Summary
目前的协议提供了实验程序, 以刺激培养的巨噬细胞, 有能力释放分子因子, 促进突起的生长。对神经元-巨噬细胞共培养的治疗, 诱导巨噬细胞产生具有强突起活性的条件培养基。
Abstract
有确凿的证据表明巨噬细胞可以参与损伤神经系统的再生或修复。在这里, 我们描述了一个协议, 其中诱导巨噬细胞产生条件培养基 (CM), 促进突起的生长。成人背根神经节神经元是尖锐的离解和电镀。在神经元稳定附着后, 腹腔巨噬细胞在同一井上被贴上的单元培养物上进行共培养。Dibutyryl 循环放大器 (db 阵营) 适用于24小时的共培养, 之后, 细胞培养插入含有巨噬细胞被移动到另一个井收集 CM 为72小时。CM 从联合文化处理与 db 阵营, 当应用于一个单独成人背根神经节神经元文化, 展示结实突起生长活动。由单一细胞类型组成的单胞型、背根神经节或腹膜巨噬细胞所获得的突起的 CM 没有表现出其生长活性。这表明, 神经元和巨噬细胞之间的相互作用是必不可少的活化巨噬细胞分泌分子因子与突起生长活动成厘米。因此, 我们的共同培养范式也将有助于研究神经元-巨噬细胞相互作用中的细胞间信号, 以刺激巨噬细胞被赋予可再生的表型。
Introduction
在脊髓或脑损伤后, 各种研究试图增强中枢神经轴突再生。炎症反应, 不可避免地伴随着神经系统的损伤, 传统上被认为参与继发病理过程导致有害结果1,2。事实上, 能抑制炎症反应的甲基强的甲泼尼松龙是唯一经批准的治疗急性脊髓损伤的方法3。然而, 最近的研究表明, 有代表性的炎症细胞类型的巨噬细胞可以参与再生或修复受损神经系统的4,5,6。例如, 在晶状体损伤后浸润巨噬细胞产生支持再生分子, 促进视网膜神经节神经元的再生7,8。此外, 移植的背根神经节神经元增加轴突生长的区域, 巨噬细胞由酵母多糖9激活.此外, 病变部位的巨噬细胞可以为受损的周围神经创造一个生长许可的环境, 如10。
我们的研究也提供了强有力的证据, 证明巨噬细胞能促进相邻神经元轴突再生的能力。我们已经表明, 在背根神经节中的巨噬细胞活化是重要的, 以增强再生能力的节神经的感觉神经元后, 预适应周围神经系统损伤11。另一实验室12独立报告了类似的研究。我们还表明, intraganglionic 注射 dibutyryl 循环放大器 (db 阵营), 这是一个众所周知的分子, 以提高轴突再生能力的13, 诱导激活的巨噬细胞。巨噬细胞的失活消除了 db 阵营对突起生长活动的影响。随后的工程鉴定了损伤诱导神经元中 CCL2 的表达, 作为刺激细胞的信号, 可再生表型14,15。
基于上述实验结果, 我们建立了一个体外模型, 类似于在 DRGs 后发生的分子事件, 在预适应损伤模型11,14。在这个模型中, db 阵营被应用于神经元-巨噬细胞共培养诱导细胞间信号, 导致激活的巨噬细胞与支持再生表型。在这里, 我们描述了详细的协议, 我们可以生成巨噬细胞分泌分子因子促进突起的产生 (图 1)。这个实验模型说明了一个概念, 即巨噬细胞可以被刺激或诱导, 以支持轴突再生后的神经系统损伤。我们的模型也将有助于研究细胞间信号的机制, 导致激活的促再生巨噬细胞。
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Protocol
所有涉及动物的实验都得到了 Ajou 大学医学院动物保育和使用委员会的批准。
1. 游离成人背根神经节神经元的培养制备
- 在建立培养之前, 先用聚 d-赖氨酸和层粘连蛋白对6井板进行预涂。在37°c 孵化一个6井板, 0.01% 聚 d-赖氨酸, 在2小时或在4°c 上过夜。然后, 用蒸馏水洗两次盘子。
- 在室温下, 用层粘连蛋白溶液在3µg/毫升浓度下孵育板材, 然后用蒸馏水冲洗两次盘子。至少在室温下将板材干燥1小时。
- 弄死与压缩 co2气瓶相连的透明 co2腔中的鼠标。用手术刀片切开椎柱上的皮肤, 并通过双边解剖旁的肌肉以暴露椎体的骨骼。使用狭窄的外科钳, 在 DRGs 完全暴露之前, 小心切除椎体骨骼。
