Trans-indre cellen masse injeksjon av embryonale stamceller fører til høyere Chimerism priser
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å øke chimera produksjon uten bruk av nytt utstyr. En enkel retning endring av embryoet for injeksjon kan øke antall embryo produsert, og potensielt redusere tidslinjen germline overføring.
Abstract
I et forsøk på å øke effektiviteten i etableringen av genmodifiserte mus via ES celle metoder, presenterer vi en tilpasning til gjeldende blastocysten injeksjon protokollen. Her har vi rapportere at en enkel rotasjon av embryoet og injeksjon gjennom Trans-indre cellemasse (TICM) økte andelen chimeric mus fra 31% til 50%, uten ekstra utstyr eller ytterligere spesialisert opplæring. 26 forskjellige innavlede kloner, og 35 totale kloner ble injisert over en periode på ni måneder. Det var ingen signifikant forskjell i svangerskapet rate eller utvinningsgraden av embryo mellom tradisjonelle injeksjon teknikker og TICM. Derfor uten noen store endringer i injeksjon prosessen og en enkel plassering av blastocysten og sprøytebruk gjennom ICM, kan slippe ES celler i blastocoel hulrom potensielt forbedre antallet chimeric produksjon og påfølgende germline overføring.
Introduction
For nesten 25 år er etableringen av genetisk målrettet mus en langsom prosess, ofte hindret av en flaskehals på blastocysts ES celle microinjection scenen for generering av germline overføring av chimeras. Nylige fremskritt, inkludert CRISPR/Cas91,2 målretting i ES celler og høy gjennomstrømming ES celle generasjon konsortier som KOMP, har forbedret generasjon/tilgjengeligheten av genmodifiserte ES celler. Generering av germline chimeras imidlertid en flaskehals i å skape genmodifiserte mus fra ES celler3,4. Høy gjennomstrømming ES celle generasjon prosjekter har vært plaget av høye variasjon i ES celle kvalitet, som er avgjørende for vellykket etablering av germline chimeras. I tillegg er noen av de ofte benyttet ES linjene kjent for høy aneuploidy og vanskelig produksjon germline kompetent chimeras5.
Mange metoder har blitt utviklet for å lage mus med enten en høyere chimera, eller helt ES celle avledet mus,6,,7,,8,,9,,10. Mens hver av disse systemene har egne meritter, har de også sine svakheter. Generasjonen av tetraploid chimeras, mens generere 100% ES celle avledet mus, er ineffektiv, og vanligvis begrenset til outbred linjer 5,6. Nyere metoder sprøytebruk morulastadiet kan gi høy andel chimeras, nærmer seg 100%, men krever vanligvis betydelige ekstra utstyr (lasere eller piezos) og trening10,11. I laboratorier hvor disse teknikkene er allerede på plass, kan denne nye metodikken ikke være nødvendig.
Denne studien mål var å finne en metode som bruker vanlig teknikker og lett tilgjengelig utstyr for å øke frekvensen av chimera generasjon, øke sjansen for germline overføring av det muterte allelet å etablere den påfølgende mus kolonien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det har lenge vært antatt at forstyrrelser av ICM kan føre til dødelighet, faktisk gjeldende blastocysten microinjection protokoller likevel advarer denne12,13. Hva vi har vist her er at microinjection gjennom ICM er ikke skadelig for fosteret, og øker avkastningen av chimeras.
Den eksakte mekanismen for denne effekten er ikke identifisert. Mekanisk avbrudd i ICM, og den tilhørende hypoblast, bør imidlertid øke forekomsten av ES…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet [delvis] av programmet for Intramural forskning på NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Spesiell takk til Shyamal Peddada for statistisk analyse. Vi ønsker også å takke Humphrey Yao, Gary Bird og Yuki Arao for gjennomgang av dette manuskriptet, og Franco DeMayo for hans støtte og råd.
Materials
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. . Manipulating the Mouse embryo. , (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. . Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).
