Summary
ويقدم البروتوكول الحالي إجراءات تجريبية لحفز الضامة مثقف أن تتمتع بالقدرة على إطلاق سراح الجزيئية العوامل التي تعزز ثمرة نورت. علاج مخيم إلى ثقافات المشارك العصبية-بلعم يستحث الضامة لإنتاج مكيفة المتوسطة التي تمتلك قوي نورت ثمرة النشاط.
Abstract
وهناك أدلة قوية على أن الضامة يمكن المشاركة في تجديد أو إصلاح الجهاز العصبي المصاب. هنا، نحن تصف بروتوكول الذي يتم التي يسببها الضامة إلى متوسط إنتاج مكيفة (سم) يعزز ثمرة نورت. حادة فصل الكبار الظهرية جذر العقدة (DRG) الخلايا العصبية ومطلي. بعد ثابت يتم إرفاق الخلايا العصبية، الضامة البريتوني تربى المشترك على إدراج ثقافة خلية مضافين على نفسه جيدا. يتم نقل ديبوتيريل دوري أمبير (db-مخيم) يتم تطبيقه على ثقافات المشارك ح 24، بعد إدراج ثقافة الخلية تحتوي على الضامة إلى بئر أخرى لجمع سم ح 72. سم من ثقافات المشارك تعامل مع db-مخيم، عندما يطبق على ثقافة العصبية DRG الكبار منفصلة، يسلك نورت قوية ثمرة النشاط. سم تم الحصول عليها من ثقافات db-مخيم-معاملة تتكون من خلية واحدة نوع وحدها، أما من العصبية DRG أو بلعم البريتوني، لا يحمل نورت ثمرة النشاط. وهذا يشير إلى أن التفاعل بين الخلايا العصبية والضامة لا غنى عنها لتفعيل الضامة إفراز العوامل الجزيئية مع نشاط ثمرة نورت في سم. وهكذا، كما ستكون مفيدة لدراسة الإشارات بين الخلايا في التفاعل بلعم العصبية لحفز الضامة أن هبت النمط الظاهري برو-التجدد نموذجنا ثقافة المشارك.
Introduction
مجموعة متنوعة من دراسات سعت إلى تعزيز التجدد إكسون الجهاز العصبي المركزي بعد الإصابات النخاع الشوكي أو الدماغ. ويعتقد تقليديا ردود الفعل الملتهبة، حتما المصاحبة للإصابات في الجهاز العصبي، للمشاركة في العمليات المرضية الثانوية مما يؤدي إلى نتائج ضارة1،2. وفي الواقع، هو methylprednisolone التي يمكن قمع ردود الفعل الملتهبة العلاج المعتمدة فقط ل إصابات النخاع الشوكي الحادة3. ومع ذلك، قدمت دراسات أكثر حداثة الأدلة أن الضامة، نوع خلية الملتهبة ممثل، يمكن المشاركة في تجديد أو إصلاح الجهاز العصبي المصاب4،،من56. على سبيل المثال، تسلل الضامة عقب عدسة إصابة جزيئات برو-التجدد منتجات لتعزيز تجديد العقدة الشبكية العصبية7،8. وبالإضافة إلى ذلك، زيادة زرع الخلايا العصبية DRG إكسون النمو يصل المنطقة حيث تم تفعيل الضامة قبل زيموسان9. وعلاوة على ذلك، يمكن إنشاء الضامة في موقع الآفة بيئة نمو متساهلة لإصابة الأعصاب المحيطية10.
عملنا أيضا قدمت أدلة قوية على أن الضامة يمكن أن تسهم في قدرة التجدد إكسون في الخلايا العصبية المجاورة. وقد أظهرنا أن تم تفعيل الضامة في العقد الجذرية الظهرية (DRG) عنصرا أساسيا في تعزيز قدرة التجدد DRG الخلايا العصبية الحسية عقب preconditioning الطرفية العصبية إصابة11. وذكر إجراء بحوث مماثلة بشكل مستقل من مختبر آخر12. ونحن كما أظهرت أن حقن إينتراجانجليونيك من ديبوتيريل سيكليك أمبير (db-مخيم)، وجزيء معروفة جيدا لتعزيز قدرة التجدد إكسون13، الناجم عن تفعيل الضامة. إبطال مفعول الضامة إلغاء آثار db-مخيم على نورت ثمرة النشاط. وحددت الأعمال اللاحقة التعبير الناجمة عن الإصابة من CCL2 في الخلايا العصبية كإشارة لحفز الضامة مع النمط الظاهري برو-التجدد14،15.
