson vliegen werden gestimuleerd door LED-verlichting op 607 nm, ze aanzienlijk meer voedsel dan controles (figuur 4C) ingenomen. Bovendien is de hoeveelheid geconsumeerde levensmiddelen gecorreleerd goed met de intensiteit van de stimulatie licht (Figuur 4 d). Dus, naast de thermogenetics met dTrpA1, de activering van het optogenetic met CsChrimson in de Taotie neuronen bevordert ook voeding motivatie in verzadigd vliegen.
Figuur 1 . Een voeding paradigma voor het analyseren van eetlust in volwassen vliegen. (A) het voederen kamer bevat een binnenkant container gevuld met kleurstof-gekleurde eten en een buiten container opgevuld met 1% agarose. Van links naar rechts, de binnenkant container, de externe container en de volledige voeding kamer. (B) de binnenkant container zit bovenop de agarose pad aan de onderkant van de buiten container. (C) bovenaanzicht van de voeding kamer. (D) een schema toont het experiment "eetlust scherm". Normale verzadigd vliegen aten zelden eten (linker vial), terwijl het onder dwang activeren bepaalde voeding controle neuronen veroorzaakt verzadigd vliegt naar inslikken extra voedsel, dus het tentoonstellen van kleurstof-gekleurde voedsel in de buik (juiste vial). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Visuele schatting van voedsel inname. (A) Exemplar beelden te tonen van de criteria voor het scoren van voedsel inhoud in de buik. (B) de verdeling van de scores in vliegen vervoederen aangegeven neuronen worden geactiveerd door dTrpA1 bij 30 ° C. No-Gal4: UAS-dTrpA1 (genetische controle); NPF-GAL4: neuropeptide F positieve neuronen; sNPF-GAL4: korte neuropeptide F positieve neuronen; TDC1-GAL4 en TDC2-GAL4: octopamine neuronen; TH-GAL4: dopamine neuronen; 5-HT: serotonine neuronen; AKH: adipokinetic hormoon positieve neuronen; dip2: insuline-achtige peptide 2 positieve neuronen; Taotie-GAL4: Taotie-GAL4 etiketten neuronen (n = 120 vliegen per voorwaarde). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Thermogenetic-activering van Taotie neuronen verhoogt de voedselconsumptie in volwassen vliegen. (A) een afbeelding toont de setup van het experiment van de activering van de thermogenetic. De voeding test werd uitgevoerd in een incubator bij 30 ° C. (B) de voedselconsumptie door colorimetrische kwantificering in verzadigd vliegen getest bij 30 ° C of 22 ° C gedurende 1 h. Het bedrag van de voedselconsumptie van een enkele vliegen was berekend op basis van die van 20 vliegen in één voeding kamer (n = 6). n.s. geeft niet significant (p > 0,05); p < 0,001. One-way ANOVA volgde met de Tukey post hoc test werd gebruikt voor het analyseren van meerdere vergelijkingen. Foutbalken geven de gemiddelde ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Optogenetic-activering van de Taotie neuronen verhoogt de hoeveelheid van de inname van voedsel op een intensiteit-afhankelijke manier. (A, B) Twee weergaven van de setup voor optogenetic activering. De voeding kamers werden opzij op een ondersteunende plaat en verlichte vanaf de onderkant gelegd door allerlei oranje LEDs. De voorzijde van het vak verlichting werd verwijderd om te laten zien van de binnenkant LEDs. De gedrags experimenten werden uitgevoerd binnenkant van een incubator bij 25 ° C, 60% RH. (C) de voedselconsumptie van verzadigd vliegen van aangegeven genotypen wanneer getest onder optogenetic verlichting of in het donker voor 1 h (n = 6). (D) voedsel inname door verzadigd Taotie > CsChrimson vliegen was gecorreleerd met de intensiteit van de verlichting (n = 6). n.s. geeft niet significant (p > 0,05); p < 0.001, One-way ANOVA volgde met de Tukey post hoc test werd gebruikt voor het analyseren van meerdere vergelijkingen, Student t-test voor de twee vergelijkingen van de groep. Foutbalken geven de gemiddelde ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit rapport richt zich op het technische proces van kleurstof-labeling voeding tests van de voedselconsumptie in de context van thermogenetic en optogenetic activering te manipuleren neuronen controleren van voeding. Dit eenvoudig en betrouwbaar protocol zal bijdragen tot het ophelderen van de functie van neuronen van de kandidaat voor het voederen van controle, voor het meten van de voedsel-voorkeur van vliegen en identificeren van nieuwe spelers in de voeding aanstuurkringen via genetische schermen voederen gebaseerde24.
De kleurstof labeling strategie is haalbaar bij het onderzoeken van kortlopende voeding gedrag. De kleurstof, Dinatrium erioglaucine, opgelost in en ingenomen met het voedsel, is een kritische indicator van de voedselconsumptie. Deshpande et al. aangetoond dat de blauwe kleurstof zelf geen invloed toonde op het vervoederen aan gemeten naar zowel de CAFE-test en de etikettering van voedsel inname assay17isotoop. Ook onze PER-resultaten (stimuleren van de vlieg been met kleurstof-geëtiketteerden of kleurstof-vrije 100 mM sacharoseoplossing) aangegeven dat de vliegen geen significant verschil in hun reactie naar kleurstof-geëtiketteerden of kleurstof-vrij voedsel tentoongesteld. Er zijn echter nog steeds geen duidelijk gegevens met betrekking tot de vraag of de kleurstof smakeloos in Drosophila is.
Bovendien de kritische stappen aangegeven in het protocol, bijzondere aandacht besteden aan de algemene status van de vliegen te beproeven. Naast wordt gefokt en onderhouden bij een niet-overvolle dichtheid, het vliegen voorzichtig moeten worden omgegaan, en vermijden van geen onnodige schokken of benadrukt, om te produceren consistente voeding resultaten.
De voeding paradigma hier gepresenteerd heeft bepaalde beperkingen. Ten eerste, onze methoden kwantificeren voedselconsumptie gedurende een periode van 60 min. Om te evalueren van voedsel inname over langere perioden, bijvoorbeeld een dag, zou een andere methode, zoals CAFE, nodig zijn. Ten tweede, in vergelijking met de methoden van de kwantificering met behulp van radio-isotopen, de colorimetrische methode is minder gevoelige en moeilijke geschillen op te lossen wanneer de bedragen van de voedselconsumptie laag. Ten derde, gezien het feit dat sommige vliegen beginnen zou te kwijting zo spoedig 15 min na het begin van de voeding, dit protocol eigenlijk meet het netto resultaat van de voedselinname en excretie bij een bevolking17. Ten vierde, was de colorimetrische kwantificering van de voedselinname hier beschreven voor een vlieg groep, schatting van de voedsel-inname van een één vlieg is afhankelijk van de andere voeding tests, zoals de isotoop labeling, MAFE assay of FlyPAD. Echter bepaalde voordelen van de colorimetrische kwantificering van inname van voedsel, zoals een eenvoudig, stabiel, zichtbaar en high-throughput methode, wordt er een uitstekende keuze voor de kwantificering van grote aantallen stammen, vooral voor vervoedering gebaseerde genetische schermen en de follow-up studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door nationale Basic Research programma van China (2012CB825504), National Natural Science Foundation of China (91232720 en 9163210042), Chinese Academie van Wetenschappen (CAS) (GJHZ201302 en QYZDY-SSW-SMC015), Bill en Melinda Gates Stichting (OPP1119434), en 100-talenten programma van CA's Y. Zhu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels - Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
