Summary
בפרוטוקול הנוכחי מציג ניסיוני ההליכים כדי להמריץ מקרופאגים בתרבית כדי להיות ניחן היכולת לשחרר מולקולרי גורמים המקדמים neurite תוצר. טיפול של מחנה לתרבויות המשנה נוירון-מקרופאג המניע את המקרופאגים לייצר בינוני ממוזגים שמחזיק neurite חזק תוצר פעילות.
Abstract
יש ראיות חזקות מקרופאגים יכולים להשתתף התחדשות או תיקון של מערכת העצבים פצועים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שבו המקרופאגים הם המושרה לבינונית התוצרת ממוזגים (ס מ) המקדמת תוצר neurite. שורש העזוב למבוגרים גנגליון (DRG) נוירונים בחריפות הפומבית, מצופה. לאחר הנוירונים stably מחוברים, מקרופאגים הצפק הם שיתוף בתרבית על הוספה תרבות תאים בשכבות על אותו טוב. Dibutyryl שמחזורי AMP (db-מחנה) מוחל על התרבויות שותף במשך 24 שעות, לאחר מכן להוסיף התרבות התא המכיל את המקרופאגים מועבר היטב אחר כדי לאסוף ס מ עבור 72 h. ס מ התרבויות שיתוף שטופלו db-מחנה, כאשר חל נפרדות למבוגרים DRG נוירון תרבות, תערוכות פעילות תוצר neurite חזקים. ס מ שהתקבל מן התרבויות db מחנה-שטופלו המורכב סוג תא בודד לבד, DRG נוירון או מקרופאג הצפק, לא להפגין פעילות תוצר neurite. אפשרות זו מציינת כי האינטראקציה בין הנוירונים ו מקרופאגים היא הכרחית עבור ההפעלה של מקרופאגים הפרשת גורמים מולקולרית עם פעילות תוצר neurite ס מ. לפיכך, הפרדיגמה תרבות משותפת שלנו גם יהיה מועיל ללמוד איתות המערכת באינטראקציה נוירון-מקרופאג כדי לגרות את המקרופאגים כדי להיות ניחן הפנוטיפ משובי pro.
Introduction
מגוון רחב של מחקרים ניסו לשפר את מערכת העצבים המרכזית האקסון חידוש לאחר הפציעות של חוט השדרה או המוח. תגובות דלקתיות, באופן בלתי נמנע המלווה את הפגיעה במערכת העצבים, נחשבים באופן מסורתי להשתתף משני תהליכים פתולוגיים שמוביל התוצאות המזיקות1,2. אכן, מתילפרהדניזולון יכול לדיכוי תגובות דלקתיות הוא הטיפול היחיד שאושרו עבור פגיעה בחוט השדרה חריפה3. עם זאת, מחקרים מאוחרים יותר סיפקו ראיות כי מקרופאגים, סוג תאים דלקתיים נציג, יכולים להשתתף התחדשות או תיקון של מערכת העצבים פצועים-4,-5,-6. לדוגמה, שחדר מקרופאגים בעקבות של עדשה פציעה תוצרת פרו משובי מולקולות רגנרציה של גנגליון נוירונים7,8. בנוסף, נוירונים DRG המושתלים גדל האקסון הצמיחה את האזור שבו מקרופאגים הופעלו על ידי zymosan9. יתר על כן, המקרופאגים באתר הנגע יכול ליצור וחשש צמיחה-מתירני העצבים ההיקפיים נפגעים10.
העבודה שלנו גם סיפק ראיות חזקות מקרופאגים יכול לתרום הקיבולת של האקסון התחדשות של נוירונים סמוכים. הראינו כי ההפעלה של מקרופאגים, הגרעינים העזוב שורש (DRG) היו חיוניים ביכולת הרגנרציה משופרת של DRG החישה הניריונים בעקבות היקפי preconditioning עצב פציעה11. מחקר דומה נמסר באופן עצמאי מן המעבדה עוד12. גם הראנו כי הזרקת intraganglionic dibutyryl מחזורי AMP (db-מחנה), אשר הוא מולקולה ידועים כדי לשפר את היכולת של האקסון התחדשות13, המושרה את ההפעלה של מקרופאגים. שחרור משרות של מקרופאגים ביטל את ההשפעות של db-מחנה על פעילות תוצר neurite. עבודות עוקבות זיהו פגיעה-induced ביטוי CCL2 בנוירונים בתור אות להמריץ מקרופאגים עם פנוטיפ משובי pro14,15.
