Summary

Génie génétique des organoïdes intestinaux de souris primaires utilisant les vecteurs viraux de transduction magnétique de nanoparticule pour la section congelée

Published: May 10, 2019
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Summary

Nous décrivons des instructions étape par étape à : 1) engineerly organoids intestinal utilisant des nanoparticules magnétiques pour la transduction lenti- ou rétroviral, et, 2) produisent des sections congelées des organoïdes machinés. Cette approche fournit un outil puissant pour modifier efficacement l’expression des gènes chez les organoïdes pour l’étude des effets en aval.

Abstract

Les cultures d’organoïdes intestinaux offrent une occasion unique d’étudier la biologie intestinale des cellules souches et des cryptes in vitro, bien que des approches efficaces pour manipuler l’expression des gènes chez les organoïdes aient fait des progrès limités dans ce domaine. Bien que la technologie CRISPR/Cas9 permette une édition génomique précise des cellules pour la génération d’organoïdes, cette stratégie nécessite une sélection et un dépistage approfondis par analyse de séquences, ce qui est à la fois long et coûteux. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la transduction virale efficace des organoïdes intestinaux. Cette approche est rapide et très efficace, réduisant ainsi le temps et les dépenses inhérents à la technologie CRISPR/Cas9. Nous présentons également un protocole pour produire des sections congelées des cultures organoïdes intactes pour une analyse plus approfondie avec la coloration immunohistochimique ou immunofluorescente, qui peut être employée pour confirmer l’expression ou le silence de gène. Après la transduction réussie des vecteurs viraux pour l’expression ou le silence de gène est réalisé, la fonction intestinale de cellules souches et de crypte peut être rapidement évaluée. Bien que la plupart des études organoïdes utilisent des tests in vitro, les organoïdes peuvent également être livrés à des souris pour des analyses fonctionnelles in vivo. En outre, nos approches sont avantageuses pour prédire les réponses thérapeutiques aux médicaments parce que les thérapies actuellement disponibles fonctionnent généralement en modulant l’expression des gènes ou la fonction protéique plutôt que de modifier le génome.

Introduction

La capacité de culture de la souris ou des cryptes humaines cellules comme des organoïdes tridimensionnels (3D) de l’intestin grêle ou du côlon sur de longues périodes de temps a fourni une percée majeure parce que ces cultures affichent des caractéristiques déterminantes de l’épithélium intestinal in vivo 1 Fois , 2 (en) , 3. Les organoïdes dérivés des cryptes primaires sont capables d’auto-renouvellement et d’auto-organisation, présentant des fonctions cellulaires semblables à leurs tissus d’origine. En effet, les organoïdes récapitulent non seulement l’organisation structurelle des cryptes in vivo, mais aussi de nombreuses caractéristiques moléculaires, fournissant ainsi des outils utiles pour étudier la biologie normale et les états de la maladie. Pour illustrer, les études organoïdes ont révélé de nouvelles voies moléculaires impliquées dans la régénération des tissus1,2,3,4,5 ainsi que des médicaments qui pourraient améliorer la fonction dans les milieux pathologiques6,7.

L’étude des cellules souches intestinales est d’un intérêt particulier parce que la muqueuse intestinale est parmi les tissus mammifères les plus fortement régénératrices, se renouvelant tous les 3-5 jours pour protéger l’organisme contre les bactéries, les toxines et autres agents pathogènes au sein de la lumens intestinaux. Les cellules souches intestinales (ISC) sont responsables de cette remarquable capacité de régénération et fournissent ainsi un paradigme unique pour l’étude de la fonction des cellules souches adultes1,2. Des expériences de traçage de lignée chez la souris ont démontré que les cellules souches isolées lgr5-positives peuvent être cultivées pour produire des organoïdes 3D ou « mini-guts » in vitro où elles reflètent étroitement leurs homologues in vivo. Les cultures organoïdes peuvent également être dérivées d’isolats cellulaires de crypte intestinale composés d’ancêtres, d’ISC et de cellules Paneth, ces dernières constituant les cellules de niche épithéliales in vivo. En fait, la culture organoïde des cellules primaires de crypte intestinale a évolué en une technique relativement routinière qui est facile à mettre en œuvre dans la plupart des laboratoires utilisant des réactifs largement disponibles. Ce modèle est également favorable à l’analyse quantitative de l’expression génique par le séquençage de l’ARN (ARN-Seq) et les protéines par spectrométrie de masse, immunohistochimie, ou coloration immunofluorescente2,4,8. En outre, la génétique fonctionnelle peut être étudiée à l’aide d’approches de gain de fonction (surexpression ou expression génique d’un gène mutant activant) ou de perte de fonction (silençage génétique ou expression d’un mutant en perte de fonction)approche 2.

