Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Murin dricka modeller i utvecklingen av läkemedelsbehandlingar för alkoholism: dricka i mörka och två-flaska valet

doi: 10.3791/57027 Published: January 7, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Alkohol användning Disorder (AUD) är ett stort nationellt hälsoproblem och utvecklingen av effektivare behandlingar krävs för att kompensera behoven hos denna patientgrupp. I detta syfte använder följande protokoll tredjeparts två enkla gnagare dricka modeller för att bedöma den prekliniska effekten av anti alkohol blyföreningar.

Abstract

Alkohol användning Disorder (AUD) är ett stort problem med mer än uppskattningsvis 76 miljoner människor världen över uppfyller de diagnostiska kriterierna. Nuvarande behandlingar är begränsade till tre FDA-godkända läkemedel som är i stort sett verkningslösa även i kombination med psykosociala interventioner, såsom framgår av höga återfallsfrekvens. Som sådan, representerar sökandet efter fler nya behandlingar en viktig folkhälsan mål. Därför följande protokoll använder tredjeparts två enkla gnagare dricka modeller för att bedöma den prekliniska effekten av anti alkohol blyföreningar: två-flaska val (TBC) och dricka i mörkret (DID). Den förstnämnda kan möss att frivilliga dricka med måtta medan den senare inducerar möss till frivillig konsumerar stora mängder alkohol under en kort period som härmar berusningsdrickande. Enkel och hög genomströmning arten av båda dessa paradigm tillåter för snabb screening av farmakologiska medel eller för att identifiera stammar av möss som uppvisar vissa frivilliga dryckesbeteende.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Under senaste 25 plus år, betydande ansträngning har lagts för att utveckla läkemedel för behandling av alkohol användning Disorder (AUD)1. Trots många framsteg har gjorts, AUD är fortfarande ett stort folkhälsoproblem, som påverkar över 18 miljoner amerikaner, och kostar över $220 miljarder årligen2,3. För närvarande finns det endast tre FDA-godkända läkemedel, disulfiram, naltrexon och acamprosate, varav alla har gett inkonsekventa resultat i kliniska prövningar och begränsad framgång även i kombination med psykosociala interventioner i inställningarna för kliniken 4 , 5 , 6 , 7.

En primär anledning till misslyckanden av nuvarande AUD terapi är kopplad till AUD8heterogen karaktär. Medan både miljömässiga och genetiska faktorer bidrar till utvecklingen av AUD, står ärftlighet för uppskattningsvis 50-60% av risken för debut9. Liknar behandling av depression, är det allmänt accepterat att patienter som lider av AUD behöver en mängd mediciner som är skräddarsydda för att möta behoven hos varje patient10.

Klart, det finns ett brådskande behov av effektivare behandlingar som skulle underlättas om redan mödosam och tidskrävande processen för läkemedelsutveckling var strömlinjeformad3. Därför visar följande protokoll prekliniska tillämpligheten av två dricka djurmodeller används för att undersöka den neurobiologiska grunden för AUD11. Mer specifikt metoden infördes häri kan bedöma effekten av kandidat föreningar minska alkohol konsumtion i både ”lagom” och ”berusningsdrickande” scenarier utnyttja två-flaska valet (TBC) och dricka i mörka (DID) paradigm, respektive. Båda paradigmer undersöka icke-operant etanol självadministrering, whereby möss äter etanol muntligt och helst, och därför illustrera hög ansikte och konstruera giltighet som en modell av mänskliga alkoholism11.

I TBC dricka, även känd som fritt val dricka, preferens dricka, eller sociala dricka, är två flaskor av lösning kontinuerligt tillgänglig i buren. En flaska innehåller vatten och den andra innehåller en utspädd lösning av etanol, whereby koncentrationen av etanol kan varieras (t.ex., 5-30% v/v)11,12. Mössen har konstant tillgång till både flaskor och därför kan välja hur mycket att dricka ur flaskan.

Denna modell bedömer etanol förbrukningen av varje mus (g/kg), samt etanolhalten till preferens (volym av etanol konsumeras ÷ totala volym vätska förbrukas). Det används rutinmässigt att jämföra dricka nivåer mellan olika stammar av möss, eller efter en specifik genetisk manipulation (t.ex., gen knockout eller knockdown) och resultat i etanol blodkoncentration (grundstrategi) liknar vad som finns hos människor när dricka i måtta13,14.

I DID procedur 3 h efter starten av den mörka cykeln, är buren flaska vatten utbytt med en flaska 20% (v/v) etanol lösning för en begränsad åtkomst som dricka session. Dricka sessioner uppstå som en följd 4-dagars cykel, varaktig 2 h på dagarna 1-3 och 4 h på dag 4. 1-3 dagar tjäna som en alkohol-tillvänjning tid före testning på dag 4. Följaktligen, möss på ett tillförlitligt sätt förbrukar tillräckligt etanol för att uppnå grundstrategi > 100 mg/dL och därför uppvisar beteendemässiga effekter av berusning hittade hos människor som är omåttlig alkoholkonsumtion13,14,15. Tillgång till vatten finns på alla tider än dricka sessionen.

I området i närheten finns det flera varianter av begränsad tillgång till dricka. Till exempel i intermittent tillgång modellen får möss två flaskor (en med vatten och den andra som innehåller 20% (v/v) etanolen) endast på måndag, onsdag och fredag med en karenstid på 24 och 48 timmar på vardagar och helger, respektive16. Efter flera veckor av intermittent tillträde, mössen kommer gradvis och eskalera frivilligt dricka nivåer, att så småningom uppnå Grundstrategi liknar vad som observerats i DID modellen. DID, verkar dock vara den vanligaste modellen att bedöma binge-liknande dryckesbeteende. Finns andra modeller av intermittent dricksvatten, men de förlita sig på att begränsa tillgången till mat eller ånga kammaren som inducerade ökningar av frivilliga självförvaltning, vilket gör dem mindre representativa frivilliga mänskliga alkohol konsumtion16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla förfaranden beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittéer av University of Southern California Health Sciences Campus.

1. experimentell installation och montering

  1. Förvärva alla följande leveranser och kemikalier före starten av studien: möss, burar/metall bur toppar, sängkläder, mat, vatten, etanol, pipetter, dragkedja toppar, shrink wrap, mattkniv, zip band, tejp, Bunsen gasbrännare, skala, strålkastare.
  2. Erhålla C57BL/6J möss, antingen från en kommersiell källa eller en egen koloni, med tanke på att möss kan gruppen inrymt fram tidpunkten för testning.
    Obs: Det totala antalet möss som upphandlas beror på komplexiteten i experimentell design. Planera att rymma ungefär 12-15 möss per grupp, med pilotstudier inte mindre än 5-7 möss per grupp. I de representativa resultat visas nedan utnyttjade vi en enkel två-gruppen set-up för att bedöma förhållandet orsak-verkan med hjälp av en engångsdos (5 mg/kg) av drogen (MOX).
  3. Följ stegen nedan för att montera flaskor18.
    1. Värm en brukskniv med hjälp av en bunsenbrännare.
    2. Använda denna kniv, skära ungefär en tum från toppen och botten ändarna av en plast 18 mL serologiska Pipettera.
      1. Observera att mindre volym pipetter (dvs, 10 mL) också kan användas för att öka precisionen i mätningen.
    3. Värma Pipettera under en värmepistol.
    4. För in kullager dragkedja röret i ”nedre” delen av Pipettera (med andra ord, öppningen närmast 18 mL dash-linjen).
    5. Seal dragkedja röret på plats med krympplast använder en kommersiellt tillgänglig shrink wrap pistol.
    6. Locket från andra öppning med en propp av silikon.

