Summary
現在のプロトコルは、神経突起伸長を促進する因子の分子を解放する能力が備わっている培養マクロファージを刺激する実験の手順を示します。神経細胞・ マクロファージの共培養にキャンプの治療は、強力な神経突起伸長作用を有している馴化培地を生成するマクロファージを誘導します。
Abstract
マクロファージが再生または負傷した神経系の修復に参加できることを強力な証拠があります。ここでは、マクロファージ、神経突起伸長を促進するエアコン生産媒体 (CM) に誘導されるプロトコルについて述べる。大人の後根神経節 (DRG) ニューロンは急性解離、メッキします。ニューロンは接続安定、マクロファージが文化のセル挿入も同じにオーバーレイで共培養です。サイクリック AMP (db キャンプ)、24 h、その後細胞培養は大食細胞を含む挿入の共培養に適用されます調節は 72 h の CM を収集する別よくに移動されます。共培養別アダルト後根神経節ニューロンの文化に適用されるとき、db キャンプで治療から CM は、堅牢な神経突起伸長活性を発揮します。単一のセルの種類だけから成る db キャンプ治療文化から得られる CM、DRG ニューロンまたは腹腔マクロファージ、神経突起伸長活性に表わさなかった。これは、神経細胞とマクロファージの相互作用はない CM に神経突起伸長活性分子因子を分泌するマクロファージの活性化のため不可欠であることを示します。したがって、私たちの共培養のパラダイムは、恵まれているプロ再生表現型マクロファージを刺激する神経細胞・ マクロファージの相互作用における細胞間情報伝達の研究に有用もなります。
Introduction
負傷後脊髄や脳の中枢神経系軸索の再生を高めるために様々 な研究を求めています。炎症反応、神経系に傷害を必然的に伴う伝統的成果劇物1,2につながる二次の病理学プロセスに参加する考えられています。確かに、炎症反応を抑制するステロイドは急性脊髄傷害3の唯一の承認された治療です。しかしより最近の研究では、マクロファージ、代表的な炎症性細胞の種類が再生または負傷した神経系4,5,6の修復に参加できることを証拠を提供しています。たとえば、浸潤マクロファージ網膜神経節ニューロン7,8の再生を促進させるレンズ損傷生成プロ再生分子を次します。さらに、移植後根神経節ニューロンは、マクロファージがザイモサン9によってアクティブ化されている領域を軸索成長を増加しました。また、病変のサイトでマクロファージは、傷ついた末梢神経10成長寛容な環境を作成できます。
私たちの仕事は、マクロファージは、隣接するニューロンの軸索再生の能力に貢献できる強力な証拠も提供。後根神経節 (DRG) におけるマクロファージの活性化が示されている DRG の強化された再生能力に不可欠な感覚ニューロンの前処理末梢神経傷害11。同様の研究は独立して別の所12から報告。また、軸索再生13の能力を強化するよく知られている分子である amp (db キャンプ)、intraganglionic 注射誘発マクロファージの活性化したことを示した。マクロファージの非アクティブ化は、神経突起伸長活性に及ぼす db キャンプを廃止しました。後続の作品は、傷害による発現 CCL2 ニューロンのプロ再生表現型14,15マクロファージを刺激するために信号として識別されます。
上記の実験結果に基づき, 前処理傷害モデル11,14以降 drg コードで発生する分子のイベントに似た生体外モデルを設けています。このモデルでは、db-キャンプはプロ再生表現型とマクロファージの活性化につながるシグナル伝達細胞間を引き出す神経細胞・ マクロファージの共培養に適用されます。ここでは、我々 は我々 が神経突起伸展 (図 1) を促進する分子の要因を分泌するマクロファージを生成できます詳細なプロトコルを説明します。この実験モデルは、マクロファージを刺激または傷害神経系の軸索再生をサポートに誘導できるコンセプトを示しています。我々 のモデルはプロ再生マクロファージの活性化につながる細胞間情報伝達機構の勉強に役に立ちます。
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Protocol
すべての実験動物を含む制度動物ケアおよび使用委員会の亜洲大学医学部によって承認されました。
1. 文化解離アダルト後根神経節ニューロンの準備
- 文化をセットアップする前にあらかじめポリ-D-リジンとラミニン 6 ウェル プレートをコートします。0.01% ポリ-D-リジン 2 h の 37 ° C、4 ° C で 6 ウェル プレート、一晩インキュベートします。蒸留水で 2 回プレートを洗います。
- 2 時間、室温で 3 μ G/ml の濃度でラミニン溶液でプレートを孵化させなさいし、蒸留水で 2 回、その後、洗浄します。少なくとも 1 時間室温でプレートを乾燥します。
- 圧縮された CO2ガス シリンダーに接続されている透明な CO2チャンバーにマウスを安楽死させます。外科ブレードで脊柱を上の皮膚を切開し、椎体の骨を公開する両側傍脊柱筋を解剖します。細心の注意、Drg は完全にさらされるまで狭い先端手術 rongeur を使用して椎体骨を削除します。
