Summary
Le protocole actuel présente des procédures expérimentales afin de stimuler les macrophages à être doté d’une capacité de libérer les facteurs moléculaires qui favorisent la croissance des neurites. Traitement du cAMP aux cultures neuron-macrophage co induit les macrophages pour produire un milieu conditionné qui possède une activité l’excroissance des neurites forte.
Abstract
Il y a des preuves solides que les macrophages peuvent participer à la régénération ou la réparation des blessés du système nerveux. Nous décrivons ici un protocole dans lequel les macrophages sont induites au moyen de produits conditionnés (CM) qui favorise la croissance des neurites. Neurones ganglionnaires (DRG) adulte de la racine dorsale sont parfaitement dissociées et plaqués. Après que les neurones sont solidement attachés, les macrophages péritonéaux sont conjointement cultivées sur un insert de culture cellulaire superposé sur le même bien. Dibutyryl QU'AMP cyclique (AMPc-db) est appliquée aux cultures co pendant 24 h, après quoi la culture cellulaire insert contenant les macrophages est déplacé vers un autre puits pour recueillir des CM pendant 72 h. Le CM des cultures co traités avec db-cAMP, lorsqu’il est appliqué à une culture de neurone DRG adulte séparée, présente une activité l’excroissance des neurites robuste. Le CM obtenu à partir des cultures traitées db-cAMP constitué de cellules du même type seul, neurone DRG ou macrophages péritonéaux, ne montrent pas d’activité de l’excroissance des neurites. Cela indique que l’interaction entre les neurones et les macrophages est indispensable pour l’activation des macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires avec activité l’excroissance des neurites en CM. Ainsi, notre paradigme de co-culture sera aussi utile pour étudier la signalisation intercellulaire dans les interactions neurone-macrophage pour stimuler les macrophages à être doté d’un phénotype pro-régénérative.
Introduction
Diverses études ont cherché à améliorer la régénération axonale CNS après les blessures de la moelle épinière ou du cerveau. Des réactions inflammatoires, inévitablement accompagnant les lésions du système nerveux, sont traditionnellement perçues comme de participer à des processus pathologiques secondaires menant à des résultats néfastes1,2. En effet, la méthylprednisolone qui peut supprimer les réactions inflammatoires est le seul traitement approuvé pour médullaires graves blessures3. Toutefois, des études plus récentes ont fourni des preuves que les macrophages, un type de cellules inflammatoires représentative, peuvent participer à la régénération ou la réparation du système nerveux lésé4,5,6. Par exemple, infiltration de macrophages suite à une lentille blessure produits pro-régénérative des molécules pour favoriser la régénération des neurones ganglionnaires rétiniennes7,8. En outre, les neurones transplantés de DRG a augmenté la croissance axonale jusqu'à la région où les macrophages activés par zymosan9. En outre, les macrophages à l’emplacement de la lésion peuvent créer un milieu de croissance-permissive pour les nerfs périphériques blessé10.
Notre travail a également fourni des preuves solides que les macrophages peuvent contribuer à la capacité de régénération des axones des neurones adjacents. Nous avons montré que l’activation des macrophages dans les ganglions de la racine dorsale (GRD) ont été essentiels dans la capacité de régénération améliorée des DRG neurones sensoriels, suite à un périphérique de préconditionnement nerf blessures11. Un autre laboratoire12a été signalée indépendamment des recherches similaires. Nous avons également montré que l’injection intraganglionic de dibutyryl AMP cyclique (AMPc-db), qui est une molécule connue pour renforcer la capacité de régénération axonale13, induit l’activation des macrophages. La désactivation des macrophages aboli les effets du db-cAMP sur l’activité de l’excroissance des neurites. Les œuvres ultérieures identifiées expression induite par la blessure de CCL2 dans les neurones comme un signal pour stimuler des macrophages avec un phénotype pro-régénérative14,15.
Basé sur les résultats expérimentaux ci-dessus, nous avons établi un modèle in vitro ressemblant à des événements moléculaires qui interviennent dans les DRGs suite à une blessure préconditionnement modèle11,14. Dans ce modèle, db-cAMP est appliquée aux cultures neuron-macrophage co suscitant intercellulaires de signalisation qui aboutit à l’activation des macrophages avec un phénotype pro-régénérative. Nous décrivons ici les protocoles détaillés par lequel nous pouvons produire des macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires qui favorisent la croissance neuritique (Figure 1). Ce modèle expérimental illustre un concept que macrophages peuvent être stimulées ou amenés à soutenir la régénération axonale après les blessures du système nerveux. Notre modèle sera également utile dans l’étude des mécanismes de signalisation intercellulaire qui aboutit à l’activation des macrophages pro-régénérative.
