Summary
Nicel gıda alımı deneyleri boyalı gıda ile sağlam sağlamak ve yüksek üretilen iş besleme motivasyon değerlendirileceği anlamına gelir. Gıda tüketimi tahlil ile thermogenetic birleştiren ve optogenetic ekranlar iştah yetişkin temel sinir devreleri araştırmak için güçlü bir yaklaşımdır Drosophila melanogaster.
Abstract
Gıda tüketim fizyolojik durum, palatability ve gıda ve sorunları komutları başlatmak veya besleme durdurmak için besin içeriği entegre beyin sıkı kontrolü altında olduğunu. Karar verme, zamanında ve ılımlı anlayışımız için besleme kontrol ile ilgili bir fizyolojik ve psikolojik bozukluk taşıyan büyük etkileri besleme altında yatan süreçleri deşifre. Basit, nicel ve güçlü hayvan gıda alımından sonra zorla belirli hedef nöron faaliyetleri artan gibi deneysel manipülasyon ölçmek için gereken yöntemlerdir. Burada, biz yetişkin meyve sinekleri besleme kontrol neurogenetic çalışma kolaylaştırmak için beslenme deneyleri boya etiketleme-tabanlı tanıttı. Biz kullanılabilir besleme deneyleri gözden geçirin ve sonra kurulum adım adım thermogenetic birleştirmek analiz ve optogenetic manipülasyon nöronların boya etiketli gıda alımı tahlil ile besleme motivasyon kontrol bizim yöntemleri açıklanmaktadır. Biz de avantaj ve seçmek uygun bir tahlil okuyucuların yardımcı olmak için diğer beslenme deneyleri ile karşılaştırıldığında bizim yöntemleri sınırlamaları tartışıyorlar.
Introduction
Yutulması gıda miktarı miktarının denetimler iç ihtiyaç (örneğin açlık Devletler) ve dış faktörler (örneğin, gıda kalitesi ve palatability)1, için yanıt beyin tarafından besleme birden çok yönlerini değerlendirmek için önemlidir 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. son yıllarda, doğrudan gıda yutulur miktarını ölçmek ya da bir göstergesi olarak motivasyon beslenme için birden fazla deneyleri gelişimi besleme kontrol içinde Drosophila sinir yüzeylerde deşifre çabaları yol 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
Kapiller Besleyici (CAFE) tahlil12,13 cam microcapillary sıvı gıda tüketiminin miktarını ölçmek için geliştirilmiştir. CAFE tahlil son derece hassas ve tekrarlanabilir17 yaşında ve gıda tüketimi, özellikle için uzun vadeli besleme18miktarının ölçülmesi basitleştirir. Ancak, bu tahlil microcapillary ucuna kadar tırmanmaya ve baş aşağı, hangi tüm suşları için uygun değildir yem uçar gerektirir. Ayrıca, CAFE tahlil kullanarak test edilecek sinekler gerektiği üzerinde sıvı gıda yetiştirilen kararlı olmak bunlar metabolizma durumu veya potansiyel yetersiz beslenme koşulları yetiştirme etkisi kalır.
Hortum uzantısı yanıt (PER) tahlil11,14 hortum uzantısı yanıt doğru gıda damla nazik dokunuşlar sıklığını sayar. Değerlendirmek için mükemmel bir yol olarak kanıtlanmıştır tahlil başına bireysel sinek ve eşek palatability etkisi ve gıda18,19içerik besleme. Ancak, bu alımı tutarının doğrudan bir miktar değil.
Son zamanlarda, yarı otomatik bir yöntem, belgili tanımlık elle yapılan tahlil (MAFE)15, besleme geliştirilmiştir. MAFE, tek immobilize karıncayı el ile gıda içeren bir microcapillary ile beslenir. Verilen bu hortum uzantısı yanıt ve gıda tüketimi aynı anda izlenebilir, MAFE besin değerleri ve farmakolojik manipülasyon etkilerini değerlendirmek için uygundur. Ancak, bir sinek immobilizing olumsuz beslenme de dahil olmak üzere onun davranış performans etkisi olabilir.
