TRANS-intérieur cellulaire massive Injection de cellules souches embryonnaires conduit à des taux plus élevés de chimérisme
Summary
Nous présentons ici un protocole visant à augmenter la production de chimère sans l’utilisation de nouveaux équipements. Un changement d’orientation simple de l’embryon pour injection peut augmenter le nombre d’embryons obtenus et potentiellement réduire la chronologie à la transmission de la lignée germinale.
Abstract
Dans le but d’accroître l’efficacité dans la création de souris génétiquement modifiées par l’intermédiaire de méthodes ES cellules, nous présentons une adaptation à l’actuel protocole d’injection de blastocyste. Nous rapportons ici qu’une simple rotation de l’embryon et l’injection à travers une masse cellulaire interne-Trans (TICM) a augmenté le pourcentage de souris chimériques de 31 % à 50 %, sans équipement supplémentaire ou une formation plus spécialisée. 26 différentes lignées autofécondées clones et 35 totales clones ont été injectés sur une période de 9 mois. Il n’y avait aucune différence significative dans les taux de grossesse ou les taux de récupération d’embryons entre des techniques d’injection traditionnelles et TICM. Par conséquent, sans aucune modification majeure dans le processus d’injection et un positionnement simple du blastocyste et injecter par l’intermédiaire de l’ICM, libérant les cellules ES dans la cavité du blastocèle peut potentiellement améliorer la quantité de production chimérique et ultérieures transmission de la lignée germinale.
Introduction
Depuis près de 25 ans, la création de souris génétiquement ciblées est un processus lent, souvent entravé par un goulot d’étranglement au stade de blastocystes ES cellules microinjection pour la génération de la lignée germinale transmettant des chimères. Des avancées récentes, y compris CRISPR/Cas91,2 , le ciblage des cellules ES et ES haut débit cell consortiums de génération comme KOMP, ont amélioré la génération/disponibilité des cellules génétiquement modifiées. Cependant, la génération de la lignée germinale chimères reste un goulot d’étranglement dans la création de souris génétiquement modifiées de ces ES cellules3,4. Projets de production de haut débit ES cellules ont été en proie à la grande variabilité dans la qualité de cellules ES, ce qui est essentielle pour le succès de la création de chimères de la lignée germinale. En outre, certains des lignées de cellules ES couramment utilisées sont connus pour aneuploïdie élevée et la production difficile de germline chimères compétentes5.
Plusieurs méthodes ont été développées pour la création de souris avec une chimère soit supérieure ou complètement ES cellule dérivée souris6,7,8,9,10. Alors que chacun de ces systèmes a ses propres mérites, ils ont aussi leurs défauts. La génération de chimères tétraploïdes, tout en générant des cellules ES 100 % provenant de souris, est inefficace et généralement limité à des lignes non consanguins 5,6. Des méthodes plus récentes de l’injection de morula peuvent céder le pourcentage élevé de chimères, approchant les 100 %, mais généralement nécessitent un équipement supplémentaire significatif (lasers ou piezos) et la formation10,11. Dans les laboratoires où ces techniques sont déjà en place, cette nouvelle méthode ne peut pas être nécessaire.
Cette étude avait pour but de trouver une méthode qui utilise les techniques courantes et des équipements disponibles pour augmenter le taux de génération de chimère, augmentant les chances de transmission de la lignée germinale de l’allèle mutant pour établir la colonie de souris ultérieures.
Protocol
Representative Results
Discussion
On a longtemps pensé que toute perturbation de l’ICM pourrait conduire à la mortalité, en effet, les protocoles actuels de microinjection de blastocyste toujours avertissent de cette12,13. Ce que nous avons montré ici est que la microinjection par le biais de l’ICM ne nuire pas à l’embryon et augmente le rendement de chimères.
Le mécanisme exact de cet effet n’a pas été identifié. Cependant, la rupture mécanique de l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée [en partie] par le programme de recherche intra-muros de la NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Merci à Shyamal Peddada pour l’analyse statistique. Nous tiens également à remercier Humphrey Yao, Gary Bird et Yuki Arao pour l’examen de ce manuscrit et Franco dereve pour ses conseils et son soutien continus.
Materials
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. . Manipulating the Mouse embryo. , (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. . Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).