注: 成年 DRGs 神经元由成年 C57BL6 雄性小鼠, 年龄介于8周至12周之间。 - 使用虹膜剪刀和细尖钳在解剖显微镜下, 从 S1 一直到 C1 水平 DRGs。尽量从 DRGs 中切下根部, 以尽量减少雪旺细胞或成纤维细胞的污染。
- 将解剖过的 DRGs 保存在60毫米培养皿中, 其中5毫升冷 Dulbecco 的修饰鹰培养基 (DMEM) 在冰上, 直到所有的 DRGs 都被收集。
注意: 尽快解剖 DRGs 是至关重要的。所有 DRGs 从一只老鼠的收集不应超过30分钟30分钟后, 安乐死, 停止收集 DRGs, 并继续下一步, 即使仍然有剩余的 DRGs。 - 使用蓝色吸管尖端 (1000 µL) 将 DRGs 转移到1.5 毫升离心管, 并切断末端。使用微型离心机, 在快速旋转几秒钟后, 取出 DMEM。添加1毫升的 DMEM 含有 125 U/毫升类型的西胶原酶和孵化管90分钟以温和的旋转 (35-40 rpm) 使用扭振器在37°c 孵化器。用胶带固定在振动筛地板上的管子。
- 放弃含胶原酶的 DMEM, 加入1毫升新鲜 DMEM。等待, 直到漂浮的 DRGs 完全下沉到底部, 然后删除 DMEM 与组织碎片。重复这个洗涤步骤至少六次。
注意: 不要试图完全丢弃上清。小心不要删除任何 DRGs 与上清 DMEM。 - 使用蓝色吸管尖端 (1000 µL) 将 DRGs 转移到15毫升圆锥管, 并切断末端。然后用蓝尖 (1000 µL) 轻轻地向上和向下吸15次, 使均匀的细胞悬浮。避免制造气泡, 尽量不要用吸管尖触碰锥形管的底部。
- 离心管在 239 x g 3 分钟, 并小心地丢弃上清上漂浮的碎片。添加1毫升的 Neurobasal 培养基, 辅以 B27 (2.0% 伏/v), 并并用重悬细胞颗粒轻轻吹打向上和向下5到10倍。
- 通过 70-µm 细胞过滤器覆盖在50毫升圆锥管顶部的细胞悬浮。等待2分钟, 然后用吸管控制器将 Neurobasal/B-27 介质倒入过滤器上。
- 板所有收集的背根神经节神经元 (总共约 2 x 106背节神经元从一只老鼠) 到两个井的6井板。一只成年小鼠的背根神经节在6井板上覆盖两口井。然后将该板块放置在37°c 的 co2孵化器中, 直到巨噬细胞共培养。
2. P 原发性腹腔巨噬细胞的共培养
注: 建立离型背根神经节神经元初始电镀后4小时的共培养
- 原发腹腔巨噬细胞由成年 C57BL6 雄性小鼠在8周至12周龄之间制备。弄死在 CO2腔中的动物。细致切开腹部皮肤, 暴露腹膜, 避免切开腹膜, 防止灌洗液渗漏。
- 用一根22G 针的注射器刺穿腹膜, 将10毫升的冰冻磷酸盐缓冲 salin (PBS) 注入腹腔。轻轻按摩腹膜1-2 分钟。然后, 拔出针头, 通过穿刺部位挤出 PBS, 在50毫升锥形管中收集灌洗液。
注: 使用前, 把注射器放在冰上, 以保持 PBS 的寒冷。 - 离心冲洗液在 239 x g 10 分钟在4°c, 以颗粒的细胞成分。并用重悬3毫升的红细胞 (红细胞) 裂解缓冲液在室温下为3分钟。然后离心细胞悬浮在 239 x g 10 分钟在4°c。并用重悬颗粒与3毫升 PBS 和离心机细胞悬浮再次删除任何剩余的红细胞溶解缓冲。
注意: 确保红细胞溶解缓冲液完全清除。否则剩余的红细胞溶解缓冲液可能对培养的巨噬细胞有毒。 - 并用重悬1毫升 Neurobasal/B-27 培养基中的颗粒细胞。所有收集到的巨噬细胞的一半 (总共 3 x 106到 6 x 106单元格) 在单元格区域性插入与有效面积 4.2 cm2, 它被放置在分离的背根的井的顶部。
注: 在共培养期, 巨噬细胞生长在 Neurobasal/B-27 神经元培养基中。在这种情况下证实了巨噬细胞的充分存活。
3. 治疗 Db 营和收集巨噬细胞 CM
注: 在神经元-巨噬细胞联合培养后开始4小时的 db 营治疗。