Fait important, la faible efficacité et la toxicité élevée de l’ADN plasmide standard ou des protocoles de transduction virale avec du polybrene demeurent un obstacle majeur dans le domaine. Bien que la technologie CRISPR/Cas9 permette une modification précise du génome, cette approche nécessite une sélection longue suivie d’une validation de séquence9. Ici, nous présentons un protocole de transduction virale pour les organoïdes intestinaux primaires qui optimise la livraison des particules virales par conjugaison aux nanoparticules magnétiques et l’application d’un champ magnétique. Les principales modifications apportées aux protocoles antérieurs4,5,10,11,12,13 et des recommandations pour améliorer l’efficacité sont fournies. Nous décrivons également une approche pour produire des sections congelées des organoïdes intacts cultivés dans le matrigel 3D (maintenant désigné sous le premier sous-sol matrice ou matrice de membrane) pour l’analyse plus approfondie avec l’immunohistochimie ou la coloration immunofluorescente.

Protocol

Ce protocole a été approuvé par le Johns Hopkins Medical Institutions Animal Care and Use Committee (IACUC). Ce protocole est modifié à partir d’une méthode déjà publiée10,11,12,13. 1. Préparation des réactifs Préparer le milieu frais 293T plusieurs heures à l’avance et réchauffer à 37 oC dans un bain d’eau pendant au moins 10 min avant utili…

Representative Results

Ici, nous décrivons une technique de transduction rapide et très efficace qui exploite les nanoparticules magnétiques exposées à un champ magnétique pour délivrer le lentivirus aux cellules d’intérêt. Avec des outils facilement disponibles, nous avons appliqué cette approche non seulement pour transduire des cellules cryptiques fraîchement isolées (Figure 1A), mais aussi pour les organoïdes (Figure 2) et d’autres cel…

Discussion

La culture primaire de l’épithélium intestinal adulte comme organoïdes fournit un outil puissant pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la fonction de cellules souches, l’homéostasie épithéliale intestinale, et la pathologie1,2,3, 4. Bien que la technologie CRISPR/Cas9 puisse être utilisée pour modifier génétiquement les organoïdes9, elle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), du Maryland Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), de l’American Lung Association, de l’Allegheny Health Network – Johns Hopkins Research Fund et le Hopkins Digestive Diseases Basic Research Core Center.

Materials

DMEM Thermo Fisher Scientific 11965092 Base medium for 293T cells
DMEM/F12+ Thermo Fisher Scientific 12634010 Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer
OPTI-MEM Thermo Fisher Scientific 11058021 Virus plasmids transfection medium
Fetal Bovine Serum Corning 35-011-CV Component of virus collection medium and 293T medium
Pen/Strep Thermo Fisher Scientific 15140122 Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer
PBS (without Ca2+, Mg2+) Thermo Fisher Scientific 10010049 A wash buffer and component of crypt dissociation buffer
Mem-NEAA Thermo Fisher Scientific 11140050 Component of organoid culture medium
GlutamaxII Thermo Fisher Scientific 35050061 Component of organoid culture medium
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080 Component of organoid culture medium
EGF Millipore Sigma E9644 Component of organoid culture medium
Noggin Peprotech 250-38 B Component of organoid culture medium
R-spondin R&D 7150-RS-025/CF Component of organoid culture medium
Human recombinant insulin Millipore Sigma I9278-5ml Component of organoid culture medium
Nicotinamide Millipore Sigma N3376-100G Component of Transduction medium
Wnt3A R&D 5036-WN-010 Component of Transduction medium
Y27632 Millipore Sigma Y0503-1MG Component of Transduction medium
0.5M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 Component of Crypts dissociation buffer
DTT (dithiothreitol) Thermo Fisher Scientific R0861 Component of Crypts dissociation buffer
Dispase I Millipore Sigma D4818-2MG Component of organoid digestion buffer
DNase I Millipore Sigma 11284932001 Component of organoid digestion buffer
matrigel(Growth factor reduced) Corning 356231 Used as a matrix to embed organoids
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 31985070 Medium for transfection in viral production
ViralMag R/L Oz Biosiences RL40200 Magnetic particles of viral transduction
Magnetic plate Oz Biosiences MF10000 Magnetic plate to facilitate viral transduction
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668019 Transfection agent in viral production
Poly-D-Lysine Millipore Sigma A-003-E Coating for plates before seeding 293T cells
4% Formaldehyde Solution Boster AR1068 Solution to fix organoids
O.C.T embedding compound Thermo Fisher Scientific 4583S For embedding of the the organoids
5 mL Falcon polystyrene tubes Corning 352054
50 mL Falcon Tubes Sarstedt 62.547.100
Orbitron rotator II Rocker Shaker Boekel Scientific 260250
Olympus Inverted microscop CK30 Olympus CK30 for scanning and counting crypts
Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence Nikon Axiovert 200 for viewing fluorescence in the crypts
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane Milipore Sigma UFC910024 For concentrating viruses
pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) pluriSelect SKU 43-50020 For preparing organoid fragments
Falcon Cell Strainer Fisher Scientific 352340 For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) Millipore Sigma M8937-100EA ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments
Animal strain: C57BL/6J Jackson Lab #000664 For organoid culture

References

  1. Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
  2. Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
  5. Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
  6. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  7. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
  8. Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent ‘+4’ cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
  9. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
  10. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
  11. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
  12. Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
  13. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  14. Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
  15. Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
  16. Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).

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Xian, L., Chia, L., Georgess, D., Luo, L., Shuai, S., Ewald, A. J., Resar, L. M. Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning. J. Vis. Exp. (147), e57040, doi:10.3791/57040 (2019).

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