Summary
En metod som beskrivs för fraktionering av olösliga och lösliga muterade huntingtin arter från mus hjärnan och cell kultur. Den beskrivna metoden är användbar för karakterisering och kvantifiering av huntingtin protein flux och aids analysera protein homeostas i sjukdomspatogenes och i närvaro av störningar
Abstract
Ansamling av felveckning proteiner är central för patologi i Huntingtons sjukdom (HD) och många andra neurodegenerativa sjukdomar. Särskilt viktiga patologiska HD kännetecknas av avvikande ansamling av muterade HTT (mHTT) protein i ultrahög molekylvikt komplex och intracellulära inkludering organ består av fragment och andra proteiner. Konventionella metoder att mäta och förstå bidragen från olika former av mHTT-innehållande aggregat inkluderar fluorescensmikroskopi, western blot analys och filter fälla analyser.
Men de flesta av dessa metoder är konformation specifika och kan därför inte lösa hela delstaten mHTT protein flux på grund av den komplicerade karaktären av aggregerade löslighet och upplösning.
För identifiering av aggregerad mHTT och olika modifierade former och komplex är separation och lösbarhet av cellulära aggregat och fragment obligatoriskt. Beskriver här vi en metod för att isolera och visualisera lösliga mHTT, monomerer, oligomerer, fragment och en olöslig hög molekylvikt (HMW) samlat mHTT arter. HMW mHTT spår med sjukdomsprogression, överensstämmer med musen beteende utläsningar och har varit fördelaktigt moduleras av vissa terapeutiska interventioner1. Denna strategi kan användas med musen hjärnan, perifera vävnader och cellkultur men kan anpassas till andra modellsystem eller sjukdom sammanhang.
Introduction
Störningar av protein kvalitetskontroll nätverk som säkerställer korrekt vikning och nedbrytning av cellulära proteiner är sannolikt central till patologi i Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom (HD), och andra ”protein felvikning” sjukdomar i2,3. En detaljerad förståelse av de proteostasis nätverkskomponenterna och deras bidrag till patologi är därför avgörande att utveckla förbättrade terapeutiska interventioner. HD orsakas av onormal utvidgning av en CAG upprepning inom HS-genen resulterar i en utökad sträcka av polyglutamines (polyQ) i proteinet huntingtin (HTT)4. Ett konsekvent patologiska inslag i HD patogenes är den resulterande Skellefteåsjukan, ackumulering och aggregering av HTT i regioner i hjärnan och i perifera vävnader, som har visat sig på flera sätt störa normal cell homeostas och funktion 5 , 6. medan HTT uttrycks ubiquitously, medellång taggig nervceller i striatum är selektivt sårbara och mest öppet påverkas med anmärkningsvärda kortikal atrofi även associerade med HD patogenes.
Bildandet av aggregat av HTT i hjärnan hos HS patienter och djurmodeller har vanligtvis serveras som proxy markör för sjukdomsprogression och dominant-negativ vinst på funktion för mHTT7. Även om de exakta mekanismer genom vilka protein Skellefteåsjukan och aggregation kan bidra till mHTT-inducerad toxicitet förblir oklart, är bildandet av dessa inneslutningar i hjärnan av HS-patienter och olika djurmodeller ett invariant och oundvikliga inslag. Inneslutningar visas att bestå till stor del av ackumulerade HTT fragment som innehåller N-terminalen utökades polyQ, vilket indikerar att proteolys och bearbetning av fullängds HTT samt alternativ splitsning8,9 kan spela en viktig roll i patogenesen av HD. N-terminala HTT fragment kan utgöra en patologisk form av HTT som kan aggregera snabbt, kärnbildas, och accelerera eller sprida den aggregation process10.
Men korrelerar förekomsten av dessa inneslutningar inte nödvändigtvis med HTT-inducerad toxicitet eller cell död11. HTT har föreslagits att genomgå en aggregering processen från en löslig monomer genom lösliga Oligomera arter och β-ark fibriller till olösliga aggregat och inneslutningar12. Att lösa dessa olika protein arter via standard biokemiska analyser har varit en utmaning i fältet på grund av deras stabilitet i låg-tvättmedel lyseringsbuffert och svårigheten att visualisera använder biokemisk standardanalyser. Metodologiska överväganden är således viktiga att upptäcka graden och mönster av ackumulerade och aggregerad mHTT.
Det protokoll som presenteras här ger en metod för att visualisera flera intermediärer av HTT, särskilt bildandet av en olöslig HMW HTT art som verkar nära spåra med HD patogenes och sjukdom progression1,13 ,14. Kunna lösa och spåra flera arter av mHTT ger forskare en biokemisk verktyg för att studera sjukdomspatogenes och utvärdera potentiella terapeutiska interventioner genom sin modulering och inverkan på sjukdomspatogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djura etik uttalande - experiment utfördes i strikt överensstämmelse med Guide för skötsel och användning av laboratoriedjur av National Institutes of Health och ett godkända djurförsök protokoll av den institutionella djur vård och användning kommittén ( IACUC) vid University of California, Irvine, en AAALAC ackrediterad institution. Alla ansträngningar har gjorts att minimera djurens lidande.
1. beredning av Lysis buffertar
- Förbereda ”lösliga” lyseringsbuffert (10 mM Tris pH 7,4, 1% Triton-X 100, 150 mM NaCl, 10% glycerol) och sterila filter genom 0,22 µm filter.
- För en fungerande ”lösliga” lyseringsbuffert, mäta N-Ethylmaleimide (NEM) och grundligt lös i 100 mM phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) löses i 100% EtOH.
Obs: Lysis buffert-hämmare: a 20 mM N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0,2 mM PMSF; (iii) 1 mM natrium orthovanadate (Na3VO4). (iv) 1 µg/mL leupeptin; (v) 1 µg/mL aprotinin; (vi) 20 mM natriumfluorid (NaF).
FÖRSIKTIGHET: Bära en ansiktsmask när du arbetar med NEM i hela protokollet. Arbetar lyseringsbuffert måste göras färsk att säkerställa aktiva hämmare. - För lösliga lyseringsbuffert med proteashämmare, lägga till hämmare i följande ordning: natriumfluorid (NaF), upp till volym med kall lyseringsbuffert, natrium orthovanadate (Na3VO4), Aprotinin och Leupeptin.
- För en fungerande ”lösliga” lyseringsbuffert, mäta N-Ethylmaleimide (NEM) och grundligt lös i 100 mM phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) löses i 100% EtOH.
- För ”olösliga” lyseringsbuffert, tillägg till 4% SDS genom att lägga till 500 µL 20% SDS 2 mL lyseringsbuffert ”lösliga”. Lämna i rumstemperatur.
Obs: SDS kommer fällningen ut vid 4 ° C; Håll detta vid rumstemp. Slutliga lyseringsbuffert sammansättning: 10 mM Tris (pH 7,4); 1% Triton x-100; 150 mM NaCl. 10% glycerol; 4% SDS (endast olösligt).
2. lösliga/svårlösliga fraktionering protokoll
Obs: Se figur 1 för en schematisk.
- Märk två uppsättningar av rör för varje prov: ”lösliga” och ”olösliga”.
- Lägg till X-µL iskall lösliga arbetande lyseringsbuffert som kompletteras med proteashämmare (se 1.1.1) vävnad.
Obs: X = volym varierar beroende på vävnad belopp; Se tabell 1. - För musen hjärnvävnad (dvs, striatum), dounce långsamt 30 gånger i glas 1 mL douncer och Pipettera till ”olösliga” märkt tube (hålla på is).
Obs: Var noga med att inte bryta ytan av vätska efter start douncing, som bubblor kommer form och kan ge ofullständig homogenisering. - För celler (dvs.HeLa, HEK293T), skölj celler en gång med kallt, 1 x PBS. Ta bort PBS och använda minimal volym lyseringsbuffert celler och lyft med cell skrapa.
