트랜스-내부 세포 배아 줄기 세포의 대량 주입 리드 더 높은 Chimerism 요금
Summary
여기 우리는 새로운 장비를 사용 하지 않고 키메라 생산을 증가 하는 프로토콜을 제시. 주입에 대 한 배아의 단순한 방향 변경 생산, 배아의 수를 증가 하 고 잠재적으로 생식 전송 타임을 줄일 수 있습니다.
Abstract
ES 셀 방법론을 통해 유전자 변형된 생쥐의 창조에 효율성을 증가 하는 노력에서 선물이 현재 blastocyst 주입 프로토콜을 적응. 여기 우리 보고 배아, 그리고 트랜스 안 세포 질량 (TICM)를 통해 주입의 간단한 회전 50%, 추가 장비에 31%에서 공상 쥐의 비율을 증가 또는 추가 훈련을 전문. 26 다른 근 친 클론, 그리고 9 개월의 기간 동안 35 총 클론 주입 했다. 전통적인 주입 기술 및 TICM 사이 임신 속도 또는 배아의 회복 속도에 상당한 차이가 있었습니다. 따라서 주입 프로세스와는 blastocyst의 간단한 위치는 ICM을 통해 주입에 모든 주요 변경 없이 blastocoel 구멍에 ES 세포 방출 잠재적으로 향상 시킬 수 있습니다 공상 생산 이후 수량 생식 전송입니다.
Introduction
거의 25 년 동안, 유전자 표적으로 쥐의 창조 자주 키메라를 전송 하는 생식의 세대를 위한 blastocysts ES 세포 microinjection 단계에서 병목 현상에 의해 방해, 느린 과정 되었습니다. CRISPR/Cas91,2 ES 세포 및 높은 처리량 ES에 타겟팅을 포함 한 최근 전진 호 같은 세대 컨소시엄 세포, 유전자 변형된 ES 세포의 생성/가용성 향상. 그러나, 생식 키메라의 생성이 ES 세포3,4에서 유전자 변형된 쥐를 만들기에 병목을 남아 있다. 높은 처리량 ES 세포 생성 프로젝트 생식 키메라의 성공적인 창조에 대 한 중요 한 ES 세포 품질 높은 가변성에 의해 괴 롭 혀 왔다. 또한, 일반적으로 이용한 ES 세포 선의 일부 높은 이수성, 및 생식 유능한 키메라5의 어려운 생산 알려져 있다.
어느 높은 키메라와 쥐를 만들기 위한 많은 방법은 개발 되었다 또는 완전히 ES 세포 파생 마우스6,7,8,,910. 이러한 시스템의 각 그것의 자신의 공로 있다, 그러나 그들은 또한 그들의 결점 있다. Tetraploid chimeras, 마우스, 파생 된 100 %ES 세포를 생성 하는 동안 생성, 비효율적 이며 outbred 라인 5,6에 일반적으로 제한 된. Morula 주입의 새로운 방법 높은 백분율 chimeras, 100%에 접근을 얻을 수 있지만 일반적으로 상당한 추가 장비 (레이저 또는 piezos) 및 훈련10,11필요로 합니다. 이러한 기술은 이미 자리에는 실험실,이 새로운 방법론 필요 없을 수 있습니다.
이 연구의이 목적은 키메라 세대, 이후 마우스 식민지를 설치 하는 돌연변이 체 대립 유전자의 생식 전송의 기회를 증가의 속도 높이기 위해 일반적인 기술과 쉽게 사용할 수 있는 장비를 사용 하는 메서드를 찾아야 했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
그것은 오래는 ICM의 어떤 소란 이어질 수 사망, 사실, 현재 blastocyst microinjection 프로토콜 여전히이12,13의 경고 생각 되었습니다. 그것은 우리가 여기에 표시는 ICM 통해 microinjection는 태아에 게 해로운 고 키메라의 수확량을 증가.
이 효과 대 한 정확한 메커니즘 확인 하지 했다. 그러나, ICM와 함께 hypoblast의 기계적 장애 ES 세포 통합 mic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 [부분적으로] 보건원, 국립 연구소의 환경 건강 과학의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다. 통계 분석에 대 한 특별 Shyamal Peddada 감사 합니다. 우리는 또한 험프리 야 오, 게리 조류, 유키 아 라오 그의 지속적인 지원과 조언을 위해이 원고, 및 프랑코 DeMayo의 검토를 위해 감사 하고자.
Materials
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
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