- 添加2µL 100 µM db 阵营解决方案的神经元-巨噬细胞共培养。为控制实验添加相同体积的 PBS。
- 24小时后, 用1毫升的巨噬细胞培养培养基在同一6井板中填充空井。用巨噬细胞培养培养基将神经元-巨噬细胞共培养物中的胞培养物转移到空井。保持细胞在相同的条件下72小时, 而不改变培养基。
注: 在 cm 收集过程中, 我们只添加1毫升的巨噬细胞培养基, 以使浓缩厘米。在 CM 收集, 如果需要, 我们增加了更多的完全覆盖在插入的巨噬细胞。 - 在 72 h 以后, 离心机巨噬细胞 CM 在 239 x g 为5分钟去除细胞组分。通过0.2 µm 过滤器将上清液移除其余的细胞碎片。将收集的 CM 保存在-70 摄氏度, 直到使用。
4. 用收集到的 CM 突起生长试验
- 在建立一个单独的成人背根神经节神经元培养之前, 在1.1 和1.2 中所描述的相同的过程中, 预先涂上8井室滑块。
- 用从1.3 到1.10 的相同方法获得 Neurobasal 培养基中游离的成人背根神经节神经元, 辅以 B27。板 5 x 104单元格, 每个井到预涂8井室滑动。
- 放置在37°c 孵化器2小时的房间幻灯片, 允许细胞附着在底部。然后, 用37摄氏度预热的解冻厘米替换培养基。
注意: 移除培养基并添加收集的 CM 时, 小心不要触及8井室滑动的底部。 - 15 h 在初始电镀后, 取出培养基, 用 PBS 清洗细胞一次。然后, 加入200µL 冰冷4% 多聚甲醛溶液的水井, 并孵化细胞与多聚甲醛溶液20分钟在4°c
注: 突起的根背节神经元培养应精确限制为15小时。在这种情况下, 没有可观的突起。 - 用冷的 PBS 洗三次, 然后用10% 正常的山羊血清 (anti-Tuj-1) 与0.1% 的海卫 x 30 分钟进行阻断. 孵育固定细胞, 并以 10% (浓度为1µg/毫升) 稀释 4 h 在房间内温度或隔夜在4°c。
- 用 PBS 冲洗三次, 然后在室温下用二级抗体 (山羊-抗小鼠) 溶液孵化细胞, 2 小时。然后, 用 PBS 清洗两次, 并使用安装解决方案安装盖玻片 (24 x 50 mm) 的文化幻灯片。
- 使用荧光显微镜拍摄图像, 以可视化突起的产物。
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Representative Results
我们描述了一种能产生能分泌突起的分子因子的巨噬细胞的协议。用 db 阵营处理的共培养物获得的巨噬细胞 CM 在应用于单独的背根神经节神经元培养 (图 2A) 时产生了强健的突起。相比之下, 从 PBS 处理的共培养中获得的 CM 并没有在我们的15小时文化持续时间内诱导突起的产生 (图 2B)。当 db 阵营单独对待与巨噬细胞的文化时, 从这种情况得到的 CM 是不有效的支持突起生长 (图 2C)。这表明神经元巨噬细胞相互作用是刺激巨噬细胞被赋予 proregenerative 能力不可或缺的。我们还测试了, 如果 CM 获得从 db 阵营处理的仅神经元的文化, 并没有发现突起的结果 (图 2D)。
图 1: 一个示意图, 说明了获取含有突起的条件介质的过程.成人背根背节神经元 (每井 2 x 106细胞) 培养为 4 h。然后, 腹腔巨噬细胞在插入井中培养, 位于神经节神经元培养的井上方。4 h 在电镀以后, PBS 或 dibutyryl 阵营被对待。在24小时的孵化后, 插入井被转移到另一井充满约1ml 介质。然后, 转移井孵化72小时。然后, 收集了孵化条件培养基 (CM)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 使用条件培养基获得的不同情况下的突起结果.(A、B)成人背根神经节神经元在电镀后完全分离, 培养为15小时2小时, 培养基被条件培养基 (CM) 所取代, 由由 PBS (A) 或 dibutyryl 营 (B) 处理的神经元-巨噬细胞共同培养物所获得。只有用 db 营处理的 CM 表现出强健的突起生长活性。(C、D)从由巨噬细胞 (C) 或神经元 (D) 组成的不同的培养中获得的 CM 不支持突起的生长。刻度条指示200µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