2. djurens tillvänjning

  1. Början på minst 1 vecka före startdatum för försöket, överföra möss till rummet där de experimentella rutiner skall utföras så att de kan anpassa sig till villkoren för djurhållning (inklusive omgivningstemperatur (21 ± 1 ° C) och 12-h (omvänd ljus/mörk cykel, med lampor av klockan 12). Glöm inte att följa anvisningar och underrätta lämpliga kanaler innan du flyttar djuren från en plats till en annan.
    1. Om möss överförs från en standard ljus/mörk cykel Tillåt 2 veckor ytterligare tillvänjning tid.
  2. Fyll de nygjorda flaskorna till brädden med vatten. Kontrollera att locket är stängt ordentligt och saknar några luftbubblor eller läckage från pipen. Om lösningen läcker, åter säkra den gemensamma jordbrukspolitiken. Ta bort eventuella luftbubblor genom att helt enkelt trycka på flaskan så att luften kan fly röret.
  3. Vid ankomsten, enstaka hus varje mus i standard polykarbonat/polysulfon burar med sängkläder och ett metallgaller bur överst; ta bort locket från bur eftersom det inte längre kommer att användas.
    1. Ge tillgång till mat och water bottle(s) ad libitum.
    2. Säkra varje flaska bur överst genom att Linda en plast zip slips runt varje flaska att hålla det på plats. Trimma någon överflödig plast från zip slips att säkerställa att det inte sticker ut in i buren.
      Obs: För att dricka i förfarandet för mörka (DID), bara en enda flaska vatten krävs. Tillvänjning till två flaska val (TBC) paradigm, kräver dock att buren set-up innehåller två flaskor vatten. Om metallgaller tratten som tillhandahålls är utformad för att hålla bara en enda flaska lösning, försiktigt böja isär sina barer för att skapa utrymme för en extra tallrik att rymma den andra flaskan för TBC.
  4. Ställa in minst 3 mus gratis kontroll burar. Detta kommer att möjliggöra övervakning av vätska förlust orsakad av avdunstning eller spill från flaskor, vilket är helt enkelt en naturlig händelse som händer som burar placeras på och utanför buren racket (se steg 2.6.3, 3.6.1 och 4.6.1 för ekvationer).
  5. Början på dag 4 av de 1 vecka samma hölje acklimatisering, mät och anteckna den dagliga kropp och mat vikter varje mus, med hjälp av en skala, (i gram) samt vattenintaget, använder etsningar tillsammans med inverterad flaskan för att spela in den högsta punkten av den menisken (i mL).
    1. Det är vetenskaplig praxis att läsa den lägsta punkten av den konkava menisken, eftersom flaskor kvar i en inverterad ställning under mätningen, registrera den högsta punkten på menisken.
  6. Bedöma parametrarna för 2,5 med hjälp av ekvationer nedan:
    1. Mäta den förändring i kroppsvikt (g): vikten av aktuell dag (g) - vikten av föregående dag (g).
    2. Mäta födointag (g): vikt av mat på föregående dag (g) - vikten av mat på aktuell dag (g).
    3. Mäta vattenintaget (mL): [volym vatten aktuella dagen (mL) - volym vatten på föregående dag (mL)] - genomsnittliga vattenförlust från alla kontroll burar (mL).
  7. Upprepa steg 2.5 efter varandra, på 5-7 dagar för att tillåta för bestämning av en originalplan för de tre dagarna omedelbart före införandet av etanol. Om en sammanhängande inspelning inte kan samlas in, förlänga perioden acklimatisering som möjliggör utvärdering av baslinjen mätningar.
  8. När vattenintag har stabiliserats till ± 10% variation från medelvärdet av de senaste 3 dagarna, börja etanol tillgång med TBC (obegränsad tillgång) eller DID (begränsad åtkomst).
    Obs: På sällsynta tillfälle, en till två ytterligare dagar kan behövas för patienter att uppnå denna stabilitet; inte rädd om ytterligare tid behövs för värden att Visa ±10% variabilitet från medelvärdet av de senaste 3 dagarna.

3. 24-timmars två flaska val (bekräftas senare)

Obs: En schematisk är beredd i figur 1.

  1. Bered en 10% (v/v) etanol på 500 mL volym genom att lägga till 52.65 mL 190 bevis korn etanol (~ 95% etanol) 447.35 mL H2O; Glöm inte att skaka ordentligt. Med tanke på att etanol avdunstar snabbt, ersätta lösningen i varje 3-4 dagars intervall.
    Obs: Andra koncentrationer av etanol kan användas också, men författarna rekommenderar en koncentration av 10% för denna modell.
  2. Den första dagen av TBC, (dag 8 tidigast) Töm 1 av de 2 vattenflaskor, i varje bur, och fylla den till bredden med nylagade etanol lösningen. Etanol och vatten är svårt att skilja visuellt, tydligt märka flaskorna med deras motsvarande innehåll. Enkelt tillämpa en bit maskeringstejp till flaskan och märka det med en markör eller genom att skriva direkt på flaskan.
  3. Lägga till mer lösning på vattenflaskan, efter behov.
  4. Placera flaskor tillbaka på buren, se till att alla mössor är ordentligt stängda och saknar några luftbubblor eller läckage från pipen. Om lösningen läcker, åter säkra den gemensamma jordbrukspolitiken. Ta bort eventuella luftbubblor genom att helt enkelt trycka på flaskan så att luften kan fly flaskan.
  5. Suppleant positionen för flaskorna varannan dag om rätt för betingad plats preferenser med influenser som dricka aktivitet (se diskussionen mer).
  6. Utöver de dagliga mätningarna från 2.5 och 2.6, som har pågått, börja läsa och spela in etanol intagsnivåer samt. Analysera 10% etanol intag och preferens förhållandet med hjälp av följande ekvationer:
    1. Mäta de 10% etanol intag (mL): [volym etanol aktuella dagen (mL) - volym av etanol på föregående dag (mL))]-genomsnitt etanol förlust från alla kontroll burar (mL).
    2. Mäta de 10% etanol intag (g/kg): [10% etanol intag (mL) x 0.07893 g/mL] / kroppsvikt (kg).
    3. Mäta preferens-%: [10% etanol intag (mL) / vatten (mL)] x 100.
  7. Så snart etanol intag har blivit stabil, administrera en enda kontroll (saltlösning) intraperitoneal (IP) injektion (0,01 mL/g kroppsvikt) till varje mus under den dagliga rutinen för mätning. På detta sätt vant motiv till själva injektionen.
    1. Stabilitet definieras som ± 10% variation från medelvärdet av de senaste 3 dagarna (samma som i avsnitt 2.8).
      Obs: Det kan ta upp till 1 vecka för etanol nivåer för att stabilisera. Detta är särskilt sant om möss används igen från ett tidigare experiment och har haft tidigare exponering för etanol. Kontrollen är helt enkelt de lösningsmedel som används för att upplösa drogen.
  8. När en etanol-baseline med låg variabilitet har återupprättats, dela upp möss i dosering genomsnittliga grupper med hjälp av etanol intag värden så att alla grupper har ungefär samma värdena för intag av etanol.
    1. Utse en grupp som kontrollen (fortsätter att ta emot saltlösning) och den andra som den experimentella (i.p.-injektion av undersökta läkemedlet på 0,01 mL/g kroppsvikt). Börja dagliga drog dosering, antingen för en akut- eller flerdagsaktivitet varaktighet. Därefter kan kontroll återinföras att testa de efter läkemedelseffekter (valfritt).
      Obs: Eftersom dricka övervakas över en 24 timmar lång period, tidpunkten för doseringen administration är inte beroende av den mörka cykeln.

4. dricka i mörkret (gjorde)

Obs: En schematisk är beredd i figur 3.

  1. På varje dag av schemalagda etanol tillgång (1-4 dagar) spela in mätningar, för vattenvolymen, födointaget och kroppsvikten, och utföra drog dosering. Gör detta under en förvald tid under lätta cykeln som är valt i enlighet med farmakokinetiken av drogen så att föreningen är på / eller närmar sig den maximala hjärna koncentrationen under perioden dricka.
    Obs: Kom ihåg dagar 1-3 är tänkt att helt enkelt vänja mössen att dricka kopiösa mängder etanol i en kort tidsperiod. Medan möss inte når BEC nivåer jämförbara med den mänskliga 0,08; dessa ”utbildningsdagar” säkerställa att på dag 4, under något längre dricka session, de i själva verket dricker till denna nivå.
    1. Ge alla möss kontroll (koksaltlösning) på dagarna 1-3, och antingen kontroll eller drogen på dag 4. Proceduren DID uppstår under loppet av 3 veckor att inkludera en före drog (vecka 1), läkemedel (vecka 2) och efter drogen (vecka 4) dricka session.
    2. Obs: Observera att under veckan drog-dosering, dag 3 etanol intagsnivåer används för att tilldela möss till antingen gruppen kontroll eller läkemedel på ett sätt där etanol intagsnivåerna av båda grupperna har minst variabiliteten. Detta är till skillnad från TBC, som tilldelar grupper baserat på en 3-dagars genomsnitt.
  2. Bered en 20% (v/v) etanol (20E) på 500 mL volym genom att lägga till 105.25 mL 190 bevis korn etanol (~ 95% etanol) 394.75 mL H2O; Glöm inte att skaka ordentligt.
  3. Fyll etanol flaskorna innan dricka sessionen så att så snart som DID börjar vatten flaskorna helt enkelt kan ersättas med alkohol flaskorna.
  4. Under hela DID sessionen (steg 4,5-4,8), använda en rött ljus strålkastare att inte störa djuren.
  5. I början av DID dricka session, planerad att börja 3 timmar i den mörka cykeln, spela in volymen vatten för varje mus. Sedan ersätta varje vattenflaska med en flaska av den 20E lösningen och registrera start etanol volymen.
  6. Läsa och spela in den slutliga etanol volymen 2 timmar senare, i slutet av den drickande sessionen på dagarna 1-3 och 4 timmar senare på dag 4. Analysera 20% etanol intaget med hjälp av följande ekvationer.
    1. Mäta de 20% etanol intag (mL): [volym etanol slutet av dricka session (mL) - volym av etanol vid början av drickande session (mL)] - genomsnitt etanol förlust från alla kontroll burar (mL).
    2. Mäta de 20% etanol intag (g/kg): [20% etanol intag (mL) x 0.15786 g/mL] / kroppsvikt (kg).
  7. På dag 4, omedelbart efter inspelning etanol volymer, och före återinföra tillgång till vatten, samla blod för att bedöma koncentrationen i blodet etanol av varje mus (tillval).
    Obs: Någon icke-terminal blod insamlingsmetod får användas, till exempel retro-orbital sinus blodinsamling eller ytlig ven blodinsamling. Användbara protokoll finns under referenser för Anders o.a. 21 och Yardley o.a. 20.
    1. Utför analys med hjälp av olika metoder inklusive LCMS eller kommersiellt tillgängliga maskiner (se Tabell för material).
  8. Ersätt alla etanol flaskor med vattenflaskor och spela in vattenvolymen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I de följande representativa undersökningarna, var socialt drickande modelleras med två-flaska val (TBC) paradigm. Kort, möss hade tillgång till två flaskor lösning, en som innehöll vatten och den andra en 10% (v/v) etanol lösning. Försökspersoner har senare delats och jämnt tilldelats drog behandlingsgrupperna, moxidektin (MOX) vs. saltlösning kontroll, så att varje grupp skulle ha i genomsnitt etanol intagsnivåer med minsta möjliga variation.