Ayrıca, hortum sinek ve etkinlik dedektörü (FlyPAD)10 otomatik olarak beslenme davranışı ölçmek için geliştirilmiştir. Makine vizyon yöntemleri kullanarak, FlyPAD bir sinek ve gıda sıklığı ve süresi, hortum uzantıları motivasyon beslenme bir göstergesi olarak ölçmek için arasındaki fiziksel etkileşim kaydeder. FlyPAD hassasiyet ve sağlamlık bu sistemin ne kadar kalır daha fazla daha tarafından onaylandıktan sonra temin edilebilir özgür hareket eden karıncayı beslenme davranışları izlemek için bir yüksek-den geçerek yaklaşım12çalışmaları sağlar.
Etiketleme stratejileri sinekler gıda alımından tahmin etmek için sık kullanılır. Gıda Kimyasal izleyicileri ile etiket ve besleme sonra gıda alımı miktarını hesaplamak için alınan izleyici miktarını ölçmek için yaygındır. Radyoaktif izleyiciler16,17,20,21,22,23,24,25 izin algılanması aracılığıyla manikür için homojenizasyon Sineklerin Tanrısı. Bu yöntem son derece düşük değişkenliği ve yüksek hassasiyet18sağlar ve gıda alımı uzun dönem eğitim için uygun olduğunu. Ancak, kullanılabilir radioisotopes kullanılabilirliğini ve Absorbans ve atılımı farklı oranda dikkate bu tahlil ile çalışırken alınmalıdır.
Etiketleme ve gıda alımı toksik olmayan gıda renklerle izleme olduğunu bir daha güvenli ve daha basit alternatif2,3,26,27,28. Sinekler çözünür ve absorbe olmayan boyalar içeren gıda ile besleme sonra homojenize ve hafızanın boya miktarı daha sonra bir Spektrofotometre3,24,28,29 kullanarak sayısal . Etiketleme stratejisi yapmak kolaydır ve yüksek verim sağlar ama bir ihtar ile. Gıda alımı alınan boya tahmini17besleme sinekler başlattıktan sonra atılımı 15 dakika gibi erken başlar çünkü gerçek ses daha küçük bir birimdir. Ayrıca, tahlil gıda alımından sadece kısa vadeli beslenme davranışı24,28incelenmesi için uygundur, genellikle 60-min aralıktaki değerlendiriyor. Ayrıca, devlet17yoğunluğu30, sirkadiyen ritim31,32ve gıda kalite3 yetiştirme, genotip17, cinsiyet17, gibi birden çok iç ve dış faktörler çiftleş , 8 , 16, etkisi gıda alımı. Bu nedenle, beslenme süresi belirli deneysel şartlarına göre ayarlanması gerekebilir. Gıda alımı miktar kolaylaştırıcı yanı sıra, gıda seçimler2,19,27değerlendirmek ve bir microcapillary CAFE tahlil12Menisküs görselleştirmek için de gıda renkler kullanılır.
Burada, nöronal aktivite boya etiketleme yaklaşımı ile birlikte protokol manipülasyon tanıtmak. Bu stratejinin yararlı besleme kontrol yetişkin meyve sinekleri24saat içinde üzerinde neurogenetic çalışma kanıtlanmıştır. Görsel skor yöntem hızlı bir gıda tüketim tahmini için sağlar; Böylece, çok sayıda suşları zamanında aracılığıyla tarama yararlıdır. Adayların ekrandan sonra objektif ve kesin miktar ek çalışma sağlamak için bir kolorimetrik yöntemi kullanarak ayrıntılı olarak analiz edilir.
