Summary
שיטה מתוארת עבור fractionation של מינים huntingtin מוטציה לא מסיסים ולא מסיסים מתרבות המוח ותא העכבר. השיטה המתוארת שימושית עבור כימות של huntingtin חלבון השטף ועזרי בניתוח הומאוסטזיס חלבון בפתוגנזה של המחלה, בנוכחות לפליטת ואפיון
Abstract
ההצטברות של חלבונים misfolded הוא מרכזי פתולוגיה של מחלת הנטינגטון (HD), רבים הפרעות ניווניות אחרות. באופן ספציפי, מפתח תכונה פתולוגית של HD הוא הצטברות חריגה של מוטציה בחלבון HTT (mHTT) לתוך מתחמי משקל מולקולרי גבוה, גופים הכללה תאיים המורכב מקטעי וחלבונים אחרים. שיטות קונבנציונליות כדי למדוד ולהבין שהתרומות של צורות שונות של אגרגטים המכילות mHTT כוללים קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, ניתוח תספיג מסנן השמנה מבחני.
עם זאת, רוב השיטות האלה הן קונפורמציה ספציפיים, ולכן לא יכול לפתור המדינה מלאה של mHTT השטף חלבון בשל האופי המורכב של צבירה מסיסות והרזולוציה.
לצורך זיהוי mHTT צבורים שונים צורות ששונה ואת מתחמי, ההפרדה ואת solubilization של אגרגטים הסלולר ואת שברי הוא חובה. כאן אנו מתארים שיטה כדי לבודד והמחש mHTT מסיסים מונומרים, oligomers, שברים, משקל מולקולרי גבוה (HMW) לא מסיסים שנצבר mHTT מינים. HMW mHTT שירים עם התקדמות המחלה, מתכתב עם העכבר התנהגות הקריאות הבאות, יש כבר מווסת לטובה על ידי התערבויות טיפוליות מסוימת1. גישה זו יכולה לשמש עם מוח העכבר רקמות היקפיים, תרבית תאים אבל שעשוי להיות מותאם דגם מערכות או מחלת בהקשרים אחרים.
Introduction
שיבוש רשתות בקרת איכות חלבון להבטיח קיפול נאות והשפלות של החלבונים הוא מרכזי סביר פתולוגיה מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), אחרים "חלבון misfolding" והפרעות2,3. הבנה מפורטת של רכיבי הרשת פרוטוסטאזיס ותרומתם פתולוגיה ולכן הם חיוניים לפיתוח התערבויות טיפוליות משופרת. HD נגרמת על ידי הרחבת חריג שידור חוזר חטיבתי בתוך הגן HD וכתוצאה מכך רצועת המורחב של polyglutamines (polyQ) חלבון huntingtin (HTT)4. תכונה פתולוגית עקבית של פתוגנזה HD היא וכתוצאה מכך misfolding, הצטברות, צבירה של HTT באזורים של המוח, ברקמות היקפיים, אשר הוכח להתערב במספר דרכים עם תאים נורמליים הומאוסטזיס ותפקוד 5 , 6. HTT בזמן מבוטא ubiquitously, בינוני קוצני נוירונים בסטריאטום פגיע באופן סלקטיבי, המושפע ביותר בגלוי עם ניוון קליפתי הבולטים המשויכים גם HD פתוגנזה.
היווצרות של אגרגטים של HTT במוח של חולים HD ומודלים בעלי חיים שימש בדרך כלל proxy סמן התקדמות המחלה ולהשיג דומיננטה-שלילי של פונקציה mHTT7. למרות המנגנון המדויק על ידי שבו חלבון misfolding, צבירת עשוי לתרום רעילות הנגרמת mHTT אינן ברורות, היווצרות של אלה תכלילים במוח של חולי HD, מודלים שונים היא תכונה קבוע ובלתי נמנע. תכלילים מופיעות כמורכבת במידה רבה של קטעים HTT שהצטברו המכיל N-מסוף מורחבת polyQ, המציין את proteolysis, וכן עיבוד של HTT באורך מלא, כמו גם אלטרנטיבה שחבור8,9 עשוי לשחק תפקיד חשוב בפתוגנזה של שברי HD. N-מסוף HTT עלולה להוות צורה פיפטות של HTT יכול לצבור במהירות, nucleate, ו להאיץ או להפיץ את תהליך של צבירת10.
