Summary
O protocolo atual apresenta procedimentos experimentais para estimular macrófagos cultivados para ser dotado de capacidade de libertar moleculares fatores que promovem o crescimento do axônio. Tratamento de acampamento para as culturas de macrófagos neurônio co induz os macrófagos para produzir meio condicionado que possui atividade de consequência natural do axônio forte.
Abstract
Há fortes evidências de que os macrófagos podem participar da regeneração ou reparação da lesão de sistema nervoso. Aqui, descrevemos um protocolo em que os macrófagos são induzidos a produzir condicionado médio (CM) que promove o crescimento do axônio. Neurônios do gânglio (DRG) adulto raízes dorsais são agudamente dissociados e chapeados. Depois que os neurônios estão conectados estàvel, macrófagos peritoneais são cultivados co em uma inserção de cultura celular sobreposta sobre o mesmo bem. Dibutyryl que amp cíclico (cAMP-db) é aplicado às culturas co por 24 h, após o qual a cultura de pilha inserir contendo os macrófagos é movido para outro poço para coletar CM por 72 h. O CM de co culturas tratadas com db-cAMP, quando aplicado a uma cultura de neurônio DRG adulta separada, apresenta atividade de consequência natural do axônio robusto. O CM obtido a partir das culturas db-cAMP-tratados, consistindo de um único tipo de células sozinho, ou neurônio DRG ou macrófago peritoneal, não apresentam atividade de consequência axônio. Isso indica que a interação entre os neurônios e macrófagos é indispensável para a ativação de macrófagos secretando fatores moleculares com atividade de consequência natural do axônio em centímetros. Assim, nosso paradigma de co-cultura também será útil para estudar a sinalização intercelular na interação neurônio-macrófago para estimular os macrófagos para ser dotado de um fenótipo pro-regenerativa.
Introduction
Diversos estudos têm buscado melhorar a regeneração de axônio CNS após as lesões da medula espinhal ou cérebro. Reações inflamatórias, inevitavelmente, que acompanham as lesões no sistema nervoso, tradicionalmente são pensadas para participar em processos patológicos secundários, levando a resultados deletérios1,2. Com efeito, metilprednisolona que pode suprimir reações inflamatórias é a única terapia aprovada para de lesão medular aguda3. No entanto, estudos mais recentes forneceram evidências que macrófagos, um tipo de células inflamatórias representativo, podem participar da regeneração ou reparação da lesão de sistema nervoso4,5,6. Por exemplo, infiltração de macrófagos que seguindo uma lente lesão produzir pro-regenerativa as moléculas para promover a regeneração de neurônios ganglionares da retina7,8. Além disso, transplantados neurônios DRG aumentaram o crescimento do axônio na região onde os macrófagos foram activados por ZnPPIX9. Além disso, os macrófagos, no local da lesão podem criar um meio de crescimento-permissivo por nervos periféricos feridos10.
Nosso trabalho também forneceu fortes evidências que os macrófagos podem contribuir para a capacidade de regeneração do axônio nos neurônios adjacentes. Temos demonstrado que a ativação de macrófagos no gânglio da raiz dorsal (DRG) foram essenciais na reforçada capacidade regenerativa de DRG neurônios sensoriais seguindo um pré-condicionamento periférica nervo lesão11. Pesquisa semelhante foi relatada independentemente de outro laboratório12. Também mostramos que a injeção intraganglionic de dibutyryl do AMP cíclico (cAMP-db), que é uma molécula bem conhecida para aumentar a capacidade de regeneração do axônio13, induziu a ativação de macrófagos. A desativação de macrófagos aboliu os efeitos da db-acampamento na atividade de consequência natural do axônio. Trabalhos posteriores identificaram induzida por lesão expressão CCL2 nos neurônios como um sinal para estimular macrófagos com fenótipo regenerativos pro14,15.