استناداً إلى النتائج التجريبية المذكورة أعلاه، وقد أنشأنا نموذجا في المختبر تشبه الأحداث الجزيئية التي تحدث في باﻷسعار عقب إصابة نموذج11،بريكونديتيونينج14. في هذا النموذج، يتم تطبيق db-مخيم ثقافات المشارك العصبية-بلعم التماس بين الخلايا مما يشير إلى أن يؤدي إلى تفعيل الضامة مع النمط الظاهري برو-التجدد. هنا، نحن وصف مفصل البروتوكولات التي يمكن أن تتولد لدينا الضامة التي تفرز الجزيئية عوامل تعزيز نورت ثمرة (الشكل 1). يوضح هذا النموذج التجريبي من مفهوم أنه يمكن حفز الضامة أو المستحث لدعم التجديد إكسون عقب إصابة الجهاز العصبي. سيكون من المفيد أيضا لنا نموذجا في دراسة الآليات التي تؤدي إلى تفعيل الضامة برو-التجدد في الإشارات بين الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات الحيوان الرعاية المؤسسية واستخدام اللجنة العجو كلية الطب في جامعة.
1-الثقافة إعداد الخلايا العصبية معزولة DRG الكبار
- قبل إعداد الثقافة، قبل معطف صفيحة 6-جيدا مع بولي-د-يسين ولامينين. احتضان صفيحة 6-جيدا مع 0.01 ٪ بولي-د-يسين في 37 درجة مئوية ح 2 أو 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. ثم أغسل لوحة مرتين بماء مقطر.
- احتضان اللوحة مع حل لامينين بتركيز 3 ميكروغرام/مل ح 2 في درجة حرارة الغرفة، ويغسل لوحة مرتين بماء مقطر. جاف اللوحة في درجة حرارة الغرفة على الأقل ح 1.
- Euthanize ماوس في دائرة2 CO شفافة متصل باسطوانة غاز مضغوط2 CO. جداً الجلد تغمر العمود الفقري مع شفرة جراحة وتشريح عضلات مجاورة على الصعيد الثنائي لفضح عظام العمود الفقري. إزالة عظام العمود الفقري دقة استخدام رونجيور جراحية الضيقة ذات الرؤوس حتى يتعرض باﻷسعار الكامل.
ملاحظة: يتم الحصول على الخلايا العصبية باﻷسعار الكبار من الكبار C57BL6 الفئران الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أسابيع إلى 12 أسبوعا القديمة. - إزالة باﻷسعار ثنائيا من S1 كل وسيلة تصل إلى مستوى C1 استخدام مقص iridectomy والملقط الجميلة ذات الرؤوس تحت مجهر تشريح. في محاولة لقطع الجذور كلياً من باﻷسعار بغية تقليل التلوث من خلايا شوان أو الليفية.
- تخزين باﻷسعار تشريح في 60 مم طبق بتري يحتوي على 5 مل من تعديل النسر المتوسطة (دميم البرد دولبيكو) على الجليد حتى جميع باﻷسعار يتم جمعها.
ملاحظة: من المهم لتشريح باﻷسعار أسرع ما يمكن. ينبغي جمع باﻷسعار كل من ماوس واحدة لا تستغرق وقتاً أطول من 30 دقيقة و 30 دقيقة بعد القتل الرحيم، ووقف جمع باﻷسعار والمضي قدما إلى الخطوة التالية حتى إذا كان هناك ما زالت هي تبقى باﻷسعار. - نقل باﻷسعار إلى 1.5 مل من أنبوب ايبندورف استخدام تلميح ماصة أزرق (1000 ميليلتر) مع نهاية وقف إنتاج المواد الانشطارية. إزالة دميم بعد تدور سريعة لعدة ثوان باستخدام أجهزة الطرد مركزي مصغرة. أضف 1 مل دميم التي تحتوي على نوع U/mL 125 الحادي عشر كولاجيناز واحتضان الأنبوب لمدة 90 دقيقة مع تناوب لطيف (في الدقيقة 35-40) استخدام شاكر الإعصار في حاضنة 37 درجة مئوية. شل الأنبوب في الطابق شاكر باستخدام الشريط.
- تجاهل كولاجيناز المحتوية على دميم وإضافة 1 مل دميم الطازجة. انتظر حتى باﻷسعار عائمة تغرق تماما إلى الأسفل، ثم قم بإزالة دميم بالحطام الأنسجة. كرر هذه الخطوة الغسيل ست مرات على الأقل.
ملاحظة: لا تحاول تجاهل المادة طافية تماما. احرص على عدم إزالة أي باﻷسعار مع دميم طافية. - نقل باﻷسعار إلى أنبوب مخروطي 15 مل باستخدام تلميح ماصة أزرق (1000 ميليلتر) مع نهاية وقف إنتاج المواد الانشطارية. ثم "الماصة؛" صعودا وهبوطاً بلطف على الأقل 15 مرة باستخدام تلميح أزرق (1000 ميليلتر) جعل تعليق خلية متجانسة. تجنب الوقوع في فقاعات وحاول عدم لمس أسفل الأنبوبة المخروطية مع تلميح ماصة.
- الطرد المركزي الأنبوب في 239 x ز لمدة 3 دقائق وتجاهل المادة طافية مع تعويم الحطام بعناية. أضف 1 مل من نيوروباسال المتوسطة وتستكمل مع B27 (2.0% v/v) وريسوسبيند بيليه الخلية بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 إلى 10 مرات.
- يمر بتعليق خلية مصفاة خلية 70 ميكرومتر مضافين على رأس أنبوب مخروطي 50 مل. انتظر 2 دقيقة ومن ثم من أجل المتوسط نيوروباسال/ب-27 على مصفاة استخدام وحدة تحكم ماصة.
- لوحة جميع جمعها DRG الخلايا العصبية (أي ما مجموعة6 2 x 10 التقريبي DRG الخلايا العصبية من الماوس واحد) على بئرين للوحة 6-جيدا. الرسم من الخلايا العصبية من الماوس الكبار واحدة تغطي بئرين في لوحة 6-جيدا. ثم ضع اللوحة في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية حتى بلعم اشتركت الثقافات.
2-ثقافة المشارك ف "الضامة البريتوني" ريماري على إدراج الثقافة الخلية A
ملاحظة: إنشاء ثقافات المشارك ح 4 بعد الطلاء الأولى من الخلايا العصبية DRG منفصلان
- وتعد الضامة البريتوني الأولية من الكبار C57BL6 الفئران الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أسابيع إلى 12 أسبوعا القديمة. Euthanize حيوان في دائرة2 CO. جداً جلد البطن دقيق وفضح الصفاق وتجنب قطع الصفاق لمنع تسرب السوائل الغسل.
- ثقب الصفاق استخدام حقنه بإبرة ز 22 وضخ 10 مل من المثلج سالين مخزنة الفوسفات (PBS) في التجويف الصفاقى. تدليك بلطف الصفاق لمدة 1-2 دقيقة. ثم سحب الإبرة ويعصر برنامج تلفزيوني عن طريق موقع ثقب الإبرة وجمع السائل الغسل في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل.
ملاحظة: قبل الاستخدام، وضع المحاقن على الجليد للحفاظ على البرودة من برنامج تلفزيوني. - الطرد المركزي سائل الغسل في 239 x ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية بيليه المكونات الخلوية. ريسوسبيند بيليه مع 3 مل من المخزن المؤقت تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم الطرد المركزي بتعليق الخلية مرة أخرى في 239 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه مع 3 مل من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي بتعليق الخلية مرة أخرى لإزالة أي المخزن المؤقت تحلل ربك المتبقية.
ملاحظة: تأكد من المخزن المؤقت تحلل ربك هو إزالتها بالكامل. خلاف ذلك قد يكون المخزن المؤقت المتبقية لتحلل ربك السامة إلى الضامة مثقف. - ريسوسبيند الخلايا الأعلاف في 1 مل متوسط نيوروباسال/ب-27. فصل لوحة نصف جميع الضامة التي تم جمعها (أي ما مجموعة 3 × 106 إلى 6 × 106 خلايا) في ثقافة خلية إدراج مع منطقة فعالة 4.2 سم2، الذي يوضع على رأس البئر من الرسم.
ملاحظة: أثناء فترة ثقافة المشارك، تزرع الضامة في نيوروباسال/ب-27 العصبية الثقافة المتوسطة. وأكد بقاء الضامة تحت هذا الشرط الكافي.
3-معاملة Db-المخيم وجمع بلعم سم
ملاحظة: بدء العلاج db-مخيم ح 4 بعد ثقافات المشارك بلعم العصبية.
- إضافة 2 ميليلتر من 100 ميكرومتر db-مخيم الحل إلى ثقافات المشارك بلعم العصبية. إضافة نفس الحجم من برنامج تلفزيوني لتجربة التحكم.
- بعد 24 ساعة، سد بئر فارغة مع 1 مل من بلعم الثقافة المتوسطة في نفس لوحة 6-جيدا. نقل إدراج ثقافة الخلية في الثقافات العصبية-بلعم المشارك إلى البئر فارغة مع بلعم الثقافة المتوسطة. تبقى الخلايا تحت نفس الشرط ح 72 دون تغيير في المتوسط.
ملاحظة: نضيف فقط 1 مل من بلعم الثقافة المتوسطة أثناء جمع سم جعل تتركز سم. أثناء جمع سم، إذا لزم الأمر، أضفنا المزيد لتغطي كامل الضامة داخل الإدراج. - بعد 72 ساعة، الطرد المركزي بلعم سم في 239 x ز لمدة 5 دقائق إزالة المكونات الخلوية. اجتياز المادة طافية فلتر 0.2 ميكرون لإزالة أي الحطام الخلوية المتبقية. تخزين سم المجمعة في-70 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4-نورت ثمرة المقايسة مع سم المجمعة
- قبل إعداد ثقافة العصبية DRG الكبار منفصلة، قبل معطف شريحة دائرة 8-جيدا اتباع نفس الإجراء المبين في 1.1 و 1.2.
- الحصول على الخلايا العصبية DRG الكبار منفصلان في المتوسط نيوروباسال وتستكمل مع B27 باستخدام نفس الأساليب الموصوفة من 1.3 إلى 1.10. لوحة 5 × 104 خلايا كل بئر على شريحة الدائرة 8-جيدا قبل المغلفة.
- مكان الشريحة الدائرة في حاضنة 37 درجة مئوية أجل ح 2، يسمح للخلايا لإرفاق إلى الأسفل. ثم، استبدال المتوسطة الثقافة سم المذابة التي هو يسخن عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب الحرص على عدم لمس أسفل الشريحة الدائرة 8-جيدا عند إزالة المتوسطة الثقافة وإضافة سم المجمعة. - ح 15 بعد الطلاء الأولى، إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة. ثم، بإضافة 200 ميليلتر من المثلج الحل بارافورمالدهيد 4% إلى الآبار، واحتضان الخلايا مع الحل بارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية
ملاحظة: يجب أن تكون ثقافة العصبية الرسم للمقايسة ثمرة نورت تقتصر تحديداً على ح 15. وهناك تحت هذا الشرط، لا ثمرة نورت ملموس. - تغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني المثلج ثم قم بتنفيذ حظر مع 10% مصل الماعز العادي (خ ع) مع 0.1% تريتون-X ل 30 دقيقة احتضان الخلايا الثابتة مع حل جسم الأولية (مكافحة-Tuj-1) المخفف بنسبة 10 في المائة خ ع (بتركيز 1 ميكروغرام/مل) ح 4 في غرفة درجة الحرارة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- تغسل ثلاث مرات ببرنامج تلفزيوني ومن ثم احتضان الخلايا مع الجسم المضاد الثانوي (الماعز-مكافحة الماوس) الحل ح 2 في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل مرتين ببرنامج تلفزيوني وجبل الشريحة الثقافة مع ساترة (24 × 50 مم) باستخدام حل المتصاعدة.
- التقاط صور باستخدام مجهر الأسفار إلى تصور ثمرة نورت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ونحن تصف بروتوكول التي يمكن أن تولد الضامة قادرة على إفراز العوامل الجزيئية مع نشاط ثمرة نورت. وأسفرت بلعم سم تم الحصول عليها من ثقافات المشارك تعامل مع db-مخيم ثمرة نورت قوية عند تطبيقه على ثقافة العصبية DRG منفصلة (الشكل 2A). وبالمقارنة، سم تم الحصول عليها من ثقافات المشارك تعامل برنامج تلفزيوني لا يحدث ثمرة نورت في مدة 15-ح الثقافة لدينا (الشكل 2). عند التعامل مع db-مخيم للثقافة مع بلعم وحدها، سم تم الحصول عليها من هذا الشرط لم يكن فعالاً في دعم ثمرة نيوريتي (الشكل 2). وهذا يوحي أن التفاعل بلعم العصبية أمر لا غنى عنه لحفز الضامة أن تتمتع بقدرة بروريجينيراتيفي. ونحن أيضا اختبار إذا تم الحصول عليها من ثقافة العصبية فقط db-مخيم-تعامل سم والعثور على لا ثمرة نورت (الشكل 2D).
رقم 1: رسم تخطيطي يوضح إجراءات الحصول على تكييف المتوسطة المحتوية على نورت ثمرة نشاط. الكبار من الخلايا العصبية الرسم (2 × 106 خلايا لكل بئر) تستزرع ح 4. ثم، مثقف الضامة البريتوني في إدراج جيدا، تقع فوق البئر في الرسم الذي تم استزراع الخلايا العصبية. ح 4 بعد الطلاء، يعامل مخيم برنامج تلفزيوني أو ديبوتيريل. بعد حضانة 24 ساعة، الإدراج جيدا هو نقل إلى بئر أخرى مليئة بحوالي 1 مل المتوسطة. ثم، المحولة هي المحتضنة ح 72. ثم، يتم جمع المتوسطة مكيفة المحتضنة (سم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: نتائج تمثيلية نيوريتي ثمرة استخدام مقايسة مكيفة المتوسطة التي تم الحصول عليها من مختلف الظروف. (أ، ب) فصل الخلايا العصبية DRG الكبار كانت حادة ومثقف للضبط 15 حاء حاء 2 بعد الطلاء، استعيض المتوسطة الثقافة مع المتوسطة مكيفة (سم) التي تم الحصول عليها من الثقافات المشتركة العصبية-بلعم تعامل مع أي "برنامج تلفزيوني" (A) أو مخيم ديبوتيريل (db-مخيم) (ب). سم فقط تعامل مع db-مخيم معارضها النشاط ثمرة نورت قوية. (ج، د) سم تم الحصول عليها من الثقافات التي تتكون من أما بلعم (ج) أو العصبية (د) وحدها التي كانت تعامل مع معسكر db لا يؤيد ثمرة نورت. الإشارة إلى أشرطة مقياس 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك العديد من الخطوات الحاسمة لتوليد هذا النظام الثقافي المشترك. أنها هامة لضمان أن تكون مستعدة بالماوس DRG الخلايا العصبية والضامة البريتوني طازجة وصحية. لقد شهدنا نورت تقلص ثمرة نشاط مجلس الوزراء عند التشريح لجميع باﻷسعار استغرق أكثر من 30 دقيقة. وباﻹضافة إلى ذلك، تلوث مكونات الدم في الضامة البريتوني أدى أيضا إلى انخفاض النشاط ثمرة نورت في مجلس الوزراء. من أجل الحصول على تفاعل بلعم العصبية قوية بمعسكر db، الغسيل شامل سيكون أيضا خطوة حاسمة لضمان إتمام إزالة الحطام الأنسجة وإزالة المتبقية المحتملة السامة للخلايا المكونات، مثل كولاجيناز أو ربك تحلل المخزن المؤقت. نقطة أخرى للتأكيد من جديد على أنه ينبغي إزالة جذور تعلق على باﻷسعار بقدر الإمكان. تبقى بذرة جذور سيزيد تلوث خلايا شوان في ثقافة العصبية DRG. خلايا شوان يمكن أن تنتج كمية عالية من العوامل نيوروتروفيك في الثقافة التي قد تخلط بين النتائج.