עם זאת, הנוכחות של תכלילים אלה לא בהכרח לתאם עם רעילות HTT-induced או מוות תא11. HTT הוצע לעבור תהליך צבירת מ מונומר מסיסים דרך מינים oligomeric מסיסים ו β-גיליון הסיבים לא מסיסים אגרגטים, תכלילים12. פתרון אלה מינים שונים של חלבון באמצעות מבחני הביוכימי רגיל כבר אתגר בשטח עקב יציבות שלהם במאגר נמוך חומרי פירוק ולקשיי להמחיש באמצעות מבחני הביוכימי סטנדרטי. לפיכך, שיקולים מתודולוגי הם קריטיים באיתור את התואר ואת התבנית של mHTT המצטבר של צבור.
פרוטוקול המובאת כאן מספק שיטה כדי להמחיש כמה intermediates של HTT, במיוחד היווצרות של זן HMW HTT לא מסיסים המופיע לעקוב מקרוב אחר עם HD בפתוגנזה של המחלה התקדמות1,13 ,14. היכולת לזהות ולעקוב אחר מספר מינים של mHTT מספק חוקרים כלי הביוכימי ללמוד בפתוגנזה של המחלה ואף להעריך את פוטנציאל התערבויות טיפוליות דרך שלהם אפנון ואת ההשפעה על המחלה פתוגנזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דוח אתיקה בעלי חיים - ניסויים בוצעו בהתאמה קפדנית עם המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים, פרוטוקול מחקר בבעלי חיים שאושרו על-ידי (אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש IACUC) ב אוניברסיטת קליפורניה, אירווין, מוכר AAALAC המוסד. כל המאמצים נעשו כדי למזער את סבלם של בעלי החיים.
1. הכנה של פירוק מאגרי
- להכין "מסיסים" פירוק מאגר (10 מ מ טריס pH 7.4, 1% טריטון-X 100, 150 מ מ NaCl, 10% גליצרול) וסינון סטרילי דרך מסנן מיקרומטר 0.22.
- עבור עבודה "מסיסים" מאגר פירוק, N-Ethylmaleimide (NEM) וכולן ביסודיות להמיס 100 מ מ phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) מומס 100% EtOH.
הערה: פירוק מאגר מעכבי: (i) 20 מ מ N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0.2 מ מ PMSF; (iii) 1 מ"מ orthovanadate נתרן (Na3VO4); (iv) leupeptin µg/mL 1; (v) aprotinin µg/mL 1; (vi) 20 מ מ סודיום פלואוריד (NaF).
התראה: תלבש מסיכת פנים בעת עבודה עם NEM לאורך כל הפרוטוקול. עובד פירוק מאגר להתבצע טריים כדי להבטיח מעכבי פעיל. - עבור מאגר פירוק מסיס עם מעכבי פרוטאז, הוסף מעכבי לפי הסדר הבא: סודיום פלואוריד (NaF), עד נפח עם מאגר פירוק קר, orthovanadate נתרן (Na3VO4), Aprotinin Leupeptin.
- עבור עבודה "מסיסים" מאגר פירוק, N-Ethylmaleimide (NEM) וכולן ביסודיות להמיס 100 מ מ phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) מומס 100% EtOH.
- עבור מאגר פירוק "מסיסים", מוסף 4% מרחביות על-ידי הוספת µL 500 למען חברה דמוקרטית 20% 2 מ של מאגר פירוק "Soluble". יוצאים בטמפרטורת החדר.
הערה: למען חברה דמוקרטית לזרז את כאשר שמרו ב 4 ° C; . לשמור את זה אווריריות. קומפוזיציה פירוק מאגר הסופי: 10 מ מ טריס (pH 7.4); 1% טריטון X-100; 150 מ מ NaCl; 10% גליצרול; 4% מרחביות (לא מסיס בלבד).
2. מסיסים/לא מסיס Fractionation פרוטוקול
הערה: ראה איור 1 מפרטים טכניים.
- תווית שתי ערכות של צינורות עבור כל דגימה: "Soluble" ו- "לא מסיסים."
- להוסיף X-µL קר כקרח מאגר פירוק מסיסים לעבוד עם מעכבי פרוטאז (ראה 1.1.1) לרקמה.
הערה: X = אמצעי האחסון משתנה בהתאם כמות רקמת; ראה טבלה 1. - עבור העכבר רקמת מוח (קרי, סטריאטום), דאונס לאט 30 פעמים זכוכית 1 מ"ל douncer ו pipet לתוך"לא מסיס"הנקרא צינור (לשמור בקירור).
הערה: יש להיזהר לא לשבור את פני השטח של הנוזל לאחר הפעלת douncing, כמו בועות יהיה טופס תניב המגון לא שלם. - עבור תאים (קרי, הלה, HEK293T), לשטוף תאים פעם אחת עם קר, 1 x PBS. להסיר PBS חלות נפח מינימלי של מאגר פירוק תאים, תרים עם תא המגרד.
הערה: עבור מעל שורות תאים, התאים היו מצופה ב 5 x 105 תאים לכל צלחת טוב 6, גדל ליד confluency. אחד טוב הוא דומה לאמצעי אחסון המשמש סטריאטום העכבר. - העברת homogenate או lysate לתוך התא הנקרא, צינורות "מסיסים" ואת lyse על קרח 1 h (התחל שעון לאחר עיבוד סופי צינור).
הערה: עבור תא lysates, triturate מספר פעמים כדי לשבור את התא הגושים לפני מתחיל אינקובציה. למנוע היווצרות בועות. בקצרה מערבולת דופק כל דגימה עבור 1 s בחצי הדרך lysing. - צנטריפוגה דגימות ב 4 ° C-g x 15,000 עבור 20 דקות.
- לשחזר תגובת שיקוע כמו השבר "Soluble".
- להסיר עם pipet, להיזהר שלא להפריע שכבה גלולה/מעונן כמו זה לזהם את השבר. Pipet שבר מסיסים לתוך "Soluble" תוויות שפופרת. לשמור על הקרח.
- לרחוץ גלולה עם 500 µL של פירוק מאגר (x2), צנטריפוגה ב 4 ° C-g x 15,000 עבור 5 דקות אחרי זה לשטוף; זה בסדר אם חלק השכבה מעונן הוא pipetted.
- לאחר השטיפה הסופית להסיר כל מאגר שטיפת הנותרים עוזב רק בגדר רקמות.
הערה: מנקודה זו, דגימות לא מסיסים יש עכשיו לשמור בטמפרטורת החדר. - Resuspend גלולה עם מאגר פירוק X-µL בתוספת 4% מרחביות (אמצעי אחסון ניתן להתאים בהתאם לגודל צניפה; ראה טבלה 1).
- Sonicate כל דגימה ל 30 s בטמפרטורת החדר עם sonicator המכשיר (125 וואט, 20 kHz, הדופק, משרעת ב-40%, ראה טבלה של חומרים).
- להרתיח דגימות (מתגלגל לרתיחה) במשך 30 דקות; צנטריפוגה בקצרה (15 s) ב 6,000 g x כדי לא לאבד את דוגמה.
- לבצע DC (דטרגנט תואם) חלבון assay (ראה טבלה של חומרים) או שיטת לאורי למדידת ריכוז חלבון (מומלץ דילולים התחיל של 1/5 מדגם במאגר פירוק בהתאמה לתרבות תא, 10/1 lysates רקמות).
הערה: ריכוז חלבון יהיה ניתן לקריאה באמצעות וזמינותו של DC או לאורי בשל ריכוז גבוה של דטרגנט. - דוגמאות aliquot 50 µL אצוות כדי למנוע בעיות ההקפאה-הפשרה.