Första originalplanen 10E intag under perioden 24-h stabiliserad vid 14,46 ± 1,85 g/kg (n = 8) innan injektioner började, och därefter åter stabiliseras vid 14,14 g/kg bokför saltlösning injektioner. För att bedöma effekterna av en akut dosen (5 mg/kg) för MOX på etanol intag och preferens, var dricka aktivitet bedömda pre MOX, MOX och post MOX. Vi hittade att en engångsdos av MOX avsevärt minskat alkoholintag över 45 procent, jämfört med pre MOX injektioner [F (2, 22) = 26.33, p < 0,0001] (figur 2A), och preferens [F (2, 14) = 17,35, p < 0,0001] (figur 2B ) som överstiger 30%. 10e intag och preferens både förblev betydligt lägre än koksaltlösning dagen omedelbart efter MOX behandling (mer än 25% och 15% respektive) visas som post MOX injektioner i figur 2).

I en opublicerad pilotstudie, var berusningsdrickande modelleras med att dricka i förfarandet för mörka (DID) whereby möss dagligen hade begränsad tillgång (2 h) till en flaska innehållande 20E början 3 h in i dygnsrytm mörk fas, 3 dagar, med en längre tillgång period (4 h) på dag 4 (figur 4). Honmöss (n = 12, 6 möss/grupp) administrerade saltlösning injektioner (i.p.) på dagarna 1-4 med baslinjen 20E fastställdes på dag 4 (före läkemedel). På dagarna 1-3 av 2nd veckovis cykel, alla möss fick ännu en daglig saltlösning injektion. Värdena för intag av etanol från dag 3 användes sedan för att dela upp möss i två grupper (n = 6 / grupp) som därefter fick antingen en injektion (i.p.) för MOX (5 mg/kg) eller saltlösning på dag 4 (läkemedel). Följande vecka alla möss fick dagliga saltlösning injektioner på dagarna 1-4 och etanol intag mättes återigen på dag 4 (post Drug). Akut administrering av 5 mg/kg MOX var analyseras och fann att avsevärt minskat alkoholintag över 54%, jämfört med före drog injektioner (t = 7.635, p < 0,0001)

Figure 1
Figur 1 . Två-flaska val Schematiskvänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.  

Figure 2
Figur 2 . Två flaska val (TBC). MOX (5 mg/kg) minskar 10% v/v etanol (10E) intag (A) och preferens (B) i C57BL/6J honmöss med ett 24 h tillgång två-flaska val paradigm. Efter att uppnå stabila dricka nivåer 3 dagar, administrerades MOX. Staplarna anger genomsnittliga 10E intagsnivåer från dagen innan MOX injektionen (vitt; Pre MOX), dagen av MOX injektionen (svart; MOX) och dagen efter MOX injektionen (grå; Bokföra MOX). Värdena representerar det medelvärde ± SEM för 12 möss. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, och *** P < 0,0001 kontra Pre MOX (längst till vänster horisontell linje) eller bokför MOX (längst till höger horisontell linje), Tukey är flera jämförelse post hoc-test. Modifierad från Huynh N. et al. 19 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Dricka i den mörka Schematiskvänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.  