בהתבסס על תוצאות הניסוי הנ ל, הקמנו במבחנה מודל הדומה האירועים המולקולריים המתרחשים DRGs בעקבות preconditioning פגיעה דגם11,14. במודל זה, db-מחנה מוחל על התרבויות שיתוף נוירון-מקרופאג העלאת המערכת איתות. שמוביל ההפעלה של מקרופאגים עם פנוטיפ משובי pro. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים מפורט שבו אפשרי לייצר המקרופאגים להפריש מולקולרי גורמים קידום neurite תוצר (איור 1). מודל ניסיוני זה ממחיש רעיון כי מקרופאגים יכול להיות מגורה או המושרה לתמוך התחדשות האקסון בעקבות הפציעות למערכת העצבים. המודל שלנו גם יהיה שימושי בלימוד מנגנוני איתות המערכת שמוביל ההפעלה של מקרופאגים משובי pro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים המערבות בעלי חיים אושרו על ידי מוסדיים חיה אכפת ועל שימוש הוועדה של ד אלעג'ו הספר לרפואה של אוניברסיטת.
1. תרבות הכנה של נוירון הפומבית DRG למבוגרים
- לפני הגדרת התרבות, מעיל מראש צלחת 6-ובכן עם פולי-D-ליזין ו laminin. דגירה צלחת 6-ובכן עם 0.01% פולי-D-ליזין ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת פעמיים עם מים מזוקקים.
- דגירה לצלחת עם פתרון laminin ריכוז של 3 µg/mL עבור 2 h בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף את הצלחת פעמיים עם מים מזוקקים. יבש את הצלחת בטמפרטורת החדר לפחות לשעה.
- המתת חסד עכבר בתוך תא2 ושות שקופה מחובר צילינדר גז דחוס של2 CO. פצעים וחתכים בעור המכסים את עמוד השדרה עם להב כירורגי ומנתחים את השרירים הבין-חולייתיים דו צדדיים לחשוף את העצמות בחוליות. הסר את העצמות בחוליות בקפידה בעזרת rongeur כירורגית שקצהו צר עד DRGs חשופים לגמרי.
הערה: נוירונים בוגרים DRGs מתקבלים מן הבוגרים C57BL6 זכר עכברים בגילאי 8 שבועות עד 12 שבועות. - הסר את DRGs באופן דו-צדדי ו- S1 כל הדרך עד רמת C1 באמצעות מספריים iridectomy ומלקחיים שקצהו הקנס תחת מיקרוסקופ ויבתר. נסו לחתוך את השורשים וזכר DRGs כדי למזער את הזיהום של תאי שוואן או fibroblasts.
- אחסן את DRGs גזור 60 מ מ המכיל 5 מ"ל של Dulbecco קר ששינה נשר בינוני (DMEM) על הקרח עד שכל DRGs נאספים צלחת פטרי.
הערה: חיוני כדי לנתח את DRGs מהר ככל האפשר. לא, האוסף של כל DRGs של עכבר אחד אמור להימשך יותר מ-30 דקות 30 דקות לאחר המתת החסד, לעצור את איסוף של DRGs, להמשיך לשלב הבא, גם אם עדיין נותר DRGs. - להעביר את DRGs mL 1.5 צינור גלאים באמצעות טיפ כחול פיפטה (1000 µL) עם קצה ניתוק. הסר את DMEM לאחר סיבוב מהיר למשך מספר שניות בעזרת צנטריפוגה מיני. להוסיף 1 מ"ל של DMEM המכילה 125 U/mL סוג XI collagenase, דגירה הצינור במשך 90 דקות עם סיבוב עדין (35-40 סל ד) בעזרת מטרף טוויסטר ב חממה 37 ° C. לשתק את הצינורית על הרצפה שאכר בעזרת הטייפ.
- התעלם collagenase המכילים DMEM ולהוסיף 1 מ"ל של DMEM טריים. המתן עד DRGs צף לחלוטין שקעו ולאחר מכן הסר את DMEM עם ההריסות רקמות. חזור על שלב זה כביסה לפחות שש פעמים.
הערה: אל תנסו למחוק לחלוטין את תגובת שיקוע. יש להיזהר לא להסיר את כל DRGs עם DMEM supernatant. - להעביר את DRGs צינור חרוטי 15 מ"ל באמצעות טיפ כחול פיפטה (1000 µL) עם קצה ניתוק. ואז פיפטה למעלה ולמטה בעדינות לפחות 15 פעמים באמצעות טיפ כחול (1000 µL) כדי להפוך השעיה תא הומוגנית. להימנע מביצוע בועות ולנסות לא תיגע בתחתית של התחתית חרוט עם טיפ פיפטה.
- Centrifuge את הצינור ב g x 239 למשך 3 דקות וזורקים בקפידה את תגובת שיקוע עם צף פסולת. להוסיף 1 מ"ל של מדיום Neurobasal בתוספת B27 (v 2.0% / v) ו- resuspend בגדר תא על-ידי pipetting בעדינות לאורך 5 כדי 10 פעמים.
- עוברים התליה תא מסננת תא 70-מיקרומטר בשכבות מעל צינור חרוטי 50 מ. לחכות 2 דקות, ואז לשפוך Neurobasal/B-27 בינוני על גבי מסננת באמצעות בקר פיפטה.
- צלחת כל שנאספו DRG נוירונים (סך של נוירונים DRG6 2 x 10 משוער של עכבר אחד) על גבי שתי בארות צלחת 6-. טוב. DRG נוירונים של עכבר בוגר אחד מכסה שתי בארות בצלחת 6-. טוב. ואז למקם את הצלחת חממה2 CO ב 37 ° C עד מקרופאג שיתוף תרבויות.
2. תרבות משותפת של מקרופאגים הצפק rimary P-A תא תרבות הכנס
הערה: להקים התרבויות שיתוף 4 שעות לאחר ציפוי הראשונית של הנוירונים DRG dissociated
- מקרופאגים הצפק העיקרי מוכנות מן הבוגרים C57BL6 זכר עכברים בגילאי 8 שבועות עד 12 שבועות. המתת חסד חיה בחדר2 CO. פצעים וחתכים בעור בטן בעדינות, לחשוף את הצפק ולהימנע חיתוך של הצפק כדי למנוע של דליפה של נוזל שטיפה.
- לנקב את הצפק באמצעות מזרק עם מחט 22 גרם ולהזריק 10 מ"ל של סאלין באגירה פוספט כקרח (PBS) לתוך חלל הצפק. לעסות בעדינות את הצפק למשך 1-2 דקות. לאחר מכן, להוציא את המחט, לסחוט PBS דרך החדירה המחט ולאסוף נוזל שטיפת צינור חרוטי 50 מ.
הערה: לפני השימוש, יש לשים את המזרק על קרח כדי לשמור על קור, טוב, מגניב. - Centrifuge נוזל שטיפת ב 239 g x 10 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה את מרכיבי התא. Resuspend בגדר עם 3 מ"ל של המאגר פירוק תאי הדם האדומים (RBC) למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. ואז centrifuge התליה תא שוב ב 239 g x 10 דקות ב 4 º C. Resuspend בגדר עם 3 מ"ל של PBS, centrifuge התליה תא שוב כדי להסיר את כל מאגר פירוק RBC הנותרים.
הערה: ודא שהמאגר פירוק RBC מוסר לחלוטין. אחרת מאגר הנותרים של פירוק RBC עשוי להיות רעיל מקרופאגים בתרבית. - Resuspend תאי pelleted 1 מ"ל של Neurobasal/B-27 בינוני. צלחת מחצית מקרופאגים שנאספו כל (סך של 3 × 106 על 6 x 106 תאים) על תרבות תא להוסיף עם שטח אפקטיבי של 4.2 ס"מ2, אשר תמוקם מעל הבאר של חלופה מועדפת DRG.
