نقدم هنا بروتوكولا لزيادة إنتاج الوهم دون الاستخدام المعدات الجديدة. يمكن تغيير اتجاه بسيط للجنين لحقن زيادة عدد الأجنة المنتجة، ويساعد على تقليل الفترة الزمنية لنقل الخط.
في محاولة لزيادة الكفاءة في خلق الفئران المعدلة وراثيا عن طريق منهجيات خلية دإط، نقدم لتكيف لبروتوكول الحقن الكيسة الحالي. هنا يمكننا تقرير أن دوران بسيطة للجنين، وحقن من خلال كتلة الخلايا الداخلية عبر (تكم) زيادة النسبة المئوية للفئران تشيميريك من 31 في المائة إلى 50 في المائة، مع أي معدات إضافية أو مزيدا من التدريب المتخصص. 26 مختلفة فطري الحيوانات المستنسخة، وتم حقن الحيوانات المستنسخة إجمالي 35 خلال فترة 9 أشهر. كان هناك لا اختلاف كبير في معدل الحمل أو معدل الاسترداد الأجنة بين تقنيات الحقن التقليدية وتكم. ولذلك، دون أي تغيير رئيسي في عملية الحقن والمواقع بسيطة الكيسة والحقن من خلال ICM، الإفراج عن خلايا ES في تجويف blastocoel يمكن أن يحتمل أن تحسين كمية الإنتاج تشيميريك واللاحقة نقل الخط.
لما يقرب من 25 عاماً، تم إنشاء الفئران وراثيا المستهدف عملية بطيئة، كثيرا ما تعرقل باختناق في مرحلة microinjection blastocysts دإط الخلايا لتوليد germline تحيل التركيبات. التطورات الأخيرة، بما في ذلك كريسبر/Cas91،2 استهداف دإط الخلايا ووفاق الفائق الخلية اتحادات جيل مثل كومب، تحسنت الجيل/توافر دإط الخلايا المحورة وراثيا. ومع ذلك، يظل توليد التركيبات germline عنق زجاجة في خلق الفئران المعدلة وراثيا من هذه الخلايا ES3،4. مشاريع توليد خلايا ES الفائق ابتليت بتقلب عالية في وفاق خلية الجودة، هو أمر حاسم لنجاح إنشاء التركيبات germline. بالإضافة إلى ذلك، بعض خطوط الخلية ES المستخدمة عادة معروفة انيوبلويدي العالية، وصعوبة إنتاج germline التركيبات المختصة5.
تم تطوير العديد من الأساليب لخلق الفئران مع أما حلما أعلى، أو تماما المستمدة خلية ES الفئران6،،من78،،من910. بينما كل من هذه الأنظمة له مزاياه الخاصة، كما أن لها عيوبها. توليد التركيبات تيترابلويد، في حين توليد 100% وفاق الخلية المستمدة من الفئران، غير فعالة، وتقتصر عموما على خطوط أووتبريد 5،6. أحدث أساليب الحقن morula يمكن أن تسفر عن ارتفاع نسبة التركيبات، تقترب من 100%، لكن عموما تتطلب معدات إضافية هامة (أشعة الليزر أو بيزوس) وتدريب10،11. في المختبرات حيث هذه التقنيات موجودة بالفعل، قد لا تكون هذه المنهجية الجديدة الضرورية.
وكان الهدف من هذه الدراسة لإيجاد أسلوب يستخدم التقنيات الشائعة والمعدات متاحة بسهولة لزيادة معدل توليد الوهم، وزيادة فرصة انتقال germline اليل متحولة لإنشاء مستعمرة الماوس اللاحقة.
وكان يعتقد منذ فترة طويلة أن أي اضطراب الرياضيات يمكن أن يؤدي إلى وفيات، في الواقع، بروتوكولات microinjection الكيسة الحالي ما زال التحذير من هذا12،13. ما أثبتنا هنا أن microinjection من خلال مؤسسة أي سي أم لا يضر بالجنين، وزيادة عائد التركيبات.
لا تم التعرف …
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا البحث [جزئيا] “برنامج البحوث الداخلية” للمعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية. خاص بفضل بيدادى شيامال للتحليل الإحصائي. كما نود أن نشكر ياو همفري والطيور غاري اراو يوكي لاستعراض هذه المخطوطات، و “ديمايو فرانكو” لمواصلة تقديم الدعم والمشورة.
ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
NSET device | Paratechs | 60010 | |
DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
HEPES | Sigma | H0887 | |
b-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
Microscope | Leica | DM IRB | |
4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |