Summary
Se describe un método para fraccionamiento de huntingtina mutada insoluble y soluble especies de ratón cerebro y la célula cultura. El método descrito es útil para la caracterización y cuantificación de flujo de la proteína huntingtina y SIDA en el análisis de homeostasis de proteínas en la patogénesis de la enfermedad y en presencia de perturbaciones
Abstract
La acumulación de proteínas mal plegadas es central a la patología en la enfermedad de Huntington (HD) y muchos otros trastornos neurodegenerativos. Específicamente, una característica patológica fundamental de HD es la acumulación aberrante de la proteína del mutante de HTT (mHTT) en complejos de alto peso molecular y los cuerpos de inclusión intracelulares compuesto por fragmentos y otras proteínas. Los métodos convencionales para medir y entender que las contribuciones de las diversas formas de agregados que contienen mHTT incluyen microscopía de fluorescencia, mancha blanca /negra occidental análisis y filtro trampa de ensayos.
Sin embargo, la mayoría de estos métodos es específicos de conformación y por lo tanto no puede resolver el estado completo del flujo de proteína mHTT debido a la naturaleza compleja de solubilidad total y resolución.
Para la identificación de complejos y varias formas modificadas y mHTT agregado, separación y solubilización de los agregados celulares y fragmentos es obligatoria. Aquí se describe un método para aislar y visualizar la mHTT soluble, monómeros, oligómeros, fragmentos y un insoluble alto peso molecular (HMW) acumulado mHTT especies. HMW mHTT pistas con la progresión de la enfermedad corresponde con lecturas de comportamiento del ratón y ha sido beneficioso modulada por determinadas intervenciones terapéuticas1. Este enfoque puede utilizarse con cultivo de células, los tejidos periféricos y cerebro de ratón, pero puede adaptarse a otro modelo de los sistemas o contextos de enfermedad.
Introduction
La interrupción de las redes de control de calidad de proteínas que aseguran el correcto plegamiento y degradación de proteínas celulares son probable central a patología en la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH) y otros "proteína mal plegamiento" trastornos de2,3. Una comprensión detallada de los componentes de red proteostasis y sus contribuciones a la patología son cruciales para el desarrollo de intervenciones terapéuticas mejoradas. HD es causado por la anormal extensión de una repetición de CAG en el gen de la EH en un tramo mayor de polyglutamines (poliQ) en la proteína de huntingtina (HTT)4. Una constante característica patológica de la patogenesia de la HD es la resultante mal plegamiento, acumulación y agregación de HTT en regiones del cerebro y en tejidos periféricos, que se ha demostrado que interferir en varios aspectos con la función y la homeostasis celular normal 5 , 6. HTT mientras que ubicuo se expresa, las neuronas espinosas medianas en el estriado son selectivamente vulnerables y más abiertamente afectadas con notable atrofia cortical asociada también a la patogenia de la HD.
La formación de agregados de HTT en el cerebro de pacientes con EH y en modelos animales por lo general ha servido como marcador de progresión de la enfermedad y la ganancia negativa dominante de la función para la mHTT7proxy. Aunque los mecanismos precisos por que la proteína mal plegamiento y agregación pueden contribuir a la toxicidad inducida por la mHTT siguen siendo confusos, la formación de las inclusiones en el cerebro de pacientes con EH y en varios modelos animales es una característica invariable e inevitable. Inclusiones aparecen a conformada en gran parte fragmentos HTT acumuladas que contiene el N-terminal ampliada poliQ, indicando que la proteólisis y de larga duración HTT como alternativa empalme8,9 pueden desempeñar un papel importante en la patogenesia de fragmentos N-terminal HD. HTT puede constituir una forma patológica de HTT que puede agregar rápidamente, nuclear y acelerar o propagar el proceso de agregación10.
Sin embargo, la presencia de estas inclusiones no se correlaciona necesariamente con toxicidad inducida HTT o célula muerte11. HTT se ha propuesto para someterse a un proceso de agregación de un monómero soluble a través de especies oligoméricas solubles y las fibrillas de β-hoja a agregados insolubles y las inclusiones12. Resolver estas diversas especies de proteína mediante análisis bioquímicos estándar ha sido un reto en el campo debido a su estabilidad en tampón de lisis poco detergente y dificultad en visualizar usando análisis bioquímicos estándar. Por lo tanto, consideraciones metodológicas son fundamentales para detectar el grado y patrón de la mHTT acumulada y agregada.
El protocolo presentado aquí ofrece un método para visualizar varios intermedios de HTT, específicamente la formación de una especie de HMW HTT insoluble que parece seguir muy de cerca con HD patogénesis y enfermedad progresión1,13 ,14. Ser capaz de resolver y seguimiento de múltiples especies de mHTT ofrece a los investigadores una herramienta bioquímica para estudiar la patogénesis de la enfermedad y evaluar posibles intervenciones terapéuticas a través de su modulación y su impacto en la patogénesis de la enfermedad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Declaración de ética animal - experimentos se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud y un protocolo de investigación de animales aprobados por el Comité de uso y cuidado institucional del Animal ( IACUC) de la Universidad de California, Irvine, un AAALAC institución acreditada. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales.
1. preparación de buffer de lisis
- Preparar "Soluble" tampón de lisis (10 mM Tris, pH 7.4, de 1% Triton-X 100, 150 mM NaCl, 10% glicerol) y un filtro estéril con filtro de 0.22 μm.
- Para un buffer de lisis "Solubles" de trabajo, medir N-etilmaleimida (NEM) y disolver completamente en 100 mM phenylmethysulfonyl fluoruro (PMSF) disuelto en 100% EtOH.
Nota: Inhibidores de tampón de lisis: (i) 20 mM N-etilmaleimida (NEM); (ii) 0,2 mM PMSF; (iii) 1 mM ortovanadato de sodio (Na3VO4); (iv) 1 leupeptin μg/mL; (v) 1 μg/mL aprotinina; (vi) 20 mM de fluoruro de sodio (NaF).
PRECAUCIÓN: Use una mascarilla cuando se trabaja con NEM en el protocolo. Tampón de lisis de trabajo debe hacerse fresca para inhibidores activos. - Tampón de lisis soluble con inhibidores de la proteasa, inhibidores de añadir en el siguiente orden: fluoruro sódico (NaF), enrasar con tampón de lisis frío, ortovanadato de sodio (Na3VO4), aprotinina y Leupeptin.
- Para un buffer de lisis "Solubles" de trabajo, medir N-etilmaleimida (NEM) y disolver completamente en 100 mM phenylmethysulfonyl fluoruro (PMSF) disuelto en 100% EtOH.
- Para el tampón de lisis "Insoluble", suplemento 4% SDS por agregar 500 μl de SDS 20% 2 ml de tampón de lisis "Soluble". Dejar a temperatura ambiente.
Nota: SDS precipita hacia fuera conservado a 4 ° C; Mantenga este a temperatura ambiente. Composición final de tampón de lisis: 10 mM Tris (pH 7.4); 1% Tritón X-100; 150 mM de NaCl; glicerol al 10%; 4% SDS (sólo insolubles).
2. solubles/insolubles fraccionamiento protocolo
Nota: Vea la figura 1 para un diagrama esquemático.
- Dos juegos de tubos para cada muestra de la etiqueta: "Soluble" e "Insoluble".
- Añadir X-μl de helada tampón de lisis soluble de trabajo complementado con inhibidores de la proteasa (véase 1.1.1) al tejido.
Nota: X = volumen varía dependiendo de la cantidad de tejido; Vea la tabla 1. - Para el tejido de cerebro de ratón (es decir, cuerpo estriado), dounce lentamente 30 veces en douncer de vidrio 1 mL y pipeta en "Insoluble" etiquetado tubo (mantener en hielo).
Nota: Tenga cuidado de no romper la superficie del líquido después de comenzar el douncing, como las burbujas se forma y pueden producir homogeneización incompleta. - Para las células (es decir, HeLa, HEK293T), enjuague las células una vez con frío, 1 x PBS. Quite PBS y aplicar mínimo volumen de tampón de lisis a las células y levante con el raspador de la célula.
Nota: Para sobre líneas celulares, las células fueron plateadas en 5 x 105 células por placa bien 6 y crecidas a cerca de la confluencia. Uno bueno es comparable a volúmenes utilizados para el striatum del ratón. - Transferencia homogeneizado o célula lisada en la etiqueta, "Insoluble" tubos y lyse en hielo 1 hora (reloj de inicio después de procesada tubo final).
Nota: Para los lysates de la célula, triturate varias veces romper grumos de células antes de comenzar la incubación. Evitar formación de burbujas. Brevemente vortex pulso cada muestra para 1 s a la mitad de lisis. - Centrifugar las muestras a 4 ° C a 15.000 x g por 20 min.
- Recuperar el sobrenadante como la fracción "Soluble".
- Extraiga con pipeta, tenga cuidado de no perturbar la capa pellets/nublado que esto contaminará la fracción. Fracción soluble de la pipeta en "Soluble" etiquetado tubo. Mantener en hielo.
- Lavar el pellet con 500 μl de tampón de lisis (x2) y centrifugar a 4 ° C a 15.000 x g durante 5 min después de cada lavado; pasa nada si parte de la capa turbia se pipetea apagado.
- Después del último lavado, eliminar todo el tampón de lavado restante dejando únicamente el pellet de tejido.
Nota: Desde este punto, muestras insolubles ahora deben ser mantenidas a temperatura ambiente. - Pellets de resuspender con X-μl de tampón de lisis con 4% SDS (volumen puede ajustarse dependiendo del tamaño de la pelotilla; ver tabla 1).
- Someter a ultrasonidos cada muestra durante 30 s a temperatura ambiente con un sonicador de sondeo (125 w, 20 kHz, pulso, amplitud 40%, ver Tabla de materiales).
- Hervir las muestras (rolling hervir) durante 30 minutos; Centrifugar brevemente (15 s) 6.000 x g en cuanto a no perder cualquier muestra.
- Realizar ensayo de proteína DC (detergente compatible) (véase Tabla de materiales) o ensayo de proteínas de Lowry para medir concentración de proteínas (se recomienda empezadas diluciones de 1/5 de la muestra en tampón de lisis respectivo para el cultivo celular y 1/10 para lisados de tejidos).
Nota: Las concentraciones de proteína debe ser leído usando un análisis DC o Lowry debido a la alta concentración de detergente. - Muestras alícuotas en 50 lotes de μL para evitar problemas de congelación y descongelación.
Nota: Protocolo puede pausarse aquí antes más análisis bioquímico mediante el almacenamiento de ambas fracciones a-20 ° C.
3. cuantificación y Western Blot
- Realizar western blot como se informó en otra parte1,13 por dilución 30 μg de muestra 1:1 en la carga de búfer (1.6 x tinte, 1 x reducción de la carga).
Nota: 30 μg de proteína por la fracción es suficiente, pero se puede ajustar para una resolución óptima. 3 - geles de poli-acrilamida de Tris acetato de 8% deben utilizarse para la fracción insoluble. 4 - se recomiendan geles de Tris bis 12% para la fracción soluble. - Hervir las muestras (hervir) por 5 min, centrifugar brevemente (15 s) 6.000 x g para obtener muestra.
- Analizar fracciones por SDS-PAGE y western blot, según protocolo del fabricante para muestras reducidas.
Nota: Fracción Insoluble resuelve mejor cuando transfieren a la membrana de nitrocelulosa de 0,45 μm. nitrocelulosa de 0,45 o 0,2 μm puede utilizarse para la fracción soluble, dependiendo del tamaño de la proteína de interés. Algunos optimización puede ser necesario para la mejor transferencia de materiales de APM. - Mancha la membrana con la mancha de la proteína entera (p. ej., MEMcode, ver la Tabla de materiales) para visualizar proteínas eficiencia de carga.
Nota: Manchas blancas /negras occidentales pueden ser analizadas por la intensidad de la medias pixel. Fracciones soluble pueden ser normalizados a una proteína de mantenimiento mejor adaptada para el sistema experimental. Fracción insoluble como la abundancia relativa de proteínas fue verificado por coloración reversible proteína o normalización de la histona 3 en blot separada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resolución de lysates de la célula soluble e insoluble después de fraccionamiento puede ser detectado usando western análisis y filtro de retraso análisis (figura 2). Por ejemplo, células HEK293T fueron transfectadas con el reactivo de transfección (p. ej., lipofectamine 2000) con exón HTT 1 cDNA codificación que contiene glutamina 97 repite15 seguido por la región rico poli prolina y estas células se les permitiera expresa para células de h. 44 fueron tratadas con cualquiera de los dos 5 μm MG132 para bloquear el proteasoma o DMSO como un control para 18 h antes de la cosecha y sometidas a lisis como descrita anteriormente. Siguiendo el protocolo de fraccionamiento, exón HTT mutante 1 resuelve como un monómero soluble alrededor de 45 kDa 4-12% Bis-Tris página geles y como una especie insoluble acumulada de APM en geles de Tris acetato página 3-8% (figura 2A). Monómero soluble puede ser cuantificado y normalizado a una proteína de mantenimiento de la casa (se muestra aquí como GAPDH). APM, mHTT insoluble se cuantifica como la abundancia relativa de proteínas por la intensidad de la medias pixel. Cuando son tratados con el inhibidor MG132, hay una disminución notable en monómeros solubles de mHTT junto con un aumento correspondiente en APM, mHTT insoluble.
Fracciones insolubles pueden ser analizadas por técnicas adicionales tales como un ensayo de filtro retraso para resolver la insoluble, fibrilar mHTT16 (figura 2B). Las células HeLa fueron transfectadas semejantemente como arriba con exón HTT 97Q 1, su-SUMO-1 o 2 su SUMO. Las células fueron tratadas con DMSO o MG132 para 18 h antes del fraccionamiento y analizaron mediante western blot y análisis de retraso del filtro. Los datos muestran que la presencia de la isoforma SUMO sobreexpresado aumenta tanto APM como mHTT insoluble fibrilar. Además de MG132 agravan el aumento de especies insolubles mHTT. Especie de mHTT HWM también puede ser modulada por la sobreexpresión o la reducción de la meta de enfermedad HD, PIAS1 en ambos HeLa células13 y ratón estriada1 (figura 2-D). Caída de PIAS1 en el modelo de ratón rápidamente de progreso del HD, la R6/2, con entrega viral de un siRNA contra PIAS1, reduce acumulación de HMW mHTT insoluble. Viral sobreexpresión de PIAS1 en ratones R6/2 conduce a un aumento notable en la APM mHTT insoluble (Figura 2D)1. El cambio en la solubilidad entre fracciones es cuantificable e indica que este protocolo puede seguir modulación de especies patógenas proteína mutante, haciendo de este una técnica conveniente para pre-clínicas evaluaciones bioquímicas de intervención sanitaria. Cambios en insoluble, especies fibrilares de mHTT también capturan de flujo entre las especies de proteína que es moduladas por tratamiento con MG132 o regulación de potenciales dianas terapéuticas, como PIAS11.
Figura 1: resolución de protocolo y proteína de fraccionamiento solubles/insolubles. (A) tubería Visual para protocolo de fraccionamiento. El protocolo descrito aquí puede aplicarse a muestras de cultura de tejido o células de ratón pero es conveniente para la adaptación a otros tipos de muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: representante de resultados para análisis y fractionations Soluble e Insoluble. Fracciones (A) Soluble e Insoluble de lisados de células HEK293T resuelta en un 4-12% Bis-Tris y geles de Tris acetato página 3-8%, respetuosamente. Fracción soluble normalizado para GAPDH control de carga muestra fluctuación mHTT basado en exposición a MG132 en monómeros solubles exón 1. Fracción insoluble muestra que especies acumuladas HMW de mHTT también es modulada por MG132 tratamiento. (B) análisis de las fracciones solubles e insolubles de lysates de la célula HeLa mediante western blot y el filtro de análisis de retraso: células HeLa transfectadas con su-SUMO-1 o 2 SUMO 97Q-HTT exón 1 y fueron tratadas con 5 μm MG132 para componentes 18 (C) Fraccionamiento soluble e insoluble de HeLa células overexpressing 97Q-HTT exón 1 y ya sea overexpressed PIAS1 o tratados con siRNA contra PIAS1 ver regulación de la acumulación de mHTT APM después modulando un target.* terapéutico potencial (D) Fracciones insolubles de striata de ratón trataron con microARN contra PIAS1 y resuelven en 3-8% Tris acetato página geles ver modulación de HWM insoluble mHTT **. Paneles (B-C) se han modificado con permiso13. Panel (D) se ha modificado con permiso1. * Reimpreso de O'Rourke et al. 13 con permiso. ** de Ochaba et al. 1 con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tejido (por hemisferio) | Peso aproximado (mg) | Soluble de volumen (μL) | Insoluble en volumen (μL) |
| ratón estriado | 30 | 250 | 150 |
| ratón de corteza | 100 | 500 | 250 |
| Hipocampo de ratón | 30 | 250 | 150 |
| Cerebelo de ratón | 40 | 250 | 150 |
| ratón del músculo esquelético * | 100 | 300 | 150 |
| Mouse de hígado (lóbulo) | 100 | 400 | 200 |
| * tejido conjuntivo forma interfaz lechoso; remover para evitar la contaminación | |||
Tabla 1: sugiere volúmenes (X) para el fraccionamiento de tejidos específicos para ambos buffers lisis soluble e insoluble. Volumen de buffer de lisis insoluble basado en a partir de cantidad de material, que se puede ajustar por consiguiente basado en el tamaño de sedimento insoluble.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Algunas precauciones son necesarias para que los protocolos anteriores asegurar resultados consistentes y cuantitativos. En primer lugar, mHTT en ambas fracciones espontáneamente forman agregados con el tiempo a múltiples ciclos de descongelación de congelación, especialmente cuando en una alta concentración. Por lo tanto es crítico para congelar alícuotas de las preparaciones de proteínas y descongelar sólo el volumen necesario antes de ejecutar el ensayo como se describe en el protocolo anterior. Además, si fracción insoluble produce precipitado blanco a descongelar, reconstitución puede ser necesaria por un adicional 5 s sonicación, hervir 5 minutos como de la cuantificación antes del análisis mediante ensayos bioquímicos.
Resolución cuantitativa de este ensayo es realizable por pixel media intensidad de fracción soluble a la de un control de carga o mantenimiento de la casa gene dentro de cada muestra de normalización. Como se muestra aquí, GAPDH se utilizó como un gen de mantenimiento de la casa de la fracción soluble como predominante se localiza en el citosol (figura 1). Otras proteínas de mantenimiento utilizados son α-tubulina y actina y Erk 1/2. Sin embargo, proteínas de normalización adecuado deben ser optimizadas para el sistema de ser estudiado para garantizar la expresión de estado estacionario para la normalización precisa y uninfluenced. Mientras que la fracción insoluble sirve como una fracción nuclear cruda por la presencia de la histona 3 y falta de GAPDH1, resolución de 3-8% página límites de detectabilidad a los geles comúnmente utilizado marcadores nucleares. Por lo tanto, la fracción insoluble es adecuada para la cuantificación mediante el valor de la intensidad de señal cruda como una representación relativa de abundancia de la proteína. Sin embargo, marcadores de proteínas enteras, como las manchas de proteína reversible, se utilizan para controlar las variaciones en la carga de la proteína y pueden ser adaptados como un factor de normalización para la fracción insoluble.
Además, mientras que el fraccionamiento ofrece una forma de resolver las especies mHTT insoluble y soluble, mHTT sufre numerosos cambios conformacionales en la patogénesis de la enfermedad, algunos de los cuales no serán distinguibles en la fracción insoluble. Además, algunas conformaciones pueden contribuir beneficiosamente en el resultado de la enfermedad y actúan como intermediarios de separación estable. Por lo tanto es importante identificar otras conformadores mHTT que correlacionan con los resultados de patogénesis. Algunos optimización puede ser necesario visualizar otros intermediarios mHTT. Para abordar esto, porcentaje de SDS se puede aumentar a 20% si el agregado es resistente a concentraciones más bajas.