הערה: במהלך תקופת תרבות משותפת, מקרופאגים גדלים Neurobasal/B-27 נוירון תרבות בינוני. הישרדות נאותה של מקרופאגים תחת תנאי זה אושר.
3. טיפול של Db-מחנה ואוסף של מקרופאג ס מ
הערה: להתחיל טיפול db-מחנה 4 שעות לאחר התרבויות שיתוף נוירון-מקרופאג.
- להוסיף 2 µL של 100 מיקרומטר db-מחנה פתרון התרבויות שיתוף מקרופאג נוירון. להוסיף באותו אמצעי אחסון של PBS עבור ניסוי שליטה.
- לאחר 24 שעות, למלא טוב ריק של 1 מ"ל של תרבות מקרופאג במדיום באותה צלחת 6-. טוב. להעביר את תותב תרבות תא בתרבויות שיתוף נוירון-מקרופאג הבאר ריקה מקרופאג תרבות בינונית. שמור את התאים תחת התנאי זהה עבור 72 h מבלי לשנות את המדיום.
הערה: אנו מוסיפים רק 1 מ"ל מקרופאג בינוני תרבות במהלך אוסף ס מ כדי להפוך מרוכז ס מ. במהלך איסוף ס מ, במידת הצורך, הוספנו עוד לכסות לגמרי את המקרופאגים בתוך תותב. - לאחר 72 h, centrifuge את מקרופאג ס מ- 239 g x עבור 5 דקות כדי להסיר את מרכיבי התא. עוברים את תגובת שיקוע מסנן 0.2-מיקרומטר כדי להסיר את כל פסולת הסלולר הנותרים. לאחסן את ס"מ שנאספו ב-70 מעלות צלזיוס עד השימוש.
4. תוצר Neurite Assay עם שנאספו ס מ
- לפני הגדרת תרבות נוירון DRG נפרדות למבוגרים, מראש מעיל של שקופיות הקאמרית 8-ובכן, באותו ההליך המתואר 1.1 ו- 1.2.
- להשיג הפומבית של נוירונים DRG למבוגרים בינוני Neurobasal בתוספת B27 באותן שיטות תיאר מ 1.3 1.10. צלחת 5 x 104 תאים לכל טוב על גבי השקופית הקאמרית 8-ובכן מצופים מראש.
- מקום השקופית הקאמרית חממה 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, המאפשר את התאים לצרף התחתון. לאחר מכן, החלף המדיום תרבות ס מ המופשרים זה היא טרופה ב 37 º C.
הערה: היזהרו לא לגעת בקרקעית של השקופית הקאמרית 8-ובכן בעת הסרת המדיום תרבות, הוספת את ס מ שנאספו. - h 15 לאחר ציפוי הראשונית, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם PBS פעם אחת. לאחר מכן, הוסף 200 µL של פתרון paraformaldehyde 4% קר כקרח הבארות ולאחר דגירה התאים עם הפתרון paraformaldehyde עבור 20 דקות ב 4 ° C
הערה: תרבות נוירון DRG assay תוצר neurite צריך להיות מוגבל בדיוק 15 h. תחת תנאי זה, יש אין תוצר neurite ניכר. - לשטוף שלוש פעמים עם PBS קר כקרח ולאחר מכן לבצע חסימת עם 10% סרום עז רגילה (הגדרות) עם 0.1% טריטון-X במשך 30 דקות דגירה התאים קבוע עם נוגדן ראשוני (anti-Tuj-1) הפתרון מדולל עם 10% המיתרים (על ריכוז של µg 1/mL) במשך 4 שעות בחדר טמפרטורה או לילה ב 4 º C.
- לשטוף שלוש פעמים עם PBS ולאחר מכן דגירה התאים עם נוגדנים משניים (עז-אנטי עכבר) פתרון 2 h בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף פעמיים עם PBS והר השקופית תרבות עם coverslip (24 × 50 מ"מ) באמצעות הרכבה פתרון.