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Protocol
Toutes les expériences impliquant des animaux ont été approuvées par l’utilisation Comité d’Ajou University School of Medicine et un animalier institutionnel.
1. culture préparation du neurone dissociés DRG adulte
- Avant la mise en place de la culture, préalablement recouvrir une plaque 6 puits poly-D-lysine et de la laminine. Incuber une plaque 6 puits avec 0,01 % poly-D-lysine à 37° C pendant 2 h ou à 4° C jusqu’au lendemain. Ensuite, laver la plaque deux fois avec de l’eau distillée.
- Incuber la plaque avec la laminine solution à une concentration de 3 µg/mL pendant 2 h à température ambiante et laver la plaque deux fois avec de l’eau distillée. Sécher la plaque à température ambiante pendant au moins 1 h.
- Euthanasier une souris dans une chambre de2 CO transparente reliée à une bouteille de gaz comprimée CO2 . Inciser la peau recouvrant la colonne vertébrale avec une lame chirurgicale et disséquer les muscles paravertébraux bilatéralement pour exposer l’OS vertébrales. Enlever les os vertébrales méticuleusement à l’aide un rongeur chirurgical de pointe étroite jusqu'à ce que les GHM est entièrement exposés.
NOTE : Les neurones adultes DRGs proviennent des souris mâles C57BL6 adultes âgés de 8 semaines à 12 semaines. - Retirer les DRGs bilatéral de la S1 tout le chemin jusqu’au niveau de la C1 à l’aide de ciseaux iridectomie et pinces à pointe fine sous un microscope à dissection. Essayez de couper les racines entièrement à partir de DRGs afin de minimiser la contamination des cellules de Schwann ou les fibroblastes.
- Stocker les DRGs découpées dans une boîte de Pétri contenant 5 mL de Dulbecco froid modifié Eagle (DMEM) sur la glace jusqu'à ce que tous les GHM est collectés de 60 mm.
Remarque : Il est essentiel de disséquer les DRGs aussi rapidement que possible. La collection des tous les GHM de souris ne devrait pas prendre plue de 30 min. 30 min après l’euthanasie, cesser de collecter les DRGs et procéder à l’étape suivante, même si il sont en restant DRGs. - Transférer les DRGs à un 1,5 mL tube Eppendorf à l’aide d’un embout de la pipette bleu (1000 µL) avec une extrémité de la ligne de coupure. Enlever le DMEM après un essorage rapide pendant plusieurs secondes en utilisant une centrifugeuse minie. Ajouter 1 mL de DMEM contenant 125 collagénase de XI de type U/mL et incuber le tube pendant 90 min avec une légère rotation (35-40 tr/min) à l’aide d’un agitateur twister dans un incubateur à 37 ° C. Immobiliser le tube sur le plancher de l’agitateur à l’aide de la bande.
- Jetez DMEM contenant collagénase et ajouter 1 mL de DMEM fraîche. Attendez que les DRGs flottants s’enfoncer complètement vers le bas, puis retirez le DMEM avec les débris tissulaires. Répétez cette étape de lavage au moins six fois.
Remarque : Ne pas tenter d’éliminer le liquide surnageant complètement. Veillez à ne pas supprimer n’importe quel DRGs avec le surnageant DMEM. - Transférer les DRGs dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’un embout de la pipette bleu (1000 µL) avec une extrémité de la ligne de coupure. Pipetter puis monte et descend doucement au moins 15 fois à l’aide d’une pointe de bleue (1000 µL) pour produire une suspension cellulaire homogène. Éviter de faire des bulles et essayez de ne pas toucher le fond du tube à fond conique avec un embout de la pipette.
- Centrifuger le tube à 239 x g pendant 3 min et éliminer délicatement le surnageant avec bris flottants. Ajouter 1 mL de Neurobasal additionné de B27 (2,0 % v/v) et Resuspendre le culot cellulaire en pipettant également doucement et descendre de 5 à 10 fois.
- Passer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule de 70 µm placée au-dessus d’un tube conique de 50 mL. Attendez 2 min et puis versez moyenne Neurobasal/B-27 sur la crépine à l’aide d’un pipeteur.
- Plaque de tous les neurones prélevés DRG (un total d’environ 2 x 106 neurones DRG d’une souris) sur deux puits de la plaque 6 puits. Les neurones d’une souris adulte DRG couvrent deux puits dans une plaque 6 puits. Puis placer la plaque dans un incubateur à CO2 à 37 ° C jusqu'à ce que les macrophages des cultures.
2. la co-culture de P primaires des Macrophages péritonéaux sur Culture de cellules A Insérer
Remarque : Établir les cultures co 4 h après le placage initial des neurones dissociés DRG
- Les macrophages péritonéaux primaires sont préparés à partir de souris mâles C57BL6 adultes âgés de 8 semaines à 12 semaines. Euthanasier un animal dans une chambre de CO2 . Inciser la peau abdominale délicatement, exposer le péritoine et éviter de couper le péritoine pour empêcher une fuite de liquide de lavage.
- Perforation du péritoine à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 22G et injecter 10 mL de glacee tampon phosphate salin (PBS) dans la cavité péritonéale. Massez délicatement le péritoine pendant 1-2 min. Ensuite, retirer l’aiguille et faire sortir les PBS à travers le site de ponction de l’aiguille et recueillir le liquide de lavage dans un tube conique de 50 mL.
Remarque : Avant utilisation, placer la seringue sur la glace pour maintenir la froideur de la PBS. - Centrifuger le liquide de lavage à 239 x g pendant 10 min à 4 ° C pour granuler les composants cellulaires. Resuspendre le culot avec 3 mL du tampon de lyse des globules rouges (RBC) pendant 3 min à température ambiante. Centrifuger la suspension cellulaire à nouveau à 239 x g pendant 10 min à 4 ° C. Resuspendre le culot avec 3 mL de PBS et centrifuger la suspension cellulaire à nouveau pour enlever n’importe quel tampon de lyse RBC restante.
Remarque : Assurez-vous que le tampon de lyse RBC est totalement supprimé. Dans le cas contraire tampon de lyse RBC restant peut-être être toxique pour les macrophages en culture. - Remettre en suspension les cellules boulettes dans 1 mL de milieu Neurobasal/B-27. Plaque de la moitié de tous les macrophages prélevés (un total de 3 × 106 6 x 106 cellules) sur un insert de culture cellulaire avec la surface équivalente de 4,2 cm2, qui est placé sur le puits de DRG dissociée.
Remarque : Au cours de la période de culture mixte, macrophages sont cultivées dans un milieu de culture pour le neurone Neurobasal/B-27. Survie adéquate des macrophages sous cette condition a été confirmée.
3. traitement des Db-Camp et Collection de Macrophage CM
NOTE : Commencer le traitement de db-cAMP 4 h après les co-cultures neuron-macrophage.
- Ajouter 2 µL de solution de db-cAMP de 100 µM aux co-cultures neuron-macrophage. Ajouter le même volume de PBS pour une expérience de contrôle.
- Après 24h, remplir un puits vide avec 1 mL de milieu de culture de macrophage dans la même plaque 6 puits. Transférer l’insert de culture cellulaire dans les cultures co neuron-macrophage dans le puits vide avec milieu de culture de macrophage. Garder les cellules dans les mêmes conditions pendant 72 h sans changer le support.
Remarque : Nous ajoutons seulement 1 mL de milieu de culture de macrophage pendant CM collection faire concentré CM. Lors de la collecte de CM, si nécessaire, nous avons ajouté plus d’efforts pour couvrir complètement les macrophages dans l’insert. - Après 72 h, centrifuger le macrophage CM à 239 x g pendant 5 min supprimer les composants cellulaires. Passez le liquide surnageant à travers un filtre de 0,2 µm pour éliminer les débris cellulaires restants. Conserver le CM recueillie à-70 ° C jusqu'à l’utilisation.
4. la croissance des neurites dosage avec CM recueillie
- Avant de fonder une culture distincte de neurone DRG adulte, pré enduire une lame de 8 puits chambre suivant la même procédure décrite en 1.1 et 1.2.
- Obtenir les neurones adultes dissociés de DRG dans Neurobasal additionné de B27 utilisant les mêmes méthodes décrits de 1.3 à 1.10. Plaque de 5 x 104 cellules / puits sur le toboggan de la chambre de 8 puits revêtus.