Com base em resultados experimentais acima, nós estabelecemos um modelo in vitro assemelhando-se a eventos moleculares que ocorrem nos DRGs seguindo um pré-condicionamento lesão modelo11,14. Neste modelo, db-cAMP é aplicado para as culturas co neurônio-macrófago provocando intercelular de sinalização que leva à ativação de macrófagos com um fenótipo pro-regenerativa. Aqui, descrevemos protocolos detalhados, pelo qual podemos gerar os macrófagos que secretam fatores moleculares promovendo consequência axônio (Figura 1). Este modelo experimental ilustra um conceito que macrófagos podem ser estimulados ou induzidos a apoiar a regeneração do axônio após as lesões ao sistema nervoso. Nosso modelo também será útil no estudo de mecanismos de sinalização intercelular que leva à ativação de macrófagos pro-regenerativa.
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Protocol
Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo cuidado Animal institucional e uso Comitê de Ajou University School of Medicine.
1. cultura preparação de neurônio dissociada DRG adulto
- Antes de configurar a cultura, pre-revesti uma placa de 6 com poli-D-lisina e laminina. Incube uma placa de 6 com 0.01% poli-D-lisina a 37° C por 2 h ou a 4° C durante a noite. Em seguida, lave a placa duas vezes com água destilada.
- Incubar a placa com solução de laminina na concentração de 3 µ g/mL para 2 h à temperatura ambiente e em seguida, lavar a placa duas vezes com água destilada. Seca a placa na temperatura de quarto pelo menos por 1 h.
- Eutanásia em um rato em uma câmara de2 CO transparente conectado a um cilindro de gás de2 CO compactado. Faça uma incisão na pele sobrejacente a coluna vertebral com uma lâmina cirúrgica e dissecar os músculos paravertebrais bilateralmente para expor os ossos vertebrais. Remova os ossos vertebrais meticulosamente, usando um rongeur cirúrgico com ponta estreita até os DRGs são totalmente expostos.
Nota: Os neurônios adultos DRGs são obtidos de ratos adultos machos C57BL6 com idade entre 8 a 12 semanas de idade. - Os DRGs bilateralmente remova o S1 todo o caminho até o nível C1 usando iridectomy tesoura e pinça de ponta fina sob um microscópio de dissecação. Tente cortar as raízes inteiramente de DRGs para minimizar a contaminação das células de Schwann ou a fibroblastos.
- Armazene os DRGs dissecados em uma placa de Petri contendo 5 mL de frio Dulbecco modificado águia médio (DMEM) no gelo até que todos os DRGs são coletados de 60 mm.
Nota: É fundamental para dissecar os DRGs tão rapidamente quanto possível. A coleção de todos os DRGs de um rato não deve demorar mais de 30 min. 30 min após a eutanásia, parar de colecionar os DRGs e prosseguir para a próxima etapa, mesmo que ainda restam DRGs. - Transferi os DRGs para um 1,5 mL tubo Eppendorf usando uma ponta de pipeta azul (1000 µ l) com uma ponta de corte. Remova o DMEM após uma rápida volta por alguns segundos, usando uma mini centrífuga. Adicionar 1 mL de DMEM contendo 125 colagenase de XI de tipo U/mL e incubar o tubo para 90 min com uma rotação suave (35-40 rpm), utilizando um agitador de twister em uma incubadora de 37 ° C. Imobilize o tubo no chão abanador usando a fita.
- Descartar a colagenase-contendo DMEM e adicionar 1 mL de DMEM fresco. Espere até os flutuantes DRGs afundam completamente para baixo até o fundo e em seguida, remover o DMEM com os restos de tecido. Repita essa etapa de lavagem pelo menos seis vezes.
Nota: Não tente descartar o sobrenadante completamente. Tenha cuidado para não remover qualquer DRGs com DMEM o sobrenadante. - Transferi os DRGs para um tubo cônico de 15 mL, usando uma ponta de pipeta azul (1000 µ l) com uma ponta de corte. Em seguida Pipetar subindo e descendo suavemente pelo menos 15 vezes utilizando uma ponta azul (1000 µ l) tornar-se uma suspensão homogênea. Evite fazer bolhas e tente não tocar a parte inferior do tubo cônico com a ponta da pipeta.
- Centrifugar o tubo a 239 x g por 3 min e cuidadosamente descartar o sobrenadante com detritos de flutuação. Adicionar 1 mL de Neurobasal suplementado com B27 (2,0% v/v) e ressuspender as células pipetando suavemente e descer de 5 a 10 vezes.
- Passe a suspensão de células através de um filtro de célula de 70 µm sobreposto em cima de um tubo cónico de 50 mL. Esperar por 2 min e em seguida despeje Neurobasal 27/B médio para o filtro usando um controlador de pipeta.
- Placa todos recolhidos DRG os neurônios (um total de aproximado de 2 x 106 DRG os neurônios de um rato) em dois poços da placa de 6. Neurônios DRG de um rato adulto cobrem dois poços de uma placa de 6. Em seguida, coloca a placa numa incubadora de CO2 a 37 ° C até o macrófago co culturas.
2. co-cultura de P rimário macrófagos peritoneais sobre A inserção de cultura de células
Nota: Estabelecer as culturas co 4 h após o chapeamento inicial dos neurônios DRG dissociados
- Macrófagos peritoneais primários são preparados a partir de ratos adultos machos C57BL6 com idade entre 8 a 12 semanas de idade. Eutanásia em um animal em uma câmara de2 CO. Faça uma incisão da pele abdominal delicadamente, expor o peritônio e evitar cortar o peritônio para evitar um vazamento do líquido de lavagem.
- Punção do peritônio, utilizando uma seringa com uma agulha 22g e injetar 10 mL de gelado salin tampão fosfato (PBS) na cavidade peritoneal. Massageie suavemente o peritônio para 1-2 min. Em seguida, retire a agulha e esprema a PBS através do local de punção da agulha e coletar o fluido de lavagem em um tubo cónico de 50 mL.
Nota: Antes de usar, coloque a seringa no gelo para manter a frieza da PBS. - Centrifugue o fluido de lavagem a 239 x g durante 10 minutos a 4 ° C para os componentes celulares de Pelotas. Resuspenda o pellet com 3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) para 3 min à temperatura ambiente. Centrifugar a suspensão de célula novamente 239 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Resuspenda o pellet com 3 mL de PBS e centrifugar a suspensão celular novamente para remover qualquer restantes do lysis RBC.
Nota: Certifique-se de que o tampão de Lise RBC é completamente removido. Caso contrário, restante do lysis RBC pode ser tóxico para os macrófagos culturas. - Ressuspender as células peletizadas em 1 mL de meio de Neurobasal/B-27. Placa de metade de todos os macrófagos coletados (um total de 3 × 106 a 6 x 106 células) em uma cultura celular de inserir com a área efetiva de 4,2 cm2, que é colocado em cima do poço de DRG dissociada.
Nota: Durante o período de co-cultura, macrófagos são cultivados em meio de cultura de neurônio Neurobasal/B-27. Sobrevivência adequada dos macrófagos sob essa condição foi confirmada.
3. tratamento de Db-acampamento e coleção de macrófago CM
Nota: Iniciar o tratamento de db-acampamento 4 h após as culturas de macrófagos neurônio co.
- Adicione 2 µ l de solução de db-acampamento de 100 µM para as culturas de macrófagos neurônio co. Adicione o mesmo volume de PBS para um experimento de controle.
- Após 24h, preencha um vazio bem com 1 mL de meio de cultura de macrófagos na mesma placa de 6. Transferi a inserção de cultura celular em culturas de co o neurônio-macrófago para o bem vazio com meio de cultura de macrófagos. Manter as células sob a mesma condição para 72 h sem alterar o meio.
Nota: Nós adicionamos apenas 1 mL de meio de cultura de macrófagos durante a coleta de CM para fazer concentrada CM. Durante a coleta de CM, se necessário, nós adicionamos mais para cobrir completamente os macrófagos dentro a inserção. - Depois de 72 h, centrifugar o macrófago CM a 239 x g por 5 min remover os componentes celulares. Passe o sobrenadante através de um filtro de 0,2 µm para remover quaisquer restos celulares restantes. Armazene o coletados CM a-70 ° C até o uso.
4. o axônio consequência ensaio com coletados CM
- Antes de configurar uma cultura adulta separada do neurônio DRG, pre-revesti um slide de câmara de 8 poços seguindo o mesmo procedimento descrito em 1.1 e 1.2.
- Obter Neurobasal suplementado com B27 dissociada adulto DRG neurônios usando os mesmos métodos descritos de 1.3 a 1,10. Placa de 5 x 104 células por poço para o slide de câmara de 8 poços revestidos.
- Coloque o slide de câmara em uma incubadora de 37 ° C por 2 h, permitindo que as células anexar a parte inferior. Em seguida, substituir o meio de cultura com o descongeladas CM que é pré-aquecido a 37 ° C.
Nota: Tenha cuidado para não tocar o fundo do slide 8 poços Câmara ao remover o meio de cultura e adicionando o CM coletado. - 15 h após o chapeamento inicial, remover o meio e lave as células com PBS uma vez. Em seguida, adicionar 200 µ l de solução de paraformaldeído 4% gelada nos poços e incube as celulas com a solução de paraformaldeído por 20 min a 4 ° C
Nota: A cultura do neurônio DRG para ensaio de consequência natural do axônio deve ser precisamente restrita às 15 h. Sob esta condição, não há nenhuma consequência axônio apreciável. - Lave tres vezes com PBS gelado e então executar o bloqueio com 10% soro de cabra normal (NGS) com 0,1% Triton-X por 30 min. Incube as celulas fixas com solução de anticorpo primário (anti-Tuj-1), diluída com 10% NGS (em uma concentração de 1 µ g/mL) para 4h no quarto temperatura ou durante a noite a 4 ° C.
- Lave tres vezes com PBS e então incubar as células com solução de anticorpo secundário (cabra-anti rato) por 2 h à temperatura ambiente. Em seguida, lave duas vezes com PBS e montar o slide de cultura com uma lamela (24 × 50mm) usando a solução de montagem.
- Com imagens usando um microscópio de fluorescência para visualizar a consequência natural do axônio.
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Representative Results
Descreveremos um protocolo que pode gerar os macrófagos capazes de secretar fatores moleculares com atividade de consequência natural do axônio. O macrófago CM obtido a partir da co culturas tratadas com db-acampamento resultou em consequência do axônio robusto quando aplicado a uma cultura separada de neurônio DRG (Figura 2A). Em comparação, CM obtido a partir das culturas co tratada com PBS não induzir axônio consequência em nossa duração de cultura 15-h (Figura 2B). Quando db-cAMP é tratada a cultura com macrófagos sozinho, CM obtido desta condição não foi eficaz no apoio a consequência do axônio (Figura 2). Isto sugere que a interação neurônio-macrófago é indispensável para estimular macrófagos para ser dotado de uma capacidade de proregenerative. Nós também testamos se CM obtidos de cultura apenas do neurônio db-cAMP-tratados e não encontrado nenhuma consequência do axônio (Figura 2D).
Figura 1: um diagrama esquemático ilustrando os procedimentos para obter condicionado médio atividade de consequência natural contendo axônio. Neurônios DRG adultos (2 x 106 células por cada poço) são cultivados por 4h. Em seguida, os macrófagos peritoneais são cultivados em inserir bem, localizado acima do poço no qual DRG neurônios foram cultivados. 4h depois de chapeamento, acampamento ou PBS ou dibutyryl é tratado. Após incubação de 24h, a inserção bem é transferida para outro bem preenchido com cerca de 1 ml de meio. Em seguida, o transferidos bem é incubado por 72 h. Então, o meio condicionado incubado (CM) é coletado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: resultados representativos do axônio consequência ensaio usando condicionado médio obtido de várias condições. (A, B) Neurônios DRG adultos aguda foram dissociados e cultivadas para exatamente 15 h. 2 h após chapeamento, meio de cultura foi substituído com condicionado médio (CM) obtido de neurônio-macrófago co culturas tratadas com PBS (A) ou dibutyryl acampamento (db-cAMP) (B). Apenas o CM tratada com db-cAMP exibiu atividade de consequência natural do axônio robusto. (C, D) CM obtidos de culturas, consistindo de um macrófago (C) ou neurônio (D) sozinho que foi tratado com db-campo não oferecia suporte a consequência natural do axônio. Escala barras indicam 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Existem várias etapas críticas para a geração deste sistema de co-cultura. É importante assegurar que os neurônios de rato DRG e macrófagos peritoneais são preparados frescos e saudáveis. Nós experimentamos o axônio reduzida atividade de consequência natural do CM quando a dissecação de todos os DRGs levou mais de 30 min. Além disso, a contaminação dos componentes do sangue em macrófagos peritoneais também levou a uma diminuição da atividade de consequência natural do axônio no CM. Lavagem completa para eliciar interação neurônio-macrófago robusto por db-cAMP, também seria um passo fundamental para assegurar a completa remoção dos restos de tecido e eliminação do restante potencialmente citotóxicos componentes, tais como a colagenase ou tampão de lise de RBC. Outro ponto a ser reiterado é que as raízes anexadas ao DRGs devem ser removidas o máximo possível. Restantes stubs de raízes aumentaria a contaminação de células de Schwann na cultura de neurônio DRG. Células de Schwann podem produzir uma quantidade elevada de fatores neurotróficos na cultura que poderia confundir os resultados.
Neste protocolo, dissociadas de macrófagos foram banhados em uma inserção de cultura celular separada os neurônios DRG chapeados na parte inferior da placa bem. Nosso estudo anterior não mostrou diferença significativa na extensão da atividade de consequência natural do axônio entre o CMs coletadas diretas culturas co (permitindo contatos físicos entre os tipos de duas célula) e as culturas co com os tipos de duas célula separaram por um cultura de pilha inserir11. Este resultado indicou que os neurônios e macrófagos estão se comunicando uns com os outros através de moléculas solúveis, libertadas de qualquer tipo de célula, não por contacto físico directo. Foi demonstrado que CCL2, secretada de neurônios DRG, é responsável pela ativação de macrófagos em um fenótipo pro-regenerativa neste modelo de cultura co14. Assim, nosso sistema de co-cultura permitirá a elucidação de sinalização intercelular mais detalhadas que medeia a ativação de macrófagos pro-regenerativa.
A cultura foi precisamente restrita às 15 h, durante o ensaio de consequência natural do axônio no presente protocolo. Em experiências piloto, nós examinou vários tempo de cultura diferente e achei que com uma extensão mínima de consequência natural do axônio na condição de controle (15 h), consequência do axônio altamente robusto foi alcançada com o CM tratada com db-cAMP. Neurônios de rato DRG, se não pré-condicionado, não cresce qualquer neuritos significativos dentro deste prazo. Se os neurônios DRG são cultivados mais de 15 h, no entanto, começam a mostrar algum grau de consequência natural do axônio até mesmo no controle, condição não instintiva, que iria obscurecer qualquer efeito do db-cAMP-tratada CM em consequência do axônio. Resultado semelhante foi relatado no ensaio de consequência de axônio usando os neurônios DRG de rato em um anterior estudo16.
Alguns estudos anteriores usado ZnPPIX, uma preparação de parede celular de levedura, para ativar macrófagos com um fenótipo regenerativos pro7,9. No entanto, os macrófagos estimulados por ZnPPIX lançado não apenas moléculas pro-regenerativo, mas também fatores citotóxicos. Quando os componentes de proteína no macrófago CM tratado com ZnPPIX foram separados por cromatografia de gel filtração, derivado de macrófago fatores ≥ 30 kDa foram citotóxicos, enquanto factores ≤ 30 kDa promovido de regeneração do axônio7. Além disso, a injeção de ZnPPIX para a medula espinhal pode levar à morte evidente dos neurônios e axônios9. Em comparação, nosso protocolo para gerar os macrófagos pro-regenerativa mostrou para ser mais fisiológica do que o anterior usando ZnPPIX. Na verdade, a injeção de db-acampamento para os neurônios DRG reforçada sua capacidade de axônios de crescimento após uma lesão ao ramo central sem qualquer relatório sobre danos celulares17,18. Ao longo de uma série de nossas experiências, nunca observamos qualquer diminuição significativa da densidade do neurônio DRG na cultura após a aplicação do db-cAMP-tratada CM. Nós especulamos que nosso protocolo nos permite produzir exclusivamente pro-regenerativa macrófagos sem neurotoxicidade simultânea. Portanto, o protocolo e modelo experimental relataram aqui, seria útil para identificar assinaturas moleculares de macrófagos pro-regenerativa e entender por que mecanismos o fenótipo pro-regenerativa é evoluído.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este protocolo é suportado por um fundo NRF-2015R1A2A1A01003410 do Ministério da ciência, TIC e planejamento futuro, República da Coreia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors - Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
References
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