הערה: פרוטוקול ניתן להשהות כאן לפני ניתוח ביוכימי נוסף על-ידי אחסון שני שברים ב-20 ° C.
3. תספיג חלבון ו כמת
- לבצע שהכלים המערבי כפי שדווח במקום1,13 על ידי המדללת 30 µg מדגם 1:1 בקופסא טעינת מאגר (1.6 x בטעינת צבע, 1 x הפחתת).
הערה: 30 µg של חלבון ליום שבר מספיקה, אך ניתן לכוונן את רזולוציה מיטבית. 3 - 8% טריס-אצטט פולי-אקרילאמיד ג'לים אמור לשמש את השבר לא מסיסים. 4 - 12% bis-טריס ג'לים מומלץ עבור השבר מסיסים. - מרתיחים דגימות (בהרתחה מתגלגל) 5 דק צנטריפוגה בקצרה (15 s) ב 6,000 g x כדי לאסוף דוגמה.
- לנתח שברים על ידי עמודים מרחביות, תספיג חלבון על פי הפרוטוקול של היצרן עבור דגימות מופחת.
הערה: שבר לא מסיסים פותר הטוב ביותר כאשר העבירו על גבי הממברנה ניטרוצלולוזה מיקרומטר 0.45. 0.45 או 0.2 µM ניטרוצלולוזה יכול לשמש עבור השבר מסיסים, בהתאם לגודל של החלבון עניין. אופטימיזציה מסוימים עשוי להידרש להעברה הטוב ביותר של חומרים HMW. - כתם קרום עם חלבון כל כתם (למשל, MEMcode, ראה הטבלה של חומרים) לדמיין חלבון נצילות ההטענה.
הערה: ניתן לנתח שהכלים המערבי באינטנסיביות פיקסל רע. אפשרות לנרמל את השברים מסיסים כדי חלבון משק בית הכי מתאים עבור מערכת ניסויית. שבר לא מסיסים כמו חלבון יחסית שפע אומתה על ידי חלבון הפיך להכתים או 3 היסטון נורמליזציה על כתם נפרדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
רזולוציה של lysates תא מסיסים ובחלקם לא מסיסים בעקבות fractionation ניתן להבחין באמצעות המערבי ניתוח ומסנן פיגור מבחני (איור 2). לדוגמה, תאים HEK293T היו transfected באמצעות ריאגנט תרביות תאים (למשל, lipofectamine 2000), עם HTT אקסון 1 cDNA קידוד המכילים גלוטמין 97 חוזר15 ואחריו האזור עשיר של פרולין פוליפוני, תאים אלה הורשו אקספרס עבור תאים ה 44 טופלו עם גם 5 מיקרומטר MG132 כדי לחסום את פרוטאוזום או דימתיל סולפוקסיד כפקד 18 h לפני הקציר, lysed כפי שתוארו לעיל. בעקבות פרוטוקול fractionation, HTT מוטציה אקסון 1 פותר כמו מונומר מסיסים kDa בסביבות 45 על 4-12% Bis-טריס דף ג ' לים, כמין HMW לא מסיסים שהצטברו על ג'לים טריס-אצטט דף 3-8% (איור 2 א). מונומר מסיסים ניתן לכמת, מנורמל ל חלבון משק בית (המוצג כאן כמו GAPDH). HMW, mHTT לא מסיסים היא לכמת כמו חלבון יחסית שפע באינטנסיביות פיקסל רע. כאשר מטופלים עם החומר המדכא MG132, יש ירידה ניכרת מונומר מסיסים של mHTT יחד עם וגידול מקביל HMW, mHTT לא מסיסים.
שברים לא מסיסים ניתן לנתח באמצעות טכניקות נוספות כגון פיגור מסנן assay לפתרון לא מסיסים, fibrillar mHTT16 (איור 2B). הלה התאים היו transfected לעיל באופן דומה עם 97Q-HTT אקסון 1, שלו-סומו-1 או שלו-סומו-2. התאים שטופלו דימתיל סולפוקסיד או MG132 עבור 18 h לפני fractionation, נותחה באמצעות תספיג ואת מבחני סינון פיגור. הנתונים מראה כי הנוכחות של isoform סומו overexpressed מגביר הן HMW והן fibrillary mHTT קשי תמס. תוספת של MG132 מחריף העלייה במינים mHTT קשי תמס. HWM mHTT מינים יכול גם להיות מווסת על ידי ביטוי או הפחתה של המטרה המחלה HD, PIAS1 שני הלה תאים13 ו העכבר מסורטטת1 (איור 2C-D). נוקאאוט של PIAS1 במודל עכבר מתקדם במהירות של HD, ה-R6/2, באמצעות משלוח ויראלי siRNA נגד PIAS1, מפחית את הצטברות HMW mHTT קשי תמס. ביטוי ויראלי של PIAS1 בעכברים R6/2 מוביל לעלייה הבולטים HMW mHTT לא מסיסים (איור דו-ממדי)1. השינוי שחל מסיסות בין שברים לכימות, המציין כי פרוטוקול זה ניתן לעקוב אחר אפנון של זנים פתוגניים מוטציה בחלבון, שהופך את טכניקה מתאימה עבור ניסויים פרה-קליניים ביוכימי הערכות של המחלה התערבות. שינויים לא מסיס, fibrillar מינים של mHTT גם ללכוד השטף בין המינים חלבון זה הוא מווסת על ידי טיפול עם MG132 או רגולציה של מטרות טיפוליות אפשריות, כגון PIAS11.
איור 1: פרוטוקול fractionation מסיסים/לא מסיס ופתרון חלבון. (א) צינור חזותי עבור פרוטוקול fractionation. פרוטוקול המתוארים כאן ניתן להחיל על העכבר רקמות או תא תרבות דגימות אך מתאים התאקלמות לסוגים אחרים מדגם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: נציג תוצאות עבור fractionations Soluble, לא מסיס וניתוחים. Soluble (א), לא מסיס שברים של HEK293T תא lysates נחוש של 4-12% Bis-טריס וג'ל טריס-אצטט דף 3-8%, עם כל הכבוד. שבר מסיסים מנורמל ל GAPDH טעינת פקד מציג את התנודות של mHTT אקסון 1 מסיסים מונומר המבוסס על חשיפה MG132. שבר לא מסיסים מראה כי HMW מינים מצטבר של mHTT הוא גם מווסת על ידי טיפול MG132. (B) ניתוח של שברים מסיסים ובחלקם לא מסיסים של הלה תא lysates באמצעות ניתוחים פיגור המערבי של כתם ומסנן: הלה התאים היו transfected עם שלו-סומו-1 או סומו-2 ו/או 97Q-HTT אקסון 1 ו שטופלו 5 מיקרומטר MG132 עבור hr.* 18 (ג) Fractionation מסיסים ובחלקם לא מסיסים מתאי הלה overexpressing 97Q-HTT אקסון 1 ולאחר מכן overexpressed PIAS1 או שטופלו siRNA בניגוד לתקנות הצג PIAS1 של HMW mHTT הצטברות לאחר להתכוונן טיפולית פוטנציאל של target.* (D) שברים קשי תמס של העכבר מסורטטת שטופלו microRNA נגד PIAS1 ותוקנו ב- 3-8% דף טריס-אצטט ג'לים הצג אפנון של HWM לא מסיסים mHTT * *. פאנלים (בג) שונו עם הרשאה13. לוח (D) השתנה עם הרשאה1. * מתפרסם מ או'רורק ואח. 13 עם הרשאה. * * מכתב Ochaba. et al. 1 באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| רקמה (לכל חצי הכדור) | משקל משוער (מ ג) | נפח מסיסים (µL) | אמצעי האחסון לא מסיס (µL) |
