حقن الخلية الداخلية عبر كتلة من الخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى ارتفاع في أسعار تشيميريسم
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لزيادة إنتاج الوهم دون الاستخدام المعدات الجديدة. يمكن تغيير اتجاه بسيط للجنين لحقن زيادة عدد الأجنة المنتجة، ويساعد على تقليل الفترة الزمنية لنقل الخط.
Abstract
في محاولة لزيادة الكفاءة في خلق الفئران المعدلة وراثيا عن طريق منهجيات خلية دإط، نقدم لتكيف لبروتوكول الحقن الكيسة الحالي. هنا يمكننا تقرير أن دوران بسيطة للجنين، وحقن من خلال كتلة الخلايا الداخلية عبر (تكم) زيادة النسبة المئوية للفئران تشيميريك من 31 في المائة إلى 50 في المائة، مع أي معدات إضافية أو مزيدا من التدريب المتخصص. 26 مختلفة فطري الحيوانات المستنسخة، وتم حقن الحيوانات المستنسخة إجمالي 35 خلال فترة 9 أشهر. كان هناك لا اختلاف كبير في معدل الحمل أو معدل الاسترداد الأجنة بين تقنيات الحقن التقليدية وتكم. ولذلك، دون أي تغيير رئيسي في عملية الحقن والمواقع بسيطة الكيسة والحقن من خلال ICM، الإفراج عن خلايا ES في تجويف blastocoel يمكن أن يحتمل أن تحسين كمية الإنتاج تشيميريك واللاحقة نقل الخط.
Introduction
لما يقرب من 25 عاماً، تم إنشاء الفئران وراثيا المستهدف عملية بطيئة، كثيرا ما تعرقل باختناق في مرحلة microinjection blastocysts دإط الخلايا لتوليد germline تحيل التركيبات. التطورات الأخيرة، بما في ذلك كريسبر/Cas91،2 استهداف دإط الخلايا ووفاق الفائق الخلية اتحادات جيل مثل كومب، تحسنت الجيل/توافر دإط الخلايا المحورة وراثيا. ومع ذلك، يظل توليد التركيبات germline عنق زجاجة في خلق الفئران المعدلة وراثيا من هذه الخلايا ES3،4. مشاريع توليد خلايا ES الفائق ابتليت بتقلب عالية في وفاق خلية الجودة، هو أمر حاسم لنجاح إنشاء التركيبات germline. بالإضافة إلى ذلك، بعض خطوط الخلية ES المستخدمة عادة معروفة انيوبلويدي العالية، وصعوبة إنتاج germline التركيبات المختصة5.
تم تطوير العديد من الأساليب لخلق الفئران مع أما حلما أعلى، أو تماما المستمدة خلية ES الفئران6،،من78،،من910. بينما كل من هذه الأنظمة له مزاياه الخاصة، كما أن لها عيوبها. توليد التركيبات تيترابلويد، في حين توليد 100% وفاق الخلية المستمدة من الفئران، غير فعالة، وتقتصر عموما على خطوط أووتبريد 5،6. أحدث أساليب الحقن morula يمكن أن تسفر عن ارتفاع نسبة التركيبات، تقترب من 100%، لكن عموما تتطلب معدات إضافية هامة (أشعة الليزر أو بيزوس) وتدريب10،11. في المختبرات حيث هذه التقنيات موجودة بالفعل، قد لا تكون هذه المنهجية الجديدة الضرورية.
وكان الهدف من هذه الدراسة لإيجاد أسلوب يستخدم التقنيات الشائعة والمعدات متاحة بسهولة لزيادة معدل توليد الوهم، وزيادة فرصة انتقال germline اليل متحولة لإنشاء مستعمرة الماوس اللاحقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكان يعتقد منذ فترة طويلة أن أي اضطراب الرياضيات يمكن أن يؤدي إلى وفيات، في الواقع، بروتوكولات microinjection الكيسة الحالي ما زال التحذير من هذا12،13. ما أثبتنا هنا أن microinjection من خلال مؤسسة أي سي أم لا يضر بالجنين، وزيادة عائد التركيبات.
لا تم التعرف …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث [جزئيا] “برنامج البحوث الداخلية” للمعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية. خاص بفضل بيدادى شيامال للتحليل الإحصائي. كما نود أن نشكر ياو همفري والطيور غاري اراو يوكي لاستعراض هذه المخطوطات، و “ديمايو فرانكو” لمواصلة تقديم الدعم والمشورة.
Materials
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. . Manipulating the Mouse embryo. , (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. . Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).