Este protocolo muestra condiciones de fraccionamiento de proteínas y análisis resultantes que detectan diferentes conformaciones y fragmentos de mHTT acumulación y agregación en cultivo de células y un modelo de ratón transgénico de la EH. Este tipo de aislamiento de proteínas bioquímica está previsto para la evaluación de la progresión de la enfermedad en otros modelos de HD y puede contribuir a la comprensión creciente de la mHTT dinámica dentro de la célula y su impacto en la patología de la enfermedad.
Después de fraccionamiento, las muestras pueden procesarse en numerosas maneras. SDS-PAGE seguido por análisis de western blot resolverá especies mHTT soluble e insoluble para proporcionar una evaluación relativa a niveles de mHTT especies1. También es posible evaluar fracciones en ensayos bioquímicos adicionales para evaluar otras especies mHTT. Por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa (edad) pueden resolver y detectar mHTT oligomérica, soluble, mientras que un ensayo de retardo (FR) de filtro es una potente herramienta para detectar la mHTT insoluble, fibriloso especies16,17.
Una ventaja adicional que presenta este análisis es la evaluación de mislocalization proteínas relacionada con patogénesis. Como hemos demostrado en 18, este protocolo de fraccionamiento permite la visualización y seguimiento de proteínas como Rangap1, que parecen ser secuestrado por grandes agregados insolubles y no pueden resolverse en un gel de página estándar. Además, como este ensayo también sirve como una cruda separación nuclear citoplasmática, uno puede también medir mislocalization de proteínas, por ejemplo, p65, en modelos de ratón HD1.
Una motivación prominente para el análisis de la mHTT agregación y acumulación es el desarrollo de la novela HD diagnóstico y terapéutica. Se han identificado compuestos que inhiben o revertir la mHTT agregación de pantallas de alto rendimiento y pruebas específicas1,12,19,20,21. Sin embargo, dada la dificultad en la resolución de muchas de las formas de la mHTT, evaluación de modulación de agregación no siempre ha sido posible. Métodos de lisis tradicional pueden disponer de restos celulares sedimentados que potencialmente contienen proteína insoluble agregada o almacenadores intermediarios de la lisis no contener suficiente detergente para la solubilización. El método descrito aquí proporciona una plataforma para aislar y detectar una forma agregada de mHTT que puede ser utilizado como un marcador bioquímico en base de la célula o evaluaciones preclínicas en vivo .
Los ensayos aquí descritos pueden aplicarse a otras proteínas mal plegadas. Debido a la característica dinámica de proteínas mal plegadas, estos ensayos pueden acoplarse eficazmente con otros análisis para descubrir la profundidad mecanismos de homeostasis de proteínas y de agregación. Estos análisis incluyen medir los niveles de estado estacionario de agregados y sus particiones en fracciones de diferentes células (figura 1) o análisis de la proteína plegable/agregación utilizando proteínas recombinantes purificadas. Estos ensayos le ayudará a distinguir los efectos directos o indirectos de modulación farmacológica o genética en la degradación de las proteínas o agregación. Basándose en anteriores en vitro a-sinucleína fraccionado agregación evaluaciones22, desde entonces hemos aplicado este trabajo a modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson para resolver distintas conformaciones de una sinucleína23. Por lo tanto, protocolos descritos en este trabajo se pueden aplicar en otros modelos de agregación y mal plegamiento de proteínas y pueden contribuir al descubrimiento y desarrollo de nuevas terapias dirigidas a agregados proteínas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los NIH (to1-NS090390). También nos gustaría agradecer al Dr. Joan Steffanfor asistencia técnica y debate durante el desarrollo de este ensayo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
References
- Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
- La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
- Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
- Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
- Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
- Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
- Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
- Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
- Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
- Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
- O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
- Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
- Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
- Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
- Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
- Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
- Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).