Figure 4
Figur 4 . Dricka i mörkret (gjorde). MOX (5 mg/kg) minskar 20% v/v etanol (20E) intag i C57BL/6J honmöss med en dricka i mörka paradigm. Staplarna representerar genomsnittliga 20E intagsnivåer på veckan före MOX injektionen (före läkemedel), veckan MOX injektionsstället (läkemedel) och veckan efter MOX injektionen (efter läkemedel). Värdena representerar det medelvärde ± SEM för 12 möss (6/grupp) mellan saltlösning och MOX grupper. P < 0,0001 jämfört med före drog (längst till vänster horisontell linje) eller efter drogen (längst till höger horisontell linje), Tukey är flera jämförelse post hoc-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Världsomspännande uppskattningar tyder på att så många som 76 miljoner människor uppfyller kriterierna för att motivera en diagnos för alkohol användning Disorder (AUD). Tyvärr för närvarande farmaceutiska behandlingar är i hög grad ineffektivt och vidareutveckling är nödvändigt för att kompensera denna kliniska befolkningen20behov. Därför följande protokoll syftar till att underlätta detta arbete av exemplifierar två av de mest grundläggande gnagare dricka paradigm: två-flaska-val (TBC) och dricka i mörkret (DID). Båda modellerna mäta icke-operant självadministrering av etanol, whereby möss äter etanol muntligen. I TBC är paradigm, etanol (10% v/v) och vatten båda tillgängliga kontinuerligt, vilket resulterar i comparably låga etanol i blodet som är en följd av en episodisk och gradvis etanol konsumtionsmönstret. Denna modell är bäst för att bedöma lägre nivåer av etanol intag som en preferens som tastant och därför sägs likna mänsklig ”måttlig” dricka. Figur 2 ovan visar representativa resultat för TBC paradigm.

Däremot, i DID modell etanol (20% v/v) är endast tillgänglig för en begränsad tid. Till skillnad från TBC bedömer denna modell effekterna av en förening på behaviorally relevanta koncentrationer av etanol, utnyttjar det faktum att C57BL/6J möss kommer att förbruka stora mängder etanol mycket snabbt under de mest aktiva fas i sin dygnsrytm cykeln. Dessa dricka sessioner uppstår under 4 dagar, med början den 3rd h in i mörka cykeln, med en löptid på 2 h på dagarna 1-3 och 4 h på dag 4. Med den här proceduren, möss vanligtvis konsumerar tillräckligt etanol för att uppnå grundstrategi > 100 mg/dL och uppvisar beteendemässiga tecken av intoxication. Våra representativa resultat för DID paradigm visas i figur 4. Även om vi inte mäta grundstrategi för dessa möss, är deras dricka nivåer liknande dem som rapporterats i litteraturen som uppnått grundstrategi över 100 mg/dL13,14,15.

Båda paradigm har begränsningar. Under instanser när orala gavages är att föredra av administrationen för farmakologisk testning av blyföreningar, kan esophogeal trauma orsakad av förfarandet hindra etanol självadministrering i båda paradigmer. Detta är särskilt sant för DID-modellen, som använder en högre koncentration av etanol (20%) och som kan förevarande fall där farmakokinetiken för läkemedlet kräver dricka sessionen att börja innan djuren har haft tillräcklig tid att återhämta sig från den förfarandet. Detta skulle vara uppenbart i en kontrollgrupp som dricker på nivåer som motsvarar till grundstrategi långt under den förväntade 0,08. I vårt labb har vi upplevt svårigheter med kraft utfodringar både med DID och TBC. Vi skulle kunna komma runt dessa frågor genom att formulera våra föreningar så att de kunde levereras med ett oralt Proteinupplösande tunn remsa (ODS)19.

Dessutom i DID modellen särskilt mot bakgrund av att etanol tillgång är så kort varaktighet, drog dosering måste göras under en förvald tid under lätta cykeln som är valt i enlighet med farmakokinetiken av drogen så att den förening är på / eller närmar sig den maximala hjärna koncentrationen under perioden dricka. Om en populationsfarmakokinetisk analys inte kan utföras, skulle en alternativ strategi vara att göra en tid kursen bedömning av beteendemässiga effekterna av drogen med TBC. Efter denna logik, genom övervakning av dricka aktivitet på timbasis och bestämma peak anti alkohol effekter, en kunde rimligen upp strategier när droger borde vara administrerade19.

Medan fältet av alkoholism har olika djurmodeller att undersöka de olika fysiologiska och beteendemässiga aspekterna av AUD8, beskriver följande protokoll två vanliga paradigm, vilket möjliggör jämförelser av resultat över laboratorier. En andra fördel är att dessa metoder är enkla, vilket gör deras användning bekvämt under akuta och kroniska studier liknar de exempel som ovan. Till skillnad från andra vanliga alkohol paradigm, såsom operant betingning och ånga kammare paradigm, kan dessutom den metod som vi har beskrivit här utföras utan behov av specialutrustning. Anekdotiskt, är det sannolikt att nästan alla komponenter i dricka apparaten kan hittas i en prototypiska institutionella vivarium. Det finns också olika sätt att ändra de protokoll som beskrivs här så att de kan bäst passar målen för varje experiment. Exempelvis är vår DID förfarande bäst för att testa de akuta effekterna av ett läkemedel på en dricka session (under dagen dag 4). Vi har dock visat att flerdagars drog dosering kan bedömas genom att utöka de dricka sessionerna till 4 dagar av 2 timmars tillgång, i motsats till de nuvarande 2 timmarna av tillgång på dagarna 1-3 och 4 timmar på dag 419. Möss kan också överföras från en paradigm till ett annat, eller åter testade för ytterligare doser / olika föreningar, med en enkel 1-2 vecka washout-period i mellan.

