トランス内部細胞のキメリズム率が高いため、胚性幹細胞の大量注入
Summary
ここで新しい機器を使用せずキメラを増産するためのプロトコルを提案する.胚の注入のための簡単な方向の変更は生産、胚の数を増やすし、潜在生殖するタイムラインを削減できます。
Abstract
ES 細胞の方法論による遺伝子改変マウスの作成の効率を上げるために、現在の胚盤胞の注入のプロトコルへの適応を提案する.単純な回転胚とトランス内部細胞塊 (TICM) を注射が追加の機器の 50% 31% からキメラマウスの割合を増加またはさらに特殊な訓練を行った。26 の異なるクローンを近交系し、9 ヶ月の期間にわたって 35 合計クローンを注入しました。伝統的な注入技術と TICM 間妊娠率や胚の回収率に有意差はありませんでした。したがって、注入プロセスと胚盤胞の単純なポジショニングと ICM を注入することですべての主要な変更、なし胞胚腔腔に ES 細胞を解放可能性があります向上できますキメラの生産、その後量生殖。
Introduction
約 25 年間、遺伝子ターゲットのマウスの作成は生殖系列キメラを送信の世代のため、胚盤胞 ES 細胞インジェクション段階でしばしばボトルネックによって妨げ、ゆっくりとしたプロセスをされています。CRISPR/Cas91,2 ES 細胞と高スループット ES のターゲットを含む、最近の進歩は携帯サイト制作のような生成コンソーシアム、遺伝子組み換え ES 細胞の生成/可用性を改善しています。ただし、生殖巣キメラの生成は、これらの ES 細胞3,4から遺伝子改変マウスの作成にボトルネック残ります。高スループット ES 細胞世代プロジェクトは、生殖系列キメラの作成に成功のために重大である ES 細胞質の高い変動に悩まされています。さらに、一般利用の ES 細胞株の高い異数性と生殖系列キメラ主務5の困難な生産の知られています。
いずれか高いキメラとマウスを作成するための多くの方法が開発されている、または完全に ES 細胞マウス6,7,8,9,10。これらの各システムは、独自のメリットが、また自分の欠点があります。非効率的、四倍体キメラ、マウス由来 100 %es 細胞の生成間の世代でありザイモグラム行5,6に一般に限られました。桑実胚に注入する新しい方法は、100% に近づいている高パーセントキメラをもたらすが、一般的に重要な追加機器 (レーザーまたは piezos) とトレーニング10,11が必要です。研究所は、これらの技術が既に場所で、この新しい手法が必要場合がかもしれません。
本研究の目的は、後続のマウスのコロニーを確立する突然変異体の対立遺伝子の生殖細胞感染の機会が増え、キメラ世代の率を高めるための一般的な技法と容易に利用可能な機器を使用する方法を見つけることだった。
Protocol
Representative Results
Discussion
ICM の妨害につながることを死亡、実際には、現在の胚盤胞マイクロインジェクション プロトコルはまだこの12,13の警告それが長く考えられてしまった。我々 がここで示されているものは、マイクロインジェクション ICM を通して胎児に悪影響はないとキメラの収量を増加させます。
この効果の正確なメカニズムは特定されて?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH、国立環境衛生研究所の学内研究プログラムによって [一部] 支えられました。統計分析のために Shyamal Peddada 感謝します。私たちはまた彼の継続的なサポートやアドバイスをこの原稿とフランコ DeMayo のレビュー ハンフリー八尾、ゲイリー鳥と結城荒尾を感謝したいと思います。
Materials
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
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