- Placez la chambre dans un incubateur à 37 ° C pendant 2 h, permettant aux cellules d’attacher au fond. Ensuite, remplacez le milieu de culture avec la dégelée CM qui est préalablement chauffé à 37 ° C.
Remarque : Veillez à ne pas toucher le fond de la diapositive 8 puits chambre lors du retrait du milieu de culture et en ajoutant le CM recueillie. - 15 h après les ensemencements initiaux, retirez le support et laver les cellules avec du PBS une fois. Ensuite, ajouter 200 µL de solution de paraformaldéhyde glacée 4 % dans les puits et incuber les cellules avec la solution de paraformaldéhyde pendant 20 min à 4 ° C
Remarque : La culture de neurone DRG pour l’analyse de l’excroissance des neurites doit être précisément limitée à 15 h. Dans ces conditions, il n’y a aucun neurites appréciable. - Laver trois fois avec du PBS glacée et puis exécutez bloquant avec 10 % sérum de chèvre normal (NGS) avec 0,1 % Triton-X pour 30 min. Incuber les cellules fixes avec la solution d’anticorps primaire (anti-Tuj-1) diluée avec 10 % NGS (à une concentration de 1 µg/mL) pendant 4 h à la salle température ou toute une nuit à 4 ° C.
- Laver trois fois avec du PBS et puis incuber les cellules avec solution (chèvre-anti souris) anticorps secondaire pendant 2 h à température ambiante. Ensuite, laver deux fois avec du PBS et monter la lame de la culture avec une lamelle couvre-objet (24 × 50 mm) à l’aide de la solution de montage.
- Prendre des photos à l’aide d’un microscope à fluorescence pour visualiser des neurites.
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Representative Results
Les auteurs décrivent un protocole qui peut générer des macrophages capables de sécréter des facteurs moléculaires avec l’activité de l’excroissance des neurites. Le macrophage CM obtenu à partir des co-cultures traités avec db-cAMP a entraîné la croissance des neurites robuste lorsqu’elle est appliquée à une culture distincte du neurone DRG (Figure 2 a). En comparaison, CM obtenu à partir des co-cultures imprégnées de PBS n’induit pas la croissance des neurites dans notre durée de culture 15h (Figure 2 b). Lorsque db-cAMP est traitée pour la culture avec des macrophages seul, CM obtenu à partir de cette condition n’était pas efficace pour appuyer la croissance neuritique (Figure 2). Ceci suggère que les interactions neurone-macrophage sont indispensable pour stimuler les macrophages à être doté d’une capacité de proregenerative. Nous avons aussi testé si CM provenant de traités db-cAMP de neurone seule culture et ne trouvé aucune croissance neuritique (Figure 2D).
Figure 1 : un diagramme schématique illustrant les procédures pour obtenir conditionné moyenne activité conteneur de l’excroissance des neurites. Les neurones adultes de DRG (2 x 106 cellules / chaque puits) sont mis en culture pendant 4 h. Puis, macrophages péritonéaux sont cultivées en insert bien, située au-dessus du puits dans lequel DRG neurones ont été cultivés. 4 h après l’ensemencement, PBS ou dibutyryl cAMP est traitée. Après 24 h d’incubation, l’insert est bien transférée dans un autre puits rempli d’environ 1 ml de milieu. Ensuite, le transfert bien est incubé pendant 72 h. Ensuite, le milieu conditionné couvé (CM) est collecté. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : résultats représentatifs des neurites excroissance dosage utilisant conditionné provenant de diverses conditions de milieu. (A, B) Les neurones adultes DRG sont dissociés aiguë et cultivées pendant exactement 15 h 2 h après l’ensemencement, milieu de culture a été remplacé par un milieu conditionné (CM) provenant des co-cultures de neurone-macrophages traités avec PBS (A) ou dibutyryl cAMP (db-cAMP) (B). Que le CM traité avec db-cAMP a manifesté une activité l’excroissance des neurites robuste. (C, D) CM provenant de cultures consistant en un macrophage (C) ou neurone (D) seul qui a été traité avec db-cAMP n’était pas favorable à la croissance des neurites. Barres d’échelle indiquent 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Il y a plusieurs étapes cruciales pour la génération de ce système de culture mixte. Il est important de s’assurer que les neurones de souris DRG et macrophages péritonéaux sont préparés frais et sain. Nous avons vécu activité l’excroissance des neurites diminuée du CM lors de la dissection des tous les GHM a pris plus de 30 min. En outre, la contamination de produits sanguins labiles dans les macrophages péritonéaux a également conduit à une diminution de l’activité de l’excroissance des neurites dans le CM. Afin de susciter des interactions neurone-macrophage robuste par db-cAMP, lavage complet serait également une étape essentielle pour assurer l’élimination complète des débris tissulaires et l’élimination des restant potentiellement cytotoxique composants, tels que la collagénase ou tampon de lyse de RBC. Un autre point à rappeler est que les racines attachés à DRGs devraient être retirés autant que possible. Restant des talons des racines augmenterait la contamination des cellules de Schwann dans la culture de neurones DRG. Les cellules de Schwann peuvent produire une quantité élevée de facteurs neurotrophiques en culture qui pourrait confondre les résultats.
Dans ce protocole, dissociées des macrophages ont été cultivés sur un insert de culture cellulaire séparé les neurones DRG plaqués sur le fond de la plaque bien. Notre étude précédente n’a pas montré de différence significative dans la mesure de l’activité de l’excroissance des neurites entre le CMs prélevés dans des co-cultures directs (ce qui permet des contacts physiques entre les deux types cellulaires) et les cultures co avec les deux types cellulaires séparant par un culture cellulaire insérer11. Ce résultat indique que les neurones et les macrophages communiquent entre eux par l’intermédiaire de molécules solubles libérés des ou l’autre type de cellule, pas par des contacts physiques directs. Il a été démontré que CCL2, sécrétée par les neurones de la DRG, est responsable de l’activation des macrophages dans un phénotype pro-régénératrice dans cette culture mixte modèle14. Ainsi, notre système de co-culture permettra à l’élucidation de la signalisation intercellulaire plus détaillée qui intervient dans l’activation des macrophages pro-régénérative.
La culture était précisément limitée à 15 h pendant le test de l’excroissance des neurites dans le présent protocole. Dans des expériences pilotes, nous avons examinée plusieurs fois de culture différente et qu’avec une mesure minimale des neurites en état de contrôle (15 h), la croissance des neurites très robuste a été atteint avec le CM traité avec db-cAMP. Des neurones de souris DRG, si ne pas préconditionnés, ne poussent pas toute neurites significative dans ce laps de temps. Si les neurones DRG sont cultivées à plus de 15 h, cependant, ils commencent à montrer une certaine croissance neuritique même en contrôle, état pas préconditionné, ce qui risque de masquer n’importe quel effet du CM traités db-cAMP sur la croissance des neurites. Résultat similaire a été signalé dans le dosage de l’excroissance des neurites à l’aide de neurones de rat DRG dans une précédente étude16.
Certaines études antérieures utilisé zymosan, une préparation de la paroi cellulaire de levure, d’activer les macrophages par un phénotype régénératrice pro7,9. Cependant, les macrophages stimulés par zymosan diffusé non seulement des molécules pro-régénératrices, mais aussi des facteurs cytotoxiques. Quand les constituants protéiques dans les macrophages CM traité avec zymosan ont été séparés par chromatographie de filtration sur gel, macrophages dérivés facteurs ≥ 30 kDa étaient cytotoxiques tandis que facteurs ≤ 30 kDa promu de régénération axonale7. En outre, injection zymosan à la moelle épinière peut être mortel manifeste des neurones et des axones9. En comparaison, notre protocole pour générer des macrophages pro-régénératrice s’avéré plus physiologique que la précédente à l’aide d’opsonisé. En fait, db-cAMP injection aux neurones DRG amélioré leur capacité d’axones de croissance suite à une blessure du pouvoir central sans aucun rapport de dommages cellulaires17,18. Dans toute une série de nos expériences, nous n’avons jamais observé toute diminution significative de la densité de neurone DRG la culture après l’application des traités db-cAMP de CM. Nous croyons que notre protocole nous permet de produire uniquement pro-régénérative macrophages sans neurotoxicité simultanée. Par conséquent, le protocole et le modèle expérimental présentés ici serait utile pour identifier les signatures moléculaires des macrophages pro-régénératrice et de comprendre par quels mécanismes le phénotype pro-régénératrice est évolué.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce protocole est supporté par une subvention de FRO-2015R1A2A1A01003410 du ministère de la Science, TIC et planification Future, République de Corée.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors - Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
References
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