Obs: För ovan cellinjer, celler var klädd på 5 x 105 celler per 6 väl platta och vuxit till nära konfluens. En är väl jämförbar med volymer som används för mus striatum. - Överföra Homogenatet eller cell lysate in märkt, ”olösliga” rör och lyse på is 1 h (Start klockan efter sista röret bearbetas).
Obs: För cell lysates, pulverisera flera gånger för att bryta upp cell klumpar innan inkubering. Undvika att bubblor bildas. Kort vortex puls varje prov för 1 s halvvägs genom lyseringslösning. - Centrifugera proverna vid 4 ° C vid 15 000 x g i 20 min.
- Återställa supernatanten som ”lösliga” bråket.
- Ta bort med Pipettera, var noga med att inte störa pelleten/grumlig lager som detta kommer att kontaminera bråket. Pipettera lösliga fraktionen i ”lösliga” märkt tube. Hålla på is.
- Tvätta pelleten med 500 μl lyseringsbuffert (x2) och centrifugera vid 4 ° C vid 15 000 x g i 5 min efter varje tvätta; Det är okej om några av lagrets grumlig är pipetteras.
- Efter sista tvätta, ta bort alla kvarvarande tvättbuffert lämnar endast vävnad pelleten.
Obs: Från denna punkt, olösliga prover bör nu förvaras i rumstemperatur. - Återsuspendera pelleten med X-μl lyseringsbuffert kompletteras med 4% SDS (volymen kan justeras beroende på pellet storlek, se tabell 1).
- Sonikera varje prov för 30 s vid rumstemperatur med en sond någon sonikator (125 watt, 20 kHz, puls, amplitud 40%, se Tabell för material).
- Koka prover (rullande koka) i 30 min; Centrifugera kort (15 s) vid 6 000 x g att inte förlora något urval.
- Utföra DC (tvättmedel kompatibel) protein assay (se Tabell för material) eller Lowry protein assay att mäta proteinkoncentration (rekommenderas började utspädningar av 1/5 av provet i respektive lyseringsbuffert för cellodling och 1/10 för vävnad lysates).
Obs: Protein koncentrationer måste läsas med en DC eller Lowry analysen på grund av hög tvättmedel koncentration. - Alikvotens prover i 50 µL batchar att undvika problem med frysning-tining.
Obs: Protokoll kan pausas här före ytterligare biokemisk analys genom att lagra båda fraktioner vid-20 ° C.
3. Western Blot och kvantifiering
- Utföra western blotting som rapporterats någon annanstans1,13 genom att späda 30 µg av prov 1:1 i lastning buffert (1,6 x laddar dye, 1 x minska).
Obs: 30 µg protein per fraktion är tillräcklig, men kan justeras för optimal upplösning. 3 - 8% Tris-acetat poly-akrylamid geler bör användas för de olösliga bråkdel. 4 - 12% bis-Tris geler rekommenderas för den lösliga fraktionen. - Koka prover (rullande koka) för 5 min. Centrifugera kort (15 s) vid 6 000 x g att samla in provet.
- Analysera fraktioner av SDS-PAGE och western blot, enligt tillverkarens protokollet för reducerade prover.
Obs: Olösliga bråkdel löser bäst när överförs till 0,45 µM nitrocellulosa membran. 0,45 eller 0,2 µM nitrocellulosa kan användas för den lösliga fraktionen, beroende på storleken på proteinet av intresse. Vissa optimering kan krävas för bästa överföring av HMW material. - Fläcken membran med hela protein fläcken (t.ex., MEMcode, se Tabell för material) att visualisera protein lastning effektivitet.