- קח תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות להמחיש תוצר neurite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מתארים פרוטוקול שיכולות לייצר מקרופאגים מסוגל הפרשת גורמים מולקולרית עם פעילות תוצר neurite. מקרופאג ס מ שהתקבל מן התרבויות שיתוף שטופלו db-מחנה הביא תוצר neurite חזקים כאשר חל על תרבות נוירון DRG נפרד (איור 2 א). לשם השוואה, ס מ שהתקבל מן התרבויות שיתוף שטופלו PBS לא לגרום neurite תוצר במשך 15-h התרבות שלנו (איור 2B). כאשר db-מחנה מטופלת לתרבות עם מקרופאג לבד, ס מ. השיג ממצב זה לא היה יעיל בתמיכה neurite תוצר (איור 2C). הדבר מצביע על אינטראקציה מקרופאג נוירון זה חיוניות כדי להמריץ מקרופאגים כדי להיות ניחן קיבולת proregenerative. בדקנו גם אם ס מ המתקבל db מחנה-שטופלו נוירון בלבד תרבות ולא מצאו שום תוצר neurite (איור דו-ממדי).
איור 1: תרשים סכימטי הממחישות את ההליכים כדי להשיג ממוזגים בינוני המכיל פעילות תוצר neurite. DRG למבוגרים נוירונים (2 x 106 תאים לכל מכל קידוח) מתורבתים במשך 4 שעות. לאחר מכן, מקרופאגים הצפק מתורבתים ב insert טוב, הממוקם מעל הבאר ב DRG אילו נוירונים היו תרבותי. 4 שעות לאחר ציפוי, מטופלת במחנה PBS או dibutyryl. לאחר דגירה 24 שעות ביממה, תותב טוב מועבר היטב עוד מלא כ 1 ml בינוני. . אז, שהועברו טוב מודגרת למשך 72 h. לאחר מכן, נאסף המדיום ממוזגים incubated (ס מ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: נציג תוצאות השימוש neurite תוצר assay ממוזגים בינוני המתקבל לתנאים שונים. (A, B) נוירונים DRG למבוגרים היו בחריפות הפומבית תרבותי עבור בדיוק 15 ח' 2 h לאחר ציפוי, תרבות בינוני הוחלף ממוזגים בינונית (ס מ) המתקבל נוירון-מקרופאג תרבויות המשנה מטופלים עם PBS (א) או מחנה dibutyryl (db-מחנה) (B). רק ס מ שטופלו db-מחנה הציג פעילות תוצר neurite חזקים. (C, D) ס מ המתקבל תרבויות המורכב או מקרופאג (C) או נוירון (D) לבד שטופל עם db-מחנה לא תמכו neurite תוצר. סולם מציינות 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם מספר שלבים קריטיים עבור הדור של מערכת זו תרבות משותפת. זה חשוב להבטיח העכבר DRG נוירונים ו מקרופאגים הצפק מוכנים טרי ובריא. שאנו חווים neurite מופחתת פעילות תוצר של ס מ ניתוח כל DRGs לקח יותר מ 30 דקות. בנוסף, הזיהום של רכיבי הדם מקרופאגים הצפק גם הובילו לירידה של neurite תוצר פעילות ס מ. כדי להפיק נוירון חזקים-מקרופאג אינטראקציה מאת db-מחנה, שטיפה יהיה גם שלב קריטי כדי להבטיח הסרה מלאה של פסולת רקמות ולמניעת שעשוי להיות שנותרו ציטוטוקסיות רכיבים, כגון collagenase או RBC פירוק המאגר. נקודה נוספת כדי להיות והדגשתי היא כי שורשי המצורפת DRGs יש להסיר ככל האפשר. הנותרים הספחים של שורשים יגביר את הזיהום של תאי שוואן בתרבות נוירון DRG. תאי שוואן יכול לייצר כמות גבוהה של גורמים neurotrophic בתרבות העלולים לבלבל את התוצאות.