في هذا البروتوكول، كانت مطلي الضامة منفصلان على إدراج ثقافة خلية يفصل بين الخلايا العصبية DRG مطلي على الجزء السفلي من اللوحة جيدا. دراستنا السابقة لم يظهر اختلاف كبير في مدى نورت ثمرة النشاط بين نظام الإدارة الوظيفية التي تم جمعها من الثقافات المشاركة المباشرة (السماح لجهات الاتصال الجسدي بين أنواع الخلايا اثنين) والثقافات المشتركة مع أنواع الخلايا اثنين مفصولة إدراج خلية ثقافة11. وأشارت هذه النتيجة إلى أن الخلايا العصبية والضامة يتواصلون مع بعضهم البعض عبر جزيئات قابلة للذوبان صدر من أي نوع من الخلايا، ليس من قبل جهات الاتصال المادي المباشر. وتبين أن CCL2، ويفرز من الخلايا العصبية الرسم، المسؤول عن تفعيل الضامة إلى النمط الظاهري برو-التجدد في هذا النموذج المشارك الثقافة14. وهكذا، تسمح نظامنا ثقافة المشارك في توضيح أكثر تفصيلاً بين الخلايا مما يشير إلى أن يتوسط تفعيل الضامة برو-التجدد.
وكان الثقافة تقتصر تحديداً على ح 15 خلال المقايسة ثمرة نورت في هذا البروتوكول. في تجارب رائدة، درسنا عدة ثقافات مختلفة الوقت ووجدت أن ثمرة نورت قوية جداً مع حد أدنى من ثمرة نورت في حالة عنصر التحكم (ح 15)، تحقق مع مجلس الوزراء تعامل مع db-مخيم. الرسم الماوس الخلايا العصبية، في حالة عدم إخضاع، لا تنمو أي نيوريتيس كبيرة داخل هذا الإطار الزمني. إذا كانت الخلايا العصبية DRG تستزرع أطول من ح 15، بيد أنها بداية لإظهار قدر من ثمرة نورت حتى في عنصر التحكم, اشترطت عدم الشرط، الذي من شأنه أن يحجب أي أثر لسم db-مخيم-تعامل على ثمرة نورت. وأبلغ نتيجة مماثلة في مقايسة ثمرة نيوريتي استخدام الفئران DRG الخلايا العصبية في دراسة سابقة16.
تستخدم بعض الدراسات السابقة زيموسان، إعداد جدار خلية خميرة، لتفعيل الضامة مع النمط الظاهري برو-التجدد7،9. ومع ذلك، صدر الضامة تحفزها زيموسان جزيئات برو-التجدد ليس فقط، بل أيضا العوامل السامة للخلايا. عندما المشتقة بلعم من مكونات البروتين في بلعم سم تعامل مع زيموسان كانت مفصولة اللوني هلام الترشيح، كانت عوامل ≥ 30 كاتشين السامة للخلايا في حين أن العوامل ≤ 30 كاتشين تشجع التجديد إكسون7. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي الحقن زيموسان للحبل الشوكي بالإعدام العلني ل الخلايا العصبية ومحاور عصبية9. وبالمقارنة، أظهرت لدينا بروتوكول لتوليد الضامة برو-التجدد أن يكون الفسيولوجية أكثر من سابقتها باستخدام زيموسان. في الواقع، حقن db-مخيم للخلايا العصبية DRG تعزيز قدرتها على محاور عصبية النمو عقب إصابة إلى السلطة المركزية دون أي تقرير عن الأضرار الخلوية17،18. في جميع أنحاء سلسلة من تجاربنا، لاحظنا ابدأ أي انخفاض ملحوظ من كثافة الخلايا العصبية الرسم في الثقافة بعد تطبيق سم db-مخيم-تعامل. يمكننا التكهن بأن لدينا بروتوكول يسمح لنا بإنتاج الضامة برو-التجدد فقط دون السمية العصبية المتزامنة. ولذلك، البروتوكول ونموذج تجريبي ذكرت هنا ستكون مفيدة للتعرف الجزيئي توقيعات الضامة برو-التجدد وفهم بما هي الآليات التي تطورت في النمط الظاهري برو-التجدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ويدعم هذا البروتوكول منحة جبهة الخلاص الوطني-2015R1A2A1A01003410 من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات وتخطيط المستقبل، وجمهورية كوريا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors - Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
References
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Festoff, B. W., et al. Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury. J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).
- Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate. Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).
- Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling. Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).
- DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. Neuroinflammation: the devil is in the details. J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).
- Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).
- Yin, Y., et al. Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration. J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).
- Yin, Y., et al. Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells. Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).
- Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).
- Kwon, M. J., et al. Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury. J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).
- Niemi, J. P., et al. A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration. J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).
- Hannila, S. S., Filbin, M. T. The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).
- Kwon, M. J., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism. Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).
- Cafferty, W. B., et al. Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice. J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).
- Cai, D., et al. Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate. J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).