Det bör nämnas att läkemedelsinducerad förändrad dricka observerat genom dessa metoder måste utredas grundligt för att avgöra huruvida effekterna är selektiv för alkohol eller om de skulle vara resultatet av toxicitet. Mer information om kontroller hänvisas läsaren till Yardley et al. 20 ingen enda paradigm kan modellera alla aspekter av detta tillstånd. I stället undersöker varje paradigm vanligtvis några av de viktigaste attribut som associeras med AUD. TBC och DID modellerna beskrivs här, har kopplats till binge/berusning scenen av missbruk cykeln. För en mer grundlig förståelse av nyttan av föreningen, bör flera prekliniska dricka modeller utnyttjas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

DLD och LA är uppfinnare på ett patent för de återanvända av ivermektin och relaterade avermectiner för behandling av alkoholbruk störningar. Författarna har inga andra intressekonflikter och är helt ansvarig för det vetenskapliga innehållet i uppsatsen.

Acknowledgments

Detta arbete fick stöd, delvis genom forskning ger SC CTSI NIH/NCRR/NCATS--UL1TR000130 (D.L.D.), AA022448 (D.L.D.) och USC School av apoteket.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L  graduated cylinder VWR https://us.vwr.com/store/product/20935285/marisco-single-scale-cylinder-graduates-john-m-maris-co To prepare ethanol solution.
1 L glass bottle Pyrex (Fisher Scientific) https://www.fishersci.com/shop/products/pyrex-reusable-media-storage-bottles-12/p-42752 To prepare ethanol solution.
100 mL graduated cylinder Fisher Scientific https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kimax-class-a-to-contain-graduated-cylinders-8/p-4369311 To prepare ethanol solution.
Analox One potential method of analyzing DID blood samples is by using the analox machine
ball-bearing sipper tubes Ancare Corp. http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point Length: 2.5 inches, Diameter: 5/16 inches, Model: TD100
C57BL/6J Mice Jackson lab https://www.jax.org/strain/000664 May also come from internal breeding colony
disposable serological pipets VWR International (VWR) https://us.vwr.com/store/product/4760455/vwr-disposable-serological-pipets-polystyrene-sterile-plugged 10 mL, 18 mL, or 25 mL 
ethanol, pure, 190 proof (95%), USP, KOPTEC Decon Labs (VWR) https://us.vwr.com/store/product/4542412/ethanol-pure-190-proof-95-usp-koptec ---
heat gun  Master Appliances Corp. http://www.masterappliance.com/master-heat-guns-kits/
heat shrink tubing --- --- Diameter: 3/8 inches
industrial knife/blade --- --- ---
metal cage plate --- --- Should be available through the university/institutional vivarium
mouse RO water --- --- Should be available through the university/institutional vivarium
portable electronic scale Ohaus (VWR) https://us.vwr.com/store/product/4789377/portable-electronic-cs-series-scales-ohaus ---
red light headlamp nyteBright (Amazon) https://www.amazon.com/LED-Headlamp-Flashlight-Red-Light/dp/B00R0LMMF8/ref=sr_1_1?ie=UTF8&qid=1499591137&sr=8-1-spons&keywords=red+lamp+headlamp&psc=1 ---
silicone stoppers Fisher --- ---
thermometer Fisher Scientific https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-hygro-thermometer-clock-large-display-2/p-4077232 ---
weigh boat VWR International (VWR) https://us.vwr.com/store/product/16773534/vwr-pour-boat-weighing-dishes The lid from a pipete tip box is an appropriate alternative