注: 大人 Drg ニューロンは 8 週間から 12 週間古い歳大人の C57BL6 男性マウスから取得されます。 - 虹彩はさみと解剖顕微鏡の下で細い鉗子を使用して C1 レベルまで S1 から二国間、Drg を削除します。シュワン細胞や線維芽細胞の汚染を最小限にするために完全に Drg から根をカットしようとします。
- 60 mm シャーレまですべて、Drg を収集 5 mL の冷たいダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 氷の上を含む解剖 drg コードを格納します。
注: できるだけ早く、Drg を解剖するが重要です。1 つのマウスからすべての Drg のコレクションする必要がありますいない安楽死後 30 分 30 分以上かかる、Drg の収集を停止、Drg がまだ残っていて、次の手順に進みます。 - 1.5 mL エッペン チューブ カットオフ エンドと青いピペット チップ (1000 μ L) を使用して、Drg に転送します。ミニ遠心分離機を使用していくつかの秒のクイック スピン後、DMEM を削除します。125 U/mL タイプ XI コラゲナーゼを含む DMEM の 1 mL を追加し、37 ° C のインキュベーターでツイスター シェーカーを使用して緩やかな回転 (35-40 rpm) と 90 分のためのチューブを孵化させなさい。テープを使用してシェーカー階チューブを固定します。
- コラゲナーゼを含む DMEM を破棄し、新鮮な DMEM の 1 mL を追加します。フローティング DRGs 完全に底に沈みし、組織破片を DMEM を削除まで待ちます。少なくとも 6 回この洗浄工程を繰り返します。
注: は、上清を完全に破棄しようとしないでください。上澄み DMEM に任意の Drg を削除しないように注意します。 - カットオフ エンドと青いピペット チップ (1000 μ L) を使用して、15 mL の円錐管に、Drg を転送します。優しく上下にピペットの少なくとも 15 倍を使って均一な細胞の懸濁液を作る青いチップ (1000 μ L)。泡を避けるし、ピペット チップと円錐形の管の底に触れないでください。
- 3 分の 239 x g でチューブを遠心し、慎重に破片をフローティングで上澄みを廃棄します。B27 Neurobasal 培の 1 mL を追加 (2.0 %v/v) し、上下に 5 〜 10 倍軽くピペッティングにより細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞懸濁液を 50 mL のコニカル チューブ上にオーバーレイ 70 μ m セル ストレーナーに通過します。2 分待つし、ピペット コント ローラーを使用してストレーナーに Neurobasal/B-27 中を注ぐ。
- すべて収集した DRG ニューロン (1 つのマウスからおおよそ 2 x 106 DRG ニューロンの合計) 6 ウェル プレートの 2 つの井戸の上に板します。1 つの大人のマウスから DRG ニューロン 6 ウェル プレートに 2 つの井戸をカバーします。マクロファージ共培養まで、37 ° C で CO2インキュベーターでプレートを配置します。
2. A 細胞文化の挿入に P, 腹腔内マクロファージの共培養
注: 解離の DRG ニューロンの初期のめっき後の共培養 4 h の確立します。
- 主な腹腔マクロファージは 8 週間から 12 週間古い歳大人の C57BL6 男性マウスから用意しています。CO2商工会議所に動物を安楽死させます。繊細な腹部の皮膚を切開、腹膜を公開し、洗浄液の漏れを防ぐために腹膜を切断しないでください。
- 22 G 針と注射器を使用して腹膜を穿刺し、冷たいリン酸緩衝・ サリン (PBS) 10 mL を腹腔内に注入します。1-2 分の腹膜を優しくマッサージします。その後、針を抜く針穿刺部位を介して PBS を絞るし、50 mL の円錐管に洗浄液を収集します。
注意: 使用前に PBS の冷たさを維持するために氷の上に注射器を置きます。 - 239 x g 細胞成分をペレットへの 4 ° C で 10 分間で洗浄液を遠心します。室温で 3 分の赤血球 (RBC) 換散バッファーの 3 mL にペレットを再懸濁します。4 ° C で 10 分間 239 x g で再び細胞懸濁液を遠心分離します。3 mL の PBS でペレットを再懸濁します、任意の残りの RBC の換散バッファーを削除するもう一度細胞懸濁液を遠心分離します。
注: RBC の換散バッファーが完全に削除されていることを確認します。それ以外の場合 RBC 換散バッファーの残りは培養マクロファージに有毒かもしれない。 - Neurobasal/B-27 中 1 mL に小球形にされた細胞を再懸濁します。プレート細胞培養すべて収集したマクロファージ (3 × 106 6 × 106セルの合計) の半分は 4.2 cm2、解離の DRG の井戸の上に配置されているの有効面積挿入します。
注: 共培養期間中にマクロファージ Neurobasal/B-27 神経細胞培養培地で栽培しています。この条件下でのマクロファージの十分な生存が確認されました。
3. Db キャンプとマクロファージ CM 集の治療
注: は、神経細胞・ マクロファージの共培養後 db キャンプ治療 4 h を開始します。
- 神経細胞・ マクロファージの共培養に 100 μ M db キャンプ溶液 2 μ L を追加します。コントロール実験のため PBS の同じボリュームを追加します。
- 24 h 後同じ 6 ウェル プレートでマクロファージ培養液 1 ml 空井戸を埋めます。神経細胞・ マクロファージの共培養における細胞文化挿入をマクロファージ培養培地で空井戸に転送します。媒体を変更することがなく 72 h の同じ条件下で細胞を保ちます。
注: する CM コレクション中にマクロファージ培養液 1 mL だけ CM を集中して追加します。CM コレクション中に必要な場合、我々 追加挿入内マクロファージを完全にカバーするため。 - 72 時間後携帯電話のコンポーネントを削除する 5 分 239 x g でマクロファージ CM を遠心します。上清を任意の残りの細胞残屑を除去する 0.2 μ m フィルターを通過します。使用するまで-70 ° C で収集した CM を格納します。
4. 収集した CM 神経突起伸長法
- 別アダルト DRG ニューロン文化をセットアップする前に 1.1 と 1.2 に記載されている同じ手順に従う 8 よくチェンバー スライドがプレコートします。
- B27 Neurobasal 培解離アダルト DRG ニューロンを取得 1.3 から 1.10 に説明した同じ方法を使用します。プレコート 8 よくチェンバー スライドによくあたりプレート 5 × 104セルです。
- 場所 2 h の 37 ° C の定温器でチェンバー スライド下部に接続するセルを許可します。その後、培養培地を 37 ° C で予熱した解凍 CM に置き換えます
注: 培養培地を削除するとき 8 よくチェンバー スライドの下部に触れないように注意し収集した CM を追加します。 - 初期めっき後 15 時間はメディアを取り出して、PBS のセルを一度洗います。次に、井戸に冷えた 4% パラホルムアルデヒド溶液 200 μ L を追加し、4 ° C で 20 分間パラホルムアルデヒド溶液で細胞をインキュベート
注: 神経突起伸長試金のための DRG ニューロンの文化は正確に 15 時間に制限されているはずです。この条件の下でかなり神経突起はありません。 - 氷冷 PBS にて 3 回洗浄し、10% を使用してブロックを実行ヤギ血清 (NGS) 0.1 %30 分トリトン X 10% で希釈した一次抗体 (抗-Tuj-1) ソリューションと固定セルをインキュベート ルームで 4 h (1 μ g/mL の濃度) で NGS温度または 4 ° C で一晩
- PBS にて 3 回洗浄し、室温で 2 時間二次抗体 (ヤギ抗マウス) ソリューションと細胞をインキュベートします。PBS で 2 回洗浄し、マウント ソリューションを使用して観察 (24 × 50 mm) と文化のスライドをマウントします。
- 神経突起伸長を可視化する蛍光顕微鏡を用いて画像を取る。
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Representative Results
大食細胞の神経突起伸長活性分子因子を分泌することができる生成することができますプロトコルについて述べる。堅牢な神経突起伸長別の DRG ニューロン文化 (図 2 a) に適用されるマクロファージ db キャンプで治療共培養から得られた CM となりました。比較では、PBS 処理共培養から得られる CM でしたいない当社の 15 h 文化期間 (図 2 b) に神経突起形成を誘導します。Db キャンプは、マクロファージだけで文化と扱われとき、この状態から得られる CM は神経突起伸展 (図 2) の支援に効果的でした。これはニューロン マクロファージ相互作用が proregenerative 能力が備わっているマクロファージを刺激するために必要不可欠ではないことを示唆しています。また、CM db キャンプ扱われるニューロンだけ文化から得られる、神経突起伸長 (図 2 D) 見つからなかった場合をテストしました。
図 1: を取得する手順を示す模式図完備中型含む神経突起伸長活性します。4 時間大人の DRG ニューロン (各ウェルあたり 2 x 10 の6セル) を培養しています。その後、腹腔マクロファージは、どの後根神経節でニューロンを培養した井戸の上にある挿入も、培養します。4 h 後メッキ、PBS または調節のキャンプが扱われます。24 時間培養した後、挿入も移転さ別約 1 ml の培地でいっぱいにその後、転送もは培養 72 時間。その後、孵化の馴化培地 (CM) が収集されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 神経突起伸長の試金を使用しての代表の結果エアコンの様々 な条件から得られる媒体。(A, B)大人の DRG ニューロン急性解離や正確 15 h 2 h めっき後の培養、培地が馴化培地 (CM) どちらの PBS (A) とニューロン マクロファージ共培養から得に置き換えられた抗原キャンプ (db キャンプ) (B)。Db キャンプで治療の CM だけは、堅牢な神経突起伸長活性を出展しました。(C, D)(C) いずれかのマクロファージから成る文化から得られる CM またはニューロン (D) 単独で db キャンプと扱われたが神経突起伸長をサポートしていません。スケール バーを示す 200 μ mこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この共培養システムの生成のいくつかの重要な手順があります。マウス後根神経節ニューロンと腹腔マクロファージが新鮮な準備されていることを確認することが重要であり、健康です。我々 はすべての Drg の郭清を 30 分以上取ったとき CM の減少した神経突起伸長活性を経験しています。さらに、マクロファージの血液成分の汚染はまた CM の神経突起伸長活性の減少につながった。Db キャンプで堅牢なニューロン マクロファージ相互作用を引き出すために徹底的に洗浄もなる組織破片の完全な除去および可能性のある残りの細胞毒性の除去を確保するための重要なステップ コラゲナーゼや RBC の換散バッファーなどのコンポーネント。改めて別のポイントは、drg コードに接続されている根を可能な限り削除することです。残りの根のスタブは、DRG ニューロン培養シュワン細胞の汚染を増加させるでしょう。シュワン細胞は結果を混乱させる可能性があります文化における神経栄養因子の高い金額を生成できます。
このプロトコルでは解離マクロファージはウェル プレートの底面にメッキ DRG ニューロンから分離細胞文化挿入時のメッキでした。私たちの以前の研究では、(2 つのセル型の間の身体的接触を許可する) 直接共培養から収集した CMs の神経突起伸長活性の程度の大きな違いは表示されませんでしたで区切られた 2 つの細胞の種類と共培養して、細胞培養は、11を挿入します。この結果は、神経細胞とマクロファージが直接物理的な接触ではなく、いずれかのセルの種類からリリースされた水溶性の分子を介して相互に通信を示されました。DRG ニューロンから分泌される CCL2 はこの共培養モデル14プロ再生表現型にマクロファージを活性化するため責任があることが示されました。したがって、私たちの共培養システムはプロ再生マクロファージの活性化を仲介するより詳細な細胞間情報伝達の解明になります。
文化は、このプロトコルでは神経突起伸長試験中に 15 時間に正確に制限されました。パイロット実験のいくつかの異なる培養時間を検討し、神経突起伸長制御条件 (15 h) の最小限の範囲で、非常に堅牢な神経突起伸長は db キャンプで扱われる CM が実現された発見します。マウス後根神経節ニューロンが前処理付けない場合この時間枠の内で任意の重要な神経突起と成長はありません。DRG ニューロンは 15 時間以上培養した、しかし、彼らはコントロール、神経突起伸展に db キャンプ扱い CM の影響を覆い隠さいない前処理条件にも神経突起のある程度を表示する開始します。以前研究16ラット後根神経節ニューロンを用いた神経突起伸長試験で同様の結果が報告されました。
いくつかの以前の研究は、プロ再生表現型7,9マクロファージをアクティブにザイモサン、酵母細胞壁準備を使用しました。しかし、ザイモザンで刺激のマクロファージは、pro 再生分子だけでなく、細胞毒性の要因をリリースしました。ゲルろ過クロマトグラフィーによる分離処理ザイモザン CM マクロファージのタンパク質成分マクロファージ由来要因 ≥ 30 kDa いた細胞毒性要因 ≤ 30 kDa 推進軸索再生7中。さらに、脊髄ザイモサン注入は神経細胞と軸索の9のあからさまな死につながります。比較では、以前のものよりもより生理的にプロ再生マクロファージを生成する我々 のプロトコルを示しているザイモザンを使用します。実際には、db キャンプ後根神経節ニューロンに注入細胞損害17,18の報告なし中央支店損傷、次の成長の軸索する能力。一連の実験は、全体我々 は決して db キャンプ扱い CM のアプリケーションに続く文化の DRG ニューロン密度の任意の大幅な減少を観察しました。我々 のプロトコル同時神経毒性なしのみプロ再生マクロファージを生成することが推測された.したがって、プロトコルおよび実験モデルの報告ここで pro 再生マクロファージの分子シグネチャを識別し、プロ再生の表現型の進化がどのようなメカニズムを理解する役に立つでしょう。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
このプロトコルは、NRF-2015R1A2A1A01003410 科学省、ICT および将来計画、韓国政府からの助成金によってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors - Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
References
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