Obs: Western blotting kan analyseras av genomsnittlig pixel intensitet. Lösliga fraktioner kan normaliseras till ett städning protein bästa lämpade för experimentella system. Olösliga bråktal som relativa protein överflöd har verifierats med reversibel protein färgning eller Histon 3 normalisering på separata blot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resolution av lösliga och olösliga cell lysates efter fraktionering kan upptäckas med hjälp av västra analys och filter utvecklingsstörning analyser (figur 2). Som ett exempel, HEK293T celler var transfekterade med transfection reagens (t.ex., lipofectamine 2000), med HTT exon 1 kodning cDNA som innehåller 97 glutamin upprepar15 följt av regionen poly proline rika och dessa celler tilläts Express för 44 h. celler behandlades med antingen 5 µM MG132 blockera proteasom eller DMSO som kontroll för 18 h före skörd och lyserat som beskrivs ovan. Efter fraktionering protokoll löser mutant HTT exon 1 som en löslig monomer cirka 45 kDa på 4-12% gel, Bis-Tris sida och som en HMW olösliga ackumulerade art på 3-8% Tris-acetat sida geler (figur 2A). Lösliga monomerer kan kvantifieras och normaliserade till ett protein som städning (visas här som GAPDH). HMW, olösliga mHTT kvantifieras som relativa protein överflöd av genomsnittlig pixel intensitet. När de behandlades med hämmaren MG132, finns det en märkbar minskning av lösliga monomer av mHTT tillsammans med en motsvarande ökning HMW, olösliga mHTT.
Olösliga fraktioner kan analyseras med ytterligare metoder såsom en Filter utvecklingsstörning analysen att lösa olösliga, fibrillar mHTT16 (figur 2B). HeLa celler var likaså transfekterade som ovan med 97Q-HTT exon 1, och hans-SUMO-1 eller hans-SUMO-2. Celler behandlades med antingen DMSO eller MG132 för 18 h innan fraktionering och analyseras med western blot och filter utvecklingsstörning analyser. Data visar att förekomsten av överuttryckt SUMO isoform ökar både HMW och fibrillary olösliga mHTT. Tillägg av MG132 förvärrar ökningen av olösliga mHTT arter. HWM mHTT arter kan också anpassas av överuttryck eller minskning av målet sjukdom HD, PIAS1 i både HeLa celler13 och mus striata1 (figur 2 c-D). Nedslagning av PIAS1 i de snabbt progredierande musmodellen av HD, den R6/2, med hjälp av viral leverans av en siRNA mot PIAS1, minskar ansamling av HMW olösliga mHTT. Viral överuttryck av PIAS1 i R6/2 möss leder till en märkbar ökning HMW olösliga mHTT (figur 2D)1. Förändringen i löslighet mellan fraktioner är kvantifierbara och anger att detta protokoll kan spåra modulering av patogena muterade proteinet arter, vilket gör detta till en lämplig teknik för pre-kliniska biokemiska bedömningar av sjukdom ingripande. Förändringar i olösliga, fibrillar arter av mHTT också fånga flux mellan protein arter som moduleras av behandling med MG132 eller reglering av potentiella terapeutiska mål, såsom PIAS11.