这一共同文化体系的产生有几个关键步骤。重要的是要确保小鼠背节神经元和腹腔巨噬细胞的准备新鲜和健康。当所有的 DRGs 的解剖都超过30分钟时, 我们经历了突起的 CM 生长活动。此外, 腹腔巨噬细胞中血液成分的污染也导致了突起在 CM 中的生长活动减少。为了通过 db 阵营诱发强健的神经元巨噬细胞相互作用, 彻底冲洗也将是确保完全清除组织碎片和消除可能残留的细胞毒成分, 如胶原酶或红细胞溶解缓冲物的关键步骤。另一点要重申的是, 应尽可能删除附加到 DRGs 的根。根的残余存根将增加雪旺细胞在背节神经元培养中的污染。雪旺细胞可以产生大量的神经营养因子的文化, 可能混淆的结果。
在这个协议中, 游离巨噬细胞被镀在细胞培养插入物分离的背节神经元镀在底部的井板。我们以前的研究没有显示出显著的差异, 从直接共培养的 CMs (允许两个细胞类型之间的物理接触) 和共培养的突起生长活动的程度, 与两个细胞类型分离单元格区域性插入11。这一结果表明, 神经元和巨噬细胞通过从任何一种细胞类型释放的可溶性分子相互通信, 而不是通过直接的物理接触。结果表明, 神经节神经元分泌的 CCL2, 在这种共培养模型14中, 负责激活巨噬细胞, 使其成为一种支持再生的表型。因此, 我们的共同培养系统将允许澄清更详细的细胞间信号, 调解激活的促再生巨噬细胞。
在本议定书的突起中, 这种培养被精确地限制为15小时。在实验中, 我们研究了几种不同的培养时间, 发现在控制条件 (15 h) 的突起的最小范围内, 高度健壮的突起生长是通过使用 db 营处理的 CM 获得的。小鼠根背节神经元, 如果不预先条件, 不生长任何重要的突起在这个时间框架内。然而, 如果根节神经节神经元的培养时间长于15小时, 它们就会在控制中显示出某种程度的突起, 而不是预先条件, 这将掩盖 db 阵营治疗的 CM 对突起产生的任何影响。在前一项研究中, 使用大鼠背根神经节神经元进行的突起生长试验中也有类似的结果16。
以前的一些研究使用酵母多糖, 酵母细胞壁制备, 激活细胞的支持再生表型 7, 9.然而, 酵母多糖刺激的巨噬细胞不仅释放了支持再生的分子, 而且还发布了细胞毒性因子。用凝胶-过滤色谱法分离酵母多糖治疗巨噬细胞中的蛋白质组分时, 巨噬细胞衍生因子≥ 30 kDa 为细胞毒性, 因子≤ 30 kDa 促进轴突再生 7.此外, 酵母多糖注射液对脊髓可能导致明显死亡的神经元和轴突 9.相比之下, 我们的生成支持再生巨噬细胞的协议显示, 比前一个使用酵母多糖的更具生理学。事实上, 在中心分支受伤后, 对根神经节神经元的 db 注入增强了它们的生长轴突能力, 而没有任何关于细胞损伤的报告17,18。在我们的一系列实验中, 我们从未观察到在应用了 db 治疗后的 CM 后, 在培养过程中, 神经节神经元密度的显著降低。我们推测, 我们的协议允许我们生产完全支持再生的巨噬细胞而不并发神经毒性。因此, 在这里报告的协议和实验模型将有助于识别支持再生巨噬细胞的分子特征, 并通过何种机制来理解促再生型的形成。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该议定书得到了大韩民国科学、信息和通信技术和未来规划部赠款 NRF-2015R1A2A1A01003410 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors - Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
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