| העכבר סטריאטום | 30 | 250 | 150 |
| העכבר בקליפת המוח | 100 | 500 | 250 |
| העכבר ההיפוקמפוס | 30 | 250 | 150 |
| העכבר הקטן | 40 | 250 | 150 |
| העכבר שריר השלד * | 100 | 300 | 150 |
| העכבר הכבד (lobe) | 100 | 400 | 200 |
| * רקמת חיבור הטפסים הממשק חלבי; להסיר כדי למנוע זיהום | |||
טבלה 1: הציע כרכים (X) עבור fractionation רקמות ספציפיות עבור שני מאגרים פירוק מסיסים ובחלקם לא מסיסים. פירוק לא מסיסים מאגר אחסון מבוסס על הפעלת כמות החומר, אשר ניתן להתאים בהתאם בהתאם לגודל גלולה לא מסיסים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כמה אמצעי זהירות נדרשים עבור הפרוטוקולים לעיל להבטיח תוצאות עקביות, תפוקה. ראשית, mHTT שני שברים באופן ספונטני יהוו אגרגטים לאורך זמן על מחזורי הפשרת ההקפאה מרובים, במיוחד כאשר אתה נמצא ריכוז גבוה. לפיכך חיוני כדי להקפיא aliquots של חלבון preps, ולאחר להפשיר רק את אמצעי האחסון הדרושים לפני הפעלת וזמינותו כמתואר לעיל בפרוטוקול. עוד, אם השבר לא מסיסים התשואות precipitant לבן עם מפשיר, שיחזור ייתכן שיהיה צורך מאת נוספים הדופק sonication s 5, 5 דקות לרתיחה, כימות מחדש לפני ניתוח באמצעות מבחני הביוכימי.
רזולוציה כמותיים עבור assay הזה הוא בר השגה על ידי נרמול פיקסל כלומר עוצמת שבר מסיסים לזה של טעינת פקד או משק בית גן בתוך כל דגימה. כפי שמוצג להלן, GAPDH שימש גן נקיון השבר מסיסים כמו זה בעיקר. רגישה ציטוזול (איור 1). לחלבונים אחרים-משק בית נפוצים הם אקטין, α-טובולין, טיפשה 1/2. עם זאת, חלבונים מתאימים נורמליזציה צריך להיות אופטימיזציה עבור מערכת נחקר על מנת להבטיח מצב יציב ביטוי עבור נרמול uninfluenced ומדויקים. השבר לא מסיסים מגישה כשבר גרעיני גס כפי שנראה על ידי נוכחות של היסטון 3 וחוסר GAPDH1, רזולוציה ב- 3-8% דף ג ' לים detectability גבולות כדי נפוץ בשימוש סמני גרעינית. לכן, השבר לא מסיסים מתאים כימות באמצעות הערך עוצמת האות raw ייצוג יחסי של חלבון שפע. אולם, סמנים חלבון שלם, כגון חלבון הפיך כתמים, משמשים כדי לשלוט בווריאציות חלבון טעינה, שעשוי להיות מותאם כגורם נורמליזציה עבור שבר לא מסיסים.
בנוסף, בעוד fractionation מספק אמצעי לפתרון מינים mHTT מסיסים ולא מסיסים, mHTT עובר שינויים רבים הסתגלותי במהלך המחלה פתוגנזה, שחלקם לא יהיה ניתן להבחנה של השבר לא מסיסים. יתר על כן, כמה הייצורים החיים עשויים לתרום לטובה לקראת תוצאות המחלה, לשמש intermediates סיווג יציב. לכן חשוב לזהות אחרים conformers mHTT הקשורות עם תוצאות עבור פתוגנזה. אופטימיזציה מסוימים ייתכן שיהיה צורך לדמיין intermediates mHTT אחרים. כדי לטפל בבעיה זו, למען חברה דמוקרטית באחוזים ניתן להגדיל ל-20% אם הצבירה עמיד להורדת ריכוזי.
פרוטוקול זה מדגים תנאי fractionation חלבון, מבחני וכתוצאה מכך המאתרות הייצורים החיים השונים, שברי mHTT הצטברות של צבירת תרבית תאים והן העכבר הטרנסגניים מודל של HD. סוג זה של בידוד חלבון הביוכימי הוא שחזה הערכה של התקדמות המחלה במודלים אחרים HD, עשויה לתרום להבנת הדינמיקה mHTT בתוך התא והשפעתם על המחלה פתולוגיה הולך וגדל.
לאחר fractionation, דוגמאות ניתן לעבד בדרכים רבות. מרחביות-דף ואחריו תספיג ניתוח יפתור מינים mHTT מסיסים ובחלקם לא מסיסים כדי לספק הערכה יחסית על רמות של מינים mHTT1. זה גם אפשרי להעריך שברים במבחני ביוכימיים נוספים להעריך עוד יותר מינים mHTT. למשל, agarose בג'ל (גיל) ניתן לפתור, לזהות מסיסים, oligomeric mHTT, בעוד assay פיגור (FR) מסנן הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות לא מסיסים, fibrillary mHTT מינים16,17.
יתרון נוסף שזה וזמינותו מציג הוא בחינה של חלבון mislocalization המשויך פתוגנזה. כפי הפגנו 18, פרוטוקול fractionation זה מאפשר הדמיה מעקב של חלבונים כגון Rangap1, אשר מופיעים כדי להיות בבידוד על ידי אגרגטים גדולים לא מסיסים, לא יכול לפתור. על ג'ל דף רגיל. בנוסף, כמו assay הזה משמש גם הפרדת גרעיני/cytoplasmic גולמי, אחד גם להעריך mislocalization של חלבונים, למשל, p65, ב- HD העכבר models1.
מניע בולטים לניתוח של צבירת mHTT והצטברות הוא הפיתוח של הרומן HD ולכלי הרפוי. תרכובות לעכב או לבטל mHTT צבירת זוהו מסכי תפוקה גבוהה, יישוב בדיקות1,12,19,20,21. עם זאת, לאור הקושי בפתרון רבים של הצורות של mHTT, הערכה של צבירת אפנון לא תמיד היה ריאלי. שיטות מסורתיות פירוק יכול להיפטר פסולת הסלולר מגורען פוטנציאל מכילות חלבונים לא מסיסים צבירה, או פירוק מאגרי אינו יכול להכיל מספיק סבון עבור solubilization. השיטה המתוארת כאן מספק פלטפורמה עבור בידוד וכן זיהוי צורה מצטבר של mHTT יכול לשמש כסמן ביוכימיים בתא מבוסס או קליניים ויוו הערכות.
ניתן להחיל את מבחני המתוארים כאן חלבונים misfolded אחרים. בשל התכונה דינמי של חלבונים misfolded, מבחני אלה יכול להיות ביעילות יחד עם ניתוחים אחרים לחשוף את מנגנוני מעמיק של הומאוסטזיס חלבון, צבירת. ניתוחים אלה כוללים מדידת רמות מצב יציב של אגרגטים שלהם מחיצות בחלקים תאים שונים (איור 1) או ניתוח של חלבון קיפול/צבירת באמצעות חומרים מטוהרים. מבחני אלה יעזור כדי להבחין בין השפעות ישיר או עקיף של אפנון גנטית או תרופתי על חלבון השפלה או צבירה. בונים על קודמים במבחנה -synuclein fractionated צבירת הערכות22, אנחנו מאז החלת עבודה זו מחלת פרקינסון מודלים העכבר כדי לפתור הייצורים החיים השונים של-synuclein23. לכן, פרוטוקולים המתואר בעבודה זו שיוחלו על דגמים אחרים של חלבון misfolding, צבירה, עשוי לתרום בגילוי ופיתוח של הרפוי חדש מיקוד חלבונים צבורים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH (RO1-NS090390). כן נרצה להודות דיון במהלך פיתוח assay זה וסיוע טכני ד ר ג'ואן Steffanfor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
References
- Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
- La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
- Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
- Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
- Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
- Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
- Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
- Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
- Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
- Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
- O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
- Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
- Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
- Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
- Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
- Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
- Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).