Figur 1: lösliga/svårlösliga fraktionering protokoll och protein upplösning. (A) visuella pipeline för fraktionering protokoll. Protokollet beskrivs här kan tillämpas på mus vävnads- eller kultur prover men är lämplig för anpassning till andra provtyper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa resultat för lösliga och olösliga fractionations och analyser. (A) lösliga och olösliga fraktioner från HEK293T cell lysates löst på en 4-12% Bis-Tris och 3-8% Tris-acetat sida geler, respektfullt. Lösliga fraktionen normaliserade till GAPDH lastning kontroll visar variation av mHTT exon 1 lösliga monomer baserat på exponering för MG132. Olösliga bråkdel visar att HMW ackumulerade arter av mHTT också moduleras av MG132 behandling. (B) analys av lösliga och olösliga fraktioner från HeLa cellen lysates med western blot och filter utvecklingsstörning analyser: HeLa cells var transfekterade med hans-SUMO-1 eller SUMO-2 och/eller 97Q-HTT exon 1 och behandlades med 5 µM MG132 för 18 hr.* (C) Lösliga och olösliga fraktionering från HeLa cells överuttryck av 97Q-HTT exon 1 och antingen PIAS1 i ökad utsträckning eller behandlas med en siRNA mot PIAS1 Visa reglering av HMW mHTT ackumulering efter modulera en potentiella terapeutiska target.* (D) Olösliga fraktioner från mus striata behandlas med mikroRNA mot PIAS1 och löst på 3-8% Tris-acetat sida geler Visa modulering av HWM olösliga mHTT **. Paneler (B-C) har ändrats med tillstånd13. Panelen (D) har modifierats med tillstånd1. * Utdrag ur O'Rourke et al. 13 med behörighet. ** omtryckt från Ochaba et al. 1 med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Vävnad (per halvklotet) | Ungefärlig vikt (mg) | Volym lösliga (µL) | Volym olösliga (µL) |
| mus Striatum | 30 | 250 | 150 |
| mus Cortex | 100 | 500 | 250 |
| mus Hippocampus | 30 | 250 | 150 |
| mus lillhjärnan | 40 | 250 | 150 |
| mus Skeletal muscle * | 100 | 300 | 150 |
| mus lever (LOB) | 100 | 400 | 200 |
| * bindväv bildar mjölkaktig gränssnitt; ta bort för att undvika kontaminering | |||
Tabell 1: föreslog volymer (X) för vävnadsspecifika fraktionering för både lösliga och olösliga lysis buffertar. Olösliga lysis buffert volym baserat på utgångsbeloppet av material, som kan justeras med detta baserat på olösliga pelleten storleken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vissa försiktighetsåtgärder krävs för ovanstående protokoll att säkerställa konsekvent och kvantitativa resultat. Första mHTT i båda fraktioner spontant bildar aggregat över tid på flera frysa tö cykler, särskilt när du är i en hög koncentration. Det är således viktigt att frysa alikvoter av de protein-preps, och Tina endast den behövs volymen innan du kör analysen som beskrivs i protokollet ovan. Ytterligare, om olösliga bråkdel ger vita fällningsmedel vid upptining, beredning kan vara nödvändigt med en ytterligare 5 s ultraljudsbehandling puls och 5 min koka nytt kvantitering före analys via biokemiska analyser.
Kvantitativa upplösning för denna analys är möjligt genom att normalisera genomsnittlig pixel intensitet av lösliga fraktionen med en lastning kontroll eller städning genen inom varje prov. Såsom visas här, användes GAPDH som en städning gen för den lösliga fraktionen som det huvudsakligen lokaliserar till cytosolen (figur 1). Andra vanliga städning proteiner är aktin, α-tubulin och Erk 1/2. Dock bör lämplig normalisering proteiner optimeras för systemet som studeras för att säkerställa steady-state uttryck för korrekt och uninfluenced normalisering. Medan andelen olöslig fungerar som en rå nukleära bråkdel som ses av förekomsten av Histon 3 och brist på GAPDH1, används upplösning på 3-8% sida geler gränser upptäcktsrisken till vanligen nukleära markörer. Därför, den olösliga fraktionen är lämplig för kvantifiering genom att använda raw intensitet signalvärdet som en relativ representation av protein överflöd. Dock hela protein markörer, såsom reversibel proteinfläckar, används till kontroll för variationer i protein lastning och kan anpassas som en normalisering faktor för olösliga bråkdel.
Dessutom, medan fraktionering ger en möjlighet att lösa olösliga och lösliga mHTT arter, genomgår mHTT ett flertal konfirmerande förändringar i hela sjukdomspatogenes, av vilka några inte kan distinguishable i olösliga fraktionen. Dessutom kan vissa konformationer bidra fördelaktigt mot sjukdom resultatet och fungera som stabil clearance intermediärer. Det är därför viktigt att identifiera andra mHTT konformationer som korrelerar med utfall för patogenes. Vissa optimering kan vara nödvändigt att visualisera andra mHTT intermediärer. För att åtgärda detta, kan SDS procentandel ökas till 20% om sammanlagt är resistenta mot lägre koncentrationer.
Detta protokoll visar protein fraktionering villkor och resulterande analyser att upptäcker olika konformationer och fragment av mHTT ackumulation och aggregation i både cellkultur och en transgen musmodell av HD. Denna typ av biokemiska protein isolering är tänkt för bedömning av sjukdomsutvecklingen hos andra HD-modeller och kan bidra till den växande förståelsen av mHTT dynamik inom cellen och deras inverkan på sjukdomen patologi.
Efter fraktionering, kan prover bearbetas på många olika sätt. SDS-PAGE följt av western blot analys löser lösliga och olösliga mHTT arter för att ge en relativ bedömning om nivåer av mHTT arter1. Det är också möjligt att utvärdera fraktioner i ytterligare biokemiska analyser att ytterligare bedöma mHTT arter. Exempelvis kan agaros gel-elektrofores (år) lösa och upptäcka lösliga, Oligomera mHTT, medan en filter utvecklingsstörning (FR) analys är ett kraftfullt verktyg att upptäcka olösliga, fibrillary mHTT arter16,17.
En ytterligare fördel som denna analys presenteras är bedömningen av protein mislocalization associerade med patogenes. Som vi visat i 18, tillåter fraktionering protokollet visualisering och spårning av proteiner såsom Rangap1, som verkar vara binds av stora olösliga aggregat och kan inte lösa på en standard sida-gel. Dessutom som denna analys fungerar också som en rå kärn/cytoplasma separation, kan en också mäta mislocalization proteiner, t.ex., p65, i HD mus modeller1.
En framstående motivation för analys av mHTT aggregation och ackumulering är utvecklingen av nya HD diagnostik och therapeutics. Föreningar som hämmar eller omvänd mHTT aggregation har identifierats från hög genomströmning skärmar och målinriktade tester1,12,19,20,21. Men har med tanke på svårigheterna att lösa många av formerna av mHTT, utvärdering av aggregation modulering inte alltid varit möjligt. Traditionella lysis metoder kan avyttra pelleterat cellulära skräp som potentiellt innehåller olösliga sammanlagda protein eller Lys buffertar kan inte innehålla tillräckligt rengöringsmedel för lösbarhet. Den metod som beskrivs här ger en plattform för att isolera och identifiera aggregerad form av mHTT som kan användas som en biokemisk markör i cell baserat eller prekliniska i vivo bedömningar.
De analyser som beskrivs här kan tillämpas på andra felveckning proteiner. På grund av den dynamiska funktionen av felveckning proteiner, kan dessa analyser vara effektivt tillsammans med andra analyser att avslöja djupgående mekanismer av protein homeostas och aggregering. Dessa analyser inkluderar mäta steady-state nivåerna av ballast och deras partitioner i olika cell fraktioner (figur 1) eller analys av protein vikning/aggregering med renat rekombinanta proteiner. Dessa analyser hjälper till att skilja direkta eller indirekta effekter av genetiska eller farmakologisk modulering på proteinnedbrytning eller aggregering. Bygger på tidigare in vitro- a-synuclein fractionated aggregering bedömningar22, har vi sedan dess tillämpat detta arbete till Parkinsons sjukdom musmodeller att lösa olika konformationer av a-synuclein23. Därför protokoll som beskrivs i detta arbete kan tillämpas på andra modeller av protein Skellefteåsjukan och aggregering och kan bidra till upptäckt och utveckling av nya therapeutics inriktning aggregerade proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH (RO1-NS090390). Vi vill också tacka Dr Joan Steffanfor tekniskt bistånd och diskussion under utvecklingen av denna analys.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
References
- Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
- La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
- Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
- Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
- Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
- Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
- Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
- Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
- Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
- Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
- O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
- Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
- Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
- Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
- Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
- Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
- Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).