Besleme deneyleri yanı sıra, ayrıca zorla Drosophilahedef nöronların aktive thermogenetic27,33,34,35 ve optogenetic36 yöntemleri açıklar. Nöronlar tarafından thermogenetic etkinleştirmek için işlemi basit ve kolay Drosophila ile geçici reseptör potansiyel Ankyrin nöronal uyarılabilirlik artıran bir sıcaklık ve voltaj Kapılı ba * Kanal 1 (dTRPA1), ne zaman ortam Sıcaklık 23 ° C33,37yükselir; Ancak, hayvanlar yüksek sıcaklıklarda test davranışı üzerinde olumsuz etkiler ortaya çıkarabilir. Drosophila nöronlarda etkinleştirmek için başka bir etkili yaklaşım ışığa maruz zaman nöronların uyarılabilirlik artar channelrhodopsin kırmızı kaymıştır bir türevi olan CsChrimson36ile optogenetics kullanıyor. Optogenetics daha yüksek zamansal çözünürlük ve davranışlar için daha az rahatsızlık thermogenetics daha sunuyor. Gıda alımı nicel ölçüm nöronal aktivite manipülasyon ile birleştirerek sinirsel mekanizmalar beslenme eğitimi için etkili bir yaklaşım temsil eder.
Test edilecek besleme odası ve sinekler hazırlanması ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Taotie-Gal4 sinekler modeli24kullanarak, thermogenetics ve optogenetics tarafından aktive nöron açıklar. Miktar gıda tüketim boya etiketli gıda ile iki deneyleri de iletişim kuralında açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beslenme odası hazırlanması
Not: Besleme tahlil boya etiketleme için beslenme odası iki bölümden oluşur: dış kabı (olarak bir kapak) ve iç kapsayıcı (olarak besin kaynağı).
- Bir cam şişe (31,8 mm bir iç çapı) ve 80 mm yüksekliğe Drosophila kültür için dış kapsayıcıyı değiştirmek (şekil 1A, 1 C). Kapsayıcının alt tarafını besleme Kur düzgün tutmak için % 1'özel (5 mL) tabakası ile nemlendirilmelidir ve (1B rakamüzerine) yürümeyi sinekler için yumuşak bir substrat olarak hizmet kapak. Konteyner böylece en az stres veya sinekler için karışıklık ile taşıyan bir kontrollü ama doğal ortam sunmaktadır.
- Dış konteyner hazır olun. Çift Kişilik distile su, ısı ile sık sık ajitasyon, 50 ml 0.5 g özel askıya alma ve bir manyetik karıştırıcı bir ısı plaka üzerinde tamamen erimesi için kaynatın.
- Ne zaman yaklaşık 60 ° c, % 1'özel cools 5 mL % 1'özel de boş bir konteyner (şekil 1B) dışında transfer ve kapsayıcı izin bir özel yastık verim için oda sıcaklığında soğuduktan kadar açık kalır.
- Boya etiketli yemek hazırlamak. Boya etiketli Gıda kompozisyonu farklı deneysel amaçlar göre değişir. Sadece Sükroz içeren boya etiketli gıda hazırlama örneği aşağıda verilmiştir.
- Çift Kişilik distile su, ısı ile sık sık ajitasyon, 50 ml 0.5 g özel ekleyin ve bir manyetik karıştırıcı bir ısı plaka üzerinde tamamen erimesi için kaynatın.
- Yukarıdaki % 1'özel yaklaşık 60 ° C soğuduğunda 1,71 g Sükroz 100 mM Sükroz elde etmek için özel ekleyin.
- Mavi boya (erioglaucine disodyum) 0, 25 g % 0,5 (w/v) boya etiketli gıda elde etmek için özel ekleyin.
- İçini hazırlamak kapsayıcı. Boş kapsayıcılar içinde düz yatay bir yüzeye koyun, sonra 750 eklemek µL mavi boya etiketli gıda bireysel gıda konteyner, let It en az 5 dk kuvvetlendirmek.
Not: İç 13,6 mm bir iç çapı ve 7.5 mm (şekil 1A, 1 C) yüksekliği ile küçük bir plastik tabak kapsayıcıdır. Bu boya etiketli yiyecekle dolu ve sonra özel yastık dış kabın merkezinde yer alıyor. - Bir dolu konteyner içinde hazırlanmış bir dış konteyner içine aktarmak ve özel yastık merkezinde konumlandırın. Dış konteyner duvarına yoğunlaşma boşalana kadar Oda sıcaklığı 40 min için açık kalmak besleme chambers izin.
Not: Kuru duvar duvara su damlaları ile iletişim kurarak sıkışmış olmanın üzerinden sinekler önlemek gereklidir. - Boya-free gıda ile besleme chambers hazırlamak (aynı kompozisyon ama olmadan boya) için arka plan çıkarma.
2. sinekler hazırlanması
Not: Yetişkin kadın 5-10 gün eclosion normalde kullanılan sonra deneyleri beslenmesi için uçar. Bu genetik denetimleri de dahil olmak üzere farklı genotip sinekler hazırlamak için ve buna paralel olarak test etmek için tavsiye edilir. (üzerinden bir beslenme odası) 20 sinekler bir veri noktası oluşturur.
- Yetişkin sinekler yetiştirme için nüfus yoğunluğu göz önünde bulundurun. Tipik olarak, nüfus yoğunluğu kültür şişe boyutları ve ebeveyn sinekler suşları göre sayısı değişen tarafından kontrol. Örnek olarak, bir gün sonra Kaldır yetişkin sinekler için yumurtalarını bırakmak için kadın izin ve 15 ve 30 erkek Canton-s (31,8 mm çapında) ve 80 mm yüksekliğe kültür şişeyle transfer.
- Sinekler thermogenetic harekete geçirmek için hazır olun.
- Gal4/UAS sistem38 geçiş UAS-dTrpA1 farklı GAL4 sürücü satırları (şekil 2B) sinekler tarafından dTRPA133 çeşitli nöronların olarak ifade etmek için kullanın.
- Standart gıda yetişkin sinekler 22 ° C, %60 bağıl nem ve 12 h/12 h koyu döngüsü, tutun.
- Besleme önce iki gün tahlil, sıralamak ve sinekler stereo mikroskop altında bir CO2 sinek yastık üzerinde bir taze yiyecek şişe toplamak ve şişe 20 sinekler yoğunluğu tutmak.
- Sinekler optogenetic harekete geçirmek için hazır olun.
- Gal4/UAS sistem38 farklı GAL4 sürücü satırları ile geçiş UAS-CsChrimson sinekler tarafından CsChrimson36 farklı nöronlar içinde ifade etmek için kullanın.
- Yeni eclosed (24 saat içinde) sinekler toplamak ve 400 µM all-trans-retina içeren standart gıda ile bir şişe aktarabilirsiniz.
- Erken harekete geçirmek önlemek için yetiştirme şişeleri alüminyum folyo ile sarın ve sonra sinekler istenmeyen ışık stimülasyon korumak için koyu bir kutu içine koydu. Sinekler 25 ° c, % 60 nem oranı 4-6 gün boyunca karanlıkta tut.
- İki gün önce besleme tahlil CO2 sinek defterinde stereo mikroskop altında sıralama erkek uçar. 20 sinekler bir yiyecek şişe toplamak ve besleme test önce karanlıkta tut.
- Loş ışık altında tüm işlemleri tarafından ortam ışığı neden etkileri önlemek için mümkün olduğunca hızlı bir şekilde yapmak. Çalışma alanından uzakta yerleştirilen bir LED lambası kullanmak, çalışma alanı yoğunlukta 5 µW/cm2.
Not: Açlıktan kullanım Canton-S uçar besleme tahlil için pozitif kontrol olarak. Bu sinekler gıda mahrum ve % 1'özel besleme test önce 24 h için korumak. Bu sinekleri gıda tüketim düzeyleri, günlük dalgalanmalar değerlendirmek sağlar.
3. thermogenetic harekete geçirmek
- Tüm beslenme Zeitgeber saat 4-631,32, etrafında günün aynı zamanda varyasyonları sirkadiyen ritim nedeniyle en aza indirmek için deneyler.
- Bir kuluçka (veya küçük bir oda bir ısı kontrollü ısıtıcı ile) Isıtma ortamı olarak hazırlayın.
- Davranışsal deney daha önce hazırlanan beslenme chambers, deneysel sıcaklığında (30 ° C) sıcaklık göreli üniforma besleme odası içinde olduğundan emin olmak 2 h için equilibrate.
- Besleme işlemini başlatmak için dikkatle 20 sinek--dan onların ev şişe Önceden ısıtılmış bir beslenme odasına nazik dokunarak aktarın. 60 dk ( şekil 3A) . için 30 ° C'de beslenme süreci devam
Not: Açılış ve kapaliniş belgili tanımlık kombine kuluçka makinesi kapı olumsuz beslenme davranışı gibi sık sık agitations, böylece indirilmelidir. - -80 ° C (ya da-20 ° C) besleme chambers dondurarak 60 dk az besleme için 30 dk sona.
Not: Donma besleme tüm odalarında aynı anda durdurmak için yardımcı olur. Sinekler-80 ° C'de soğuk depolama homojenizasyon için bir hafta kadar ve sinekler ötenazi için iki amaca hizmet eder. - Sıcaklık kontrol grubu için 20 sinekler odası 60 dk 22 ° C'de besleme işlemini başlatmak için boya renkli gıda ile besleme bir oda sıcaklığında içine aktarın.
- Sıcaklık kontrol grup odaları-80 ° C (ya da-20 ° C) dondurarak besleme için 30 dk sona.
4. Optogenetic harekete geçirmek
- Tüm beslenme Zeitgeber saat 4-631,32, etrafında günün aynı zamanda varyasyonları sirkadiyen ritim nedeniyle en aza indirmek için deneyler.
- Dikkatle 20 sinekler nazik dokunarak beslenme bir odaya bir şişe aktarmak ve yana doğru odası aydınlatma kurulum (şekil 4A, 4B) koymak.
- Optogenetic manipülasyon için turuncu LED dizisi kullanın (607 nm) ışık stimülasyon ve yatay pleksiglas plaka beslenme desteklemek için LED'ler yukarıda odaları aydınlatma sırasında düzeltme kaynağı olarak. Kur bir kuluçka makinesine 25 ° C de % 60 nem (şekil 4A, 4B) tutun.
- Genetik kontrol sinekler ile paralel olarak teşvik Taotie > CsChrimson uçar ama farklı besleme chambers.
- Beslenme işlemi arka aydınlatma ile 60 dk için hafif portakal tarafından devam.
- Optogenetics için en uygun aydınlatma yoğunluklarda deneysel olarak belirlemek36. İçin Taotie > CsChrimson uçar, bir yoğunluk 2,2 mW/mm2 indükler felç (gezisidir kesilmesi) ve postural kontrol kaybı bu nedenle, 0.1 mW/mm2 ara bir yoğunluk Taotie uyarmak için kullanmak > CsChrimson uçar besleme test sırasında.
- -80 ° C (veya -20 ° C) besleme odalarından dondurarak besleme için 30 dk sona.
5. görsel tahmini gıda tüketim
Not: Görsel skor yaklaşım gıda tüketimini yarı nicel bir tahmin sağlar. Optik yöntemi olarak objektif olarak olmasa da, bu yöntem çok sayıda zamanında ilk için uygun hızlı bir şekilde daha fazla testler için aday listesinde daraltmak için genetik bir ekran yuvarlak yapım o, sinek suşları geçmekte sağlar.
- Besleme işleminden sonra anestezi ve sinekler üzerinde bir CO2 sinek pad stereo mikroskopla atabilirsin. Birim ve onun karın (şekil 2A) boya renkli gıda yoğunluğu dayalı her sinek için bireysel puan verin.
Not: Ölçüt görsel tahmini için: 4 düzeyi karşılık gelen farklı birimler ve yoğunluklarda karın renkli gıda gıda alımı puan sistemi vardır.- Skor 0 puan tespit boya renkli yemeksiz uçar; Onları zayıf (ancak algılanabilir) mavi boya ile veya daha az üçte karın hacminin işgal boya renkli gıda ile 1 puan ver.
- Skor 2 puan karın yarısı işgal yoğun boya renkli gıda ile uçar.
- Karın yarısını büyük bu yoğun boyalı içerik işgal ile puanı 3 (şekil 2A) puan.
- Sinekler her deneysel koşul (şekil 2B) farklı skorları ile oranını hesaplamak.
6. Renkölçer miktar gıda tüketim
- Beslenme, bırakma dökmek bir besleme üzerinden tüm 20 sinekler kağıt ağırlığındaki bir parça Oda, sonra onlara yumuşak bir fırça kullanarak bir 1,5 mL tüp içine aktarmak.
Not: Tüm odalar-80 ° C depodan sinekler üzerinde soğuk oda su yoğunlaşma yüzünden odasının duvarına yapışmasını önlemek için aynı zamanda almayın. - PBST 500 µL tüp ekleyin ve bir öğütme değirmen 60 Hz'de 5 için kullanarak sinekler homojenize s.
- Vücut parçaları tespit parçaları yok olduğunda yeterli homojenizasyon tarafından gözlem onaylayın.
- Homogenates Enkazı temizlemek için 13000 rpm'de 30 dk için tüplerini spin.
- Santrifüjü sonra 100 µL süpernatant, 96-şey plaka bir kuyu için transfer.
- Tüm örneklerini yüklendikten sonra plaka örnekleri, 630 Absorbans ölçmek için bir plaka okuyucu içine koymak nm.
- Arka plan Absorbans kaldırmak için boya olmadan gıda süpernatant mavi gıda beslenen sinekler üzerinden bir Absorbans üzerinden beslenen sinekler üzerinden supernatants Absorbans çıkarın.
Not: Bu adım isteğe bağlıdır, kullanılan gıda besteleri bağlı olarak. Ne zaman bir sinek yemeksiz (boya) oluşturur Absorbans 630 nm, arka plan ortadan kaldırmak için bu adımı gerçekleştirmeniz gerekmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thermogenetic ekran.
Anormal derecede artan iştah yükseltilmiş gıda alımı, fizyolojik ihtiyaçlar ne olursa olsun neden olur. Biz yüksek üretilen iş tasarlamak için bu düzeni kullanıldığında nöronların genetik kolları elde etmek için davranış ekran açlık ile ilgili ve tok Birleşik (şekil 1). Ekran Taotie Gal424vermiştir. Ne zaman Taotie-Gal4 nöronlar zorla 30 ° C'de aktif Taotie > TrpA1 hafızanın büyük miktarda yiyeceği (Şekil 2, şekil 3) denetimlerden daha uçar.
Görsel olarak gıda tüketimi puanlama.
Bazı nörotransmitter ve nöropeptitler davranış beslenme Yönetmelikte belirtilen çünkü NPF20, sNPF39, octopamine21, dopamin27, de dahil olmak üzere ilgili GAL4 satırlar test ettik 40, serotonin41,42, AKH35ve Dilp27,8,35. Besleme yanıt ölçmek için görsel olarak kontrol ve tespit boya çeşitli miktarlarda sinekli gut (şekil 2A) attı. Taotie nöronlar, yaklaşık %58 aktivasyonu sonra Taotie > dTrpA1 sinekler sergilenen güçlü beslenme davranışları ve bu gösterdi hafif besleme davranışların (şekil 2B) % 23. Buna ek olarak, sadece marjinal beslenme davranışları sinekli yolu ile aktive diğer neurons ile tespit edildi dTrpA1 (şekil 2B).
Gıda alımının Renkölçer miktar.
Gıda alımı yüksek kesinlik ve nesnellik ölçmek için belirli bir dalga boyu, sinek ekstraksiyon gıda2,27,28eklenen boya Absorbans ölçülür. Bir Absorbans değeri gıda alımı hacmi ile ilişkilendirmek için standart bir eğri örnek çözümler (uçar, PBST homojenizasyon için aynı arabellek) Absorbans ölçerek oldu elde edilen boyalar farklı miktarda ile karışık). Bizim sonuçları göstermek gibi akut Taotie-GAL4 nöronlar düşündüren aynı testi döneminde (şekil 3B), genetik kontrol ve sıcaklık kontrolü ile karşılaştırıldığında TRPA1 büyük ölçüde artan gıda alımı tarafından harekete geçirmek Taotie-GAL4 etiketli nöronlar yetişkin Drosophilagıda alımı yönetmelikte katılmak.
Optogenetic harekete geçirmek Drosophilagıda alımı teşvik etmek.
UAS -CsChrimson Taotie nöronlar bir turuncu ışık36 (şekil 4A, 4B) ile aydınlatma tarafından etkinleştirmek için kullanılır. Ne zaman Taotie > CsChrimson sinekler LED ışıklar, 607 tarafından teşvik nm, önemli ölçüde daha fazla gıda denetimleri (şekil 4 c) daha yutulur. Ayrıca, alınan gıda miktarda de stimülasyon ışık (şekil 4 d) yoğunluklarda ile ilişkili. Böylece, dTrpA1 ile thermogenetics yanı sıra optogenetic harekete geçirmek CsChrimson ile Taotie nöronlar içinde Ayrıca tok sinekler besleme motivasyon teşvik etmektedir.
Resim 1 . Yetişkin sinekler iştah analiz etmek için beslenme bir paradigma. (BeslemeA) odası içeren bir iç boya renkli gıda ve % 1'özel ile yastıklı bir dış konteyner konteyner dolu. Soldan sağa doğru iç kapsayıcı, dış konteyner ve tam beslenme odası. (B) iç kapsayıcı dış konteyner alt kısmında özel yastık üstüne oturur. (C) yukarıdan besleme odası. (D) A şematik gösterilen "iştah ekran" deney. Normal tok sinekler nadiren gıda (sol şişe) yedi, zorla etkinleştirilirken belirli besleme kontrol nöronlar ek gıda, böylece boya renkli gıda karın (sağ şişe) sergilenmesi yemek tok sinekler neden oldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Gıda alımından görsel tahmini. (A)suret görüntüleri karnından gıda içeriği puanlama ölçütünü göstermek için. (B) puanları ile belirtilen nöronlar dTrpA1 30 ° C'de tarafından aktive ediliyor sinekli beslenme dağıtım No-Gal4: UAS-dTrpA1 (genetik kontrolü); NPF-GAL4: peptit F olumlu nöronlar; sNPF-GAL4: kısa peptit F olumlu nöronlar; TDC1-GAL4 ve TDC2-GAL4: octopamine nöronlar; TH-GAL4: dopamin nöronlar; 5-HT: serotonin nöronlar; AKH: adipokinetic hormon olumlu nöronlar; dip2: İnsülin benzeri peptid 2 pozitif nöronlar; Taotie-GAL4: Taotie-GAL4 nöronlar etiketleri (n = koşul başına 120 sinekler). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Thermogenetic aktivasyonu Taotie nöronlar yetişkin sinekler gıda tüketimini artırır. (A) bir görüntü thermogenetic harekete geçirmek deneme kurulumu gösterir. Besleme test bir kuluçka 30 ° C'de gerçekleştirildi (B) gıda tüketim Renkölçer miktar tok sinekler tarafından test 30 ° C veya 1 h. için 22 ° C Tek bir sineğin gıda Tüketim miktarı o bir beslenme Odası 20 sinekli hesaplanmıştır (n = 6). tutarak gösterir değil önemli (p > 0,05); p < 0,001. Tek yönlü ANOVA Tukey'nın post hoc testi ile takip birden fazla karşılaştırmalar analiz etmek için kullanıldı. Hata çubukları belirtmek ortalama ± SEM Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Optogenetic-Taotie nöronlar aktivasyonu bir yoğunluk bağımlı şekilde gıda alımı miktarını artırır. (A, B) Optogenetic harekete geçirmek için kurulumu iki görünümünü. Besleme Chambers'ı destekleyen bir plaka üzerinde yan ve alt aydınlatmalı turuncu LED dizisi tarafından atılmıştır. Ön Aydınlatma kutusunun içini göstermek için kaldırıldı LED. Davranışsal deney bir kuluçka 25 ° c, % 60 RH içinde gerçekleştirilmiştir. (C) gıda tüketim optogenetic aydınlatma altında veya 1 h için karanlıkta test edilirken belirtilen genotip tok uçar (n = 6). (D) yemek yenmesi ile tok Taotie > CsChrimson sinekler aydınlatma yoğunluğu ile ilişkili (n = 6). tutarak gösterir değil önemli (p > 0,05); p < 0,001, tek yönlü ANOVA Tukey'nın post hoc testi ile takip birden fazla karşılaştırmalar, öğrencinin tçözümlemek için kullanılan-test için iki grup karşılaştırmalar. Hata çubukları belirtmek ortalama ± SEM Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu rapor besleme deneyleri boya etiketleme gıda tüketimi bağlamında thermogenetic teknik bir işlem üzerinde odaklanır ve optogenetic harekete geçirmek nöronlar işlemek için kontrol besleme. Bu basit ve güvenilir iletişim kuralı işlevi besleme kontrol, sinekler gıda tercih ölçmek ve besleme kontrol devreleri genetik ekranlar besleme tabanlı24üzerinden yeni oyuncular belirlemek için aday nöronların aydınlatmak için yardımcı olacaktır.
Strateji etiketleme boya kısa süreli beslenme davranışları soruşturma mümkün olabilir. Boya, erioglaucine disodyum, içinde çözünmüş ve gıda ile yutulur gıda tüketimi önemli bir göstergesidir. Deshpande vd. mavi boya CAFE tahlil ve gıda alımı tahlil17etiketleme Radyoizotop tarafından ölçülen zaman besleme üzerinde hiçbir etkisi gösterdi gösterdi. Benzer şekilde, başına sonuçlarımız (sinek 's bacak boya etiketli veya boya ücretsiz 100 mM Sükroz çözüm ile uyarıcı) sinekler boya etiketli veya boya ücretsiz Gıda doğru yanıt anlamlı bir fark sergilenen belirtti. Ancak, hala boya Drosophilaiçinde tatsız olup olmadığı ile ilgili net bir veri vardır.
Ayrıca kritik adımları belirtilen iletişim kuralı ' general belirli dikkat durumu test edilecek Sineklerin Tanrısı. Yanında ve yetiştirilen bir kalabalık olmayan yoğunluğuna muhafaza, sinekler yavaşça ele alınmalıdır ve tutarlı besleme sonuçlar üretmek için gereksiz şok veya vurguluyor, kaçının.
Burada sunulan besleme paradigma belirli sınırlamaları vardır. İlk olarak, bizim yöntemleri gıda tüketimi 60 dk süre içinde ölçmek. Bir gün gibi daha uzun süre üzerinde gıda alımı değerlendirmek için farklı bir yöntem, CAFE gibi gerekli olacaktır. İkincisi, radioisotopes kullanarak miktar yöntemleri ile karşılaştırıldığında, daha az miktarda gıda tüketimi düşük olduğunda farklılıkları gidermek zor ve hassas kolorimetrik yöntemi bu. Üçüncü olarak, bazı sinekler besleme başladıktan sonra 15 dk kadar erken taburcu etmek başlayacaktı göz önüne alındığında, bu iletişim kuralı aslında gıda alımı ve boşaltım nüfus17net sonucu ölçer. Dördüncü olarak, sinek bir grup, tek bir sineğin gıda alımından tahmini Radyoizotop etiketleme gibi diğer beslenme deneyleri, MAFE tahlil veya FlyPAD göre değişir için burada açıklanan gıda alımı Renkölçer miktar oldu. Bununla birlikte, gıda alımı, basit, istikrarlı, görünür ve yüksek üretilen iş yöntemi, varlık gibi Renkölçer miktar bazı avantajları o miktar suşları, çok sayıda için birinci sınıf bir seçim yapmak için özellikle beslenme tabanlı genetik ekranlar ve izleme çalışmaları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.
Acknowledgments
Bu eser kısmen desteklenen Ulusal temel araştırma programı Çin (2012CB825504), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (91232720 ve 9163210042), Çin Academy of Sciences (CAS) (GJHZ201302 ve QYZDY-SSW-SMC015), Bill ve Melinda Gates Y. Zhu CA'lara Vakfı (OPP1119434) ve 100-meziyet Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels - Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