ב פרוטוקול זה, מקרופאגים הפומבית מצופים על הוספה תרבות התא הופרדו הנוירונים DRG מצופה בתחתית הצלחת היטב. המחקר הקודם שלנו לא הראה הבדל משמעותי על היקף פעילות תוצר neurite בין CMs ביותר שנאספו מתרבויות שיתוף ישיר (המאפשר קשר פיזי בין סוגי תא שני), התרבויות שיתוף עם תא שני סוגי המופרדים תרבית תאים להוסיף11. תוצאה זו יצוין כי נוירונים ו מקרופאגים מתקשרים אחד עם השני באמצעות מולקולות מסיסים שוחררו גם סוג התא, לא על ידי אנשי קשר פיזי ישיר. זה היה מראה כי CCL2, המופרשים DRG הנוירונים, אחראי על הפעלת מקרופאגים לתוך הפנוטיפ משובי pro דגם14זה תרבות משותפת. לפיכך, מערכת תרבות משותפת שלנו יאפשר הבהרה של איתות המערכת מפורט יותר המעביר את ההפעלה של מקרופאגים משובי pro.
התרבות הוגבל בדיוק 15 h במהלך neurite תוצר וזמינותו של פרוטוקול זה. בניסויים פיילוט, אנחנו בדק כמה זמן תרבות שונים ומצא כי עם גבול מינימלי של תוצר neurite במצב שליטה (15 שעות), תוצר neurite חזקה מאוד הושגה עם ס מ מטופלים עם db-מחנה. העכבר DRG הנוירונים, אם לא preconditioned, לא צומחים כל neurites משמעותי במסגרת זמן זו. אם DRG נוירונים מתורבתים יותר 15 h, עם זאת, הם מתחילים להראות מידה מסוימת של תוצר neurite אפילו בשליטה, מצב לא preconditioned, אשר יטשטש השפעה ס מ db מחנה-שטופלו על תוצר neurite. תוצאה דומה דווח וזמינותו תוצר neurite באמצעות החולדה הנוירונים DRG ב מחקר קודמות16.
מחקרים קודמים משמש zymosan, הכנה דופן התא שמרים, להפעלת מקרופאגים עם פנוטיפ משובי pro7,9. עם זאת, המקרופאגים מגורה על ידי zymosan שוחרר לא רק מולקולות פרו-ההתחדשות, אלא גם גורמים ציטוטוקסיות. כאשר רכיבי חלבון מקרופאג ס"מ שטופלו zymosan היו מופרדים על ידי ג'ל-סינון כרומטוגרפיה, מקרופאג נגזר גורמים ≥ kDa 30 היו ציטוטוקסיות בעוד גורמים ≤ kDa 30 קידום התחדשות אקסון7. בנוסף, הזרקת zymosan בחוט השדרה יכול להוביל למוות עבירה של נוירונים, אקסונים9. לשם השוואה, פרוטוקול שלנו כדי להפיק מקרופאגים pro משובי הראתה להיות הפיזיולוגיות יותר מזו הקודמת באמצעות zymosan. למעשה, db-מחנה הזרקה אל הנוירונים DRG שיפור היכולת שלהם אקסונים צמיחה בעקבות פציעה הסניף המרכזי ללא כל דוח על נזקים הסלולר17,18. לאורך כל סדרת הניסויים שלנו, אף פעם לא הבחנו כל ירידה משמעותית של צפיפות נוירון DRG בתרבות בעקבות בקשה ס מ db-מחנה-מטופלים. אנו משערים כי הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לייצר מקרופאגים משובי אך ורק pro ללא neurotoxicity בו-זמניות. לכן, הפרוטוקול ואת דגם ניסיוני דיווחו כאן יהיה שימושי לזיהוי מולקולרי חתימות של מקרופאגים משובי pro ו להבין על ידי איזה מנגנונים פנוטיפ pro משובי מפותח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
פרוטוקול זה נתמך על ידי מענק ה-NRF-2015R1A2A1A01003410 משרד המדע, טכנולוגיית מידע, תכנון העתיד, הרפובליקה של קוריאה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors - Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
References
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Festoff, B. W., et al. Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury. J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).
- Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate. Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).
- Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling. Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).
- DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. Neuroinflammation: the devil is in the details. J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).
- Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).
- Yin, Y., et al. Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration. J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).
- Yin, Y., et al. Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells. Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).
- Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).
- Kwon, M. J., et al. Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury. J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).
- Niemi, J. P., et al. A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration. J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).
- Hannila, S. S., Filbin, M. T. The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).
- Kwon, M. J., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism. Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).
- Cafferty, W. B., et al. Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice. J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).
- Cai, D., et al. Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate. J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).