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Litten, R. Z., Falk, D. E., Ryan, M. L., Fertig, J. B. Discovery, Development, and Adoption of Medications to Treat Alcohol Use Disorder: Goals for the Phases of Medications Development. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40, (7), 1368-1379 (2016).
  2. Grant, B. F., Dawson, D. A., Stinson, F. S., Chou, S. P., Dufour, M. C., Pickering, R. P. The 12-month prevalence and trends in DSM-IV alcohol abuse and dependence: United States, 1991-1992 and 2001-2002. Drug and Alcohol Dependence. 74, (3), 223-234 (2004).
  3. Sacks, J. J., Gonzales, K. R., Bouchery, E. E., Tomedi, L. E., Brewer, R. D. National and State Costs of Excessive Alcohol Consumption. American Journal of Preventive Medicine. 49, (5), 73-79 (2015).
  4. Litten, R. Z., et al. Medications development to treat alcohol dependence: a vision for the next decade. Addiction Biology. 17, (3), 513-527 (2012).
  5. Alcoholism: Developing Drugs for Treatment Guidance for Industry Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm433618.pdf (2015).
  6. Johnson Medication Treatment of Different Types of Alcoholism. American Journal of Psychiatry. 167, (6), 630-639 (2010).
  7. Litten, R. Z., Wilford, B. B., Falk, D. E., Ryan, M. L., Fertig, J. B. Potential medications for the treatment of alcohol use disorder: An evaluation of clinical efficacy and safety. Substance Abuse. 37, (2), 286-298 (2016).
  8. Litten, R. Z., Ryan, M. L., Falk, D. E., Reilly, M., Fertig, J. B., Koob, G. F. Heterogeneity of Alcohol Use Disorder: Understanding Mechanisms to Advance Personalized Treatment. Alcoholism: Clinical and Experimental. Research. 39, (4), 579-584 (2015).
  9. Schuckit, M. A., et al. A Genome-Wide Search for Genes That Relate to a Low Level of Response to Alcohol. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 25, (3), 323-329 (2001).
  10. Batki, S. L., Pennington, D. L. Toward Personalized Medicine in the Pharmacotherapy of Alcohol Use Disorder: Targeting Patient Genes and Patient Goals. American Journal of Psychiatry. 171, (4), 391-394 (2014).
  11. Koob, G. F. Theoretical frameworks and mechanistic aspects of alcohol addiction: alcohol addiction as a reward deficit disorder. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 3-30 (2013).
  12. Yoneyama, N., Crabbe, J. C., Ford, M. M., Murillo, A., Finn, D. A. Voluntary ethanol consumption in 22 inbred mouse strains. Alcohol. 42, (3), 149-160 (2008).
  13. Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiology & Behavior. 84, (1), 53-63 (2005).
  14. Thiele, T. E., Navarro, M. "Drinking in the dark" (DID) procedures: A model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48, (3), 235-241 (2014).
  15. Crabbe, J. C., Spence, S. E., Brown, L. L., Metten, P. Alcohol preference drinking in a mouse line selectively bred for high drinking in the dark. Alcohol. 45, (5), 427-440 (2011).
  16. Sprow, G. M., Thiele, T. E. The neurobiology of binge-like ethanol drinking: Evidence from rodent models. Physiology & Behavior. 106, (3), 325-331 (2012).
  17. Neasta, J., Hamida, B., Yowell, Q., Carnicella, S., Ron, D. Role for mammalian target of rapamycin complex 1 signaling in neuroadaptations underlying alcohol-related disorders. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, (46), 20093-20098 (2010).
  18. Huynh, N., et al. Preclinical development of moxidectin as a novel therapeutic for alcohol use disorder. Neuropharmacology. 113, Pt A 60-70 (2017).
  19. Egli, M. Can experimental paradigms and animal models be used to discover clinically effective medications for alcoholism. Addiction Biology. 10, (4), 309-319 (2005).
  20. Huynh, N., Arabian, N., Lieu, D., Asatryan, L., Davies, D. L. Utilizing an Orally Dissolving Strip for Pharmacological and Toxicological Studies: A Simple and Humane Alternative to Oral Gavage for Animals. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
  21. Yardley, M. M., et al. Ivermectin reduces alcohol intake and preference in mice. Neuropharmacology. 63, (2), 190-201 (2012).
  22. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1, (2), 87-93 (2010).
Murin dricka modeller i utvecklingen av läkemedelsbehandlingar för alkoholism: dricka i mörka och två-flaska valet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huynh, N., Arabian, N. M., Asatryan, L., Davies, D. L. Murine Drinking Models in the Development of Pharmacotherapies for Alcoholism: Drinking in the Dark and Two-bottle Choice. J. Vis. Exp. (143), e57027, doi:10.3791/57027 (2019).More

Huynh, N., Arabian, N. M., Asatryan, L., Davies, D. L. Murine Drinking Models in the Development of Pharmacotherapies for Alcoholism: Drinking in the Dark and Two-bottle Choice. J. Vis. Exp. (143), e57027, doi:10.3791/57027 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter