Summary
不溶解性および溶ける変異ハンチンチン種マウス脳と細胞培養からの分別の方法を説明します。記載されているメソッドは、特性評価および huntingtin 蛋白質フラックスと病気の発症と摂動存在下での蛋白質の恒常性の分析にエイズの定量化の便利
Abstract
誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積は、ハンティントン病 (HD) および他の多くの神経変性疾患の中心です。具体的には、HD の病理学的特徴は高分子量複合体に突然変異体の HTT (mHTT) 蛋白の異常な蓄積、断片および他の蛋白質の細胞内封入体が構成されます。測定および蛍光顕微鏡、西部のしみの分析、フィルターなどの mHTT を含む集計の様々 な形の貢献を理解する従来の方法は、アッセイをトラップします。
ただし、これらのメソッドのほとんどは、特定の構造、したがって mHTT タンパク質フラックス集計溶解度と解像度の複雑な性質のための完全な状態を解決できません。
集計 mHTT の変更されたフォームと複合体の様々 な識別、分離、細胞凝集体とフラグメントの可溶化は必須です。ここで分離し、可溶性 mHTT、モノマー、オリゴマー、フラグメントを視覚化する手法について述べるし、不溶性の高分子量分画法蓄積 mHTT 種。HMW mHTT を追跡、病気の進行とマウス動作の読み出しに対応し、有益ある特定の治療上の介在の1によって調整されています。この方法は、マウスの脳、末梢の組織および細胞培養で使用できるが他のモデル システムや疾患のコンテキストに適応することがあります。
Introduction
適切な折りたたみをするタンパク質品質管理ネットワークの中断、細胞蛋白質の低下はアルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、ハンチントン病 (HD)、病理学に可能性が高い中央および他の「タンパク」2,3 を障害します。プロテオステイシス ネットワーク コンポーネントおよび病理学への貢献の詳細な理解したがって改善の治療上の介在を開発することが重要です。HD は polyglutamines (polyQ) (HTT) huntingtin 蛋白質4での拡張されたストレッチの結果 HD 遺伝子内の CAG リピートの異常な拡張によって引き起こされます。HD 発症の一貫した病理学的機能、蓄積、および正常細胞の恒常性と機能にいくつかの方法で干渉する示されている HTT 脳の地域および末梢組織での集計は、結果として得られる折りたたみとして、します。5,6。 中の HTT は普遍的表現、線条体中とげだらけニューロンは、選択的に脆弱性が存在と影響を受ける最もあからさま HD 病因にも関連付けられている注目すべき皮質萎縮。
脳内 HD 患者と動物モデルの HTT の集合体の形成は通常病気の進行とドミナント ネガティブ益 mHTT7の関数のプロキシ マーカーを務めています。どのタンパク質の折りたたみと集約に貢献するかもしれない mHTT 誘発毒性正確なメカニズムは不明と様々 な動物モデルの HD 患者の頭脳のこれらの介在物の生成は、不変、必然的な機能です。介在物表示を蓄積した HTT 断片を N 末端の主構成するその分解を示す polyQ を拡大し、9 8,をスプライシングの代替と同様、フルレングスの HTT の処理再生ことがあります、HTT ビジュアルエフェクト N 末端フラグメントの病因に重要な役割は、急速に集計することができます、核と加速や集計プロセス10を伝達する HTT の病理学的フォームを構成するかもしれない。
ただし、これらの介在物の存在では、HTT による毒性や細胞死11と必ずしも関連しません。HTT は不溶性の集計および介在物12に可溶性オリゴマー種と β シート線維を通じて水溶性モノマーから集計プロセスを経るに提案されています。標準生化学的アッセイを介してこれらの様々 な蛋白質種を解決する低洗剤換散バッファーで安定性と標準的な生化学的アッセイを使用して可視化の難しさのためフィールドで課題となっています。したがって、方法論的考察、程度や蓄積・集計 mHTT のパターンを検出するに重要です。
ここで提示されたプロトコルは HTT は、具体的に HD 病因と病気進行1,13 と密接に追跡するために表示される不溶性の HMW HTT 種の形成のいくつかの中間を可視化するメソッドを提供します。、14。解決および mHTT の複数の種を追跡することは、研究者に病因を研究し、変調して病気の発症に影響を与える潜在的な治療上の介在を評価する生化学的なツールを提供します。
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Protocol
動物の倫理の声明 - 実験が実施されたケアと健康の国民の協会および制度的動物ケアおよび使用委員会 (承認された動物の研究プロトコルの実験動物の使用のためのガイドに従い、IACUC) カリフォルニア大学アーバイン校、AAALAC 認定機関。すべての努力は、動物の苦痛を最小限に抑えるために行われました。
1. 換散バッファーの準備
- 「水溶性」の換散バッファーの準備 (10 mM Tris pH 7.4 では、1 %x トリトン 100、150 mM の NaCl、10% グリセロール) と 0.22 μ m のフィルターを通して無菌フィルター。
- 作業「可溶性」換散バッファーの N-エチルマレイミド (NEM) を測定し、100% に溶解し 100 mM phenylmethysulfonyl フッ (PMSF) で十分に溶かして江藤。
注: 換散バッファー阻害剤: (i) 20 mM N-エチルマレイミド (NEM);(ii) 0.2 mM PMSF;(iii) 1 mM バナジン ナトリウム (Na3VO4);(iv) 1 μ G/ml leupeptin;(v) 1 μ G/ml アプロチニン;(vi) 20 mM フッ化ナトリウム (NaF)。
注意: は、プロトコル全体 NEM を操作するときに、マスクを着用します。換散バッファーの作業行う必要がありますアクティブな阻害剤を確保するため新鮮です。 - プロテアーゼ阻害剤と水溶性の換散バッファーの次の順序で阻害剤を追加: Leupeptin、アプロチニン、バナジン ナトリウム (Na3VO4) 冷たい換散バッファーのボリュームまでフッ化ナトリウム (NaF)。
- 作業「可溶性」換散バッファーの N-エチルマレイミド (NEM) を測定し、100% に溶解し 100 mM phenylmethysulfonyl フッ (PMSF) で十分に溶かして江藤。
- 「不溶性」の換散バッファーの「水溶性」換散バッファーの 2 mL に 20% SDS の 500 μ l を追加することにより 4% SDS への補足します。室温に置いたまま。
注: SDS を沈殿が 4 ° C で保管するとき部屋の温度で、これをしてください。最終的な換散バッファー組成: 10 mM トリス (pH 7.4)。1% トリトン X-100;150 mM の NaCl;10% グリセロール;4 %sds (不溶性のみ)。
2. 水溶性/不溶性分別のプロトコル
注: は、回路図の図 1を参照してください。
- 各サンプルのため管の 2 つのセットのラベル:「水溶性」と「不溶性」。
- 組織に (1.1.1 参照) プロテアーゼ阻害剤を添加した冷たい作業可溶性換散バッファーの X μ L を追加します。
注: X = ボリュームによって異なります組織量;表 1を参照してください。 - マウス脳組織 (すなわち、線条体)、dounce ガラス 1 mL douncer と「不溶性」にピペットでゆっくり 30 回はチューブ (氷の上維持) をラベル付けします。
注: 気泡を形成する不完全な均質化をもたらす可能性がありますと、douncing を起動した後の液体の表面を壊さないように気をつけてください。 - 細胞 (すなわち、hela 細胞、HEK293T)、寒さ、1x PBS で 1 回細胞をすすいでください。PBS を外し、セル換散バッファーの最小ボリュームに適用し、細胞スクレーパーと。
注: の上記のセル行細胞 6 ウェル プレート当たり 5 x 10 の5セルでメッキ, 付近の confluency に成長して.1 つはよくマウス線条体に使用されるボリュームと同等です。 - 転送磨砕液や細胞ライセートにラベル「不溶性」チューブと氷 1 h (開始クロック最終管が処理された後) に溶解します。
注: セル lysates のカップ培養を開始する前に細胞塊を破るために数回を刻んだ。気泡の形成を避けるため。簡単に渦パルス 1 の各サンプル溶解の途中で s。 - 20 分間 15,000 × g で 4 ° C でサンプルを遠心します。
- 「水溶性」分数として清を回復します。
- ピペットを使用して削除、これは分数を汚染するとペレット/曇りの層を邪魔しないように注意してください。「水溶性」にピペットで移しなさい可溶性画分は、チューブをラベル付けします。氷の上を保ちます。
- 各洗浄後 5 分 15,000 × g で 4 ° C で 500 μ L の換散バッファー (x2) と遠心分離機でペレットを洗浄します。オフ戻曇り層の一部が場合、それは大丈夫です。
- 最終的な洗浄の後組織ペレットだけを残して残りの洗浄バッファーのすべてを削除します。
注意: このポイントから、不溶性サンプルは必要があります常温保管今。 - X μ L 換散バッファー 4 %sds を添加したペレットを再懸濁します (ペレット サイズに応じて音量を調整することができます;テーブル 1を参照)。
- 30 の各サンプルを超音波プローブ超音波発生装置で室温で s (125 ワット、20 kHz、パルス、振幅 40%、材料表を参照してください)。
- サンプル (沸騰ローリング) を煮る 30 分;簡単に遠心分離機 (15 s) 任意のサンプルを失わないよう 6,000 x g で。
- DC (互換性のある洗剤) 蛋白質の試金の実行 (材料の表を参照してください) または Lowry 蛋白質の試金 (細胞培養用それぞれの換散バッファーのサンプルの 1/5、1/10 組織溶解液のための開始の希釈を推奨) タンパク質の濃度を測定します。
注: タンパク質の濃度は、高濃縮のための DC またはロウリー アッセイを使用して読み取る必要があります。 - 凍結融解の問題を避けるために 50 μ L バッチに割り切れるサンプル。
注: プロトコルを一時停止できるここでさらに生化学分析の前に-20 ° C で両方の分数を格納することによって
3 西部のしみと定量化
- 実行報告として西部のしみ他1,13サンプル バッファー (ローディングの染料、削減 x 1 x 1.6) で 1:1 の 30 μ g 希釈します。
注: 分数あたり蛋白質の 30 μ g 十分、しかし最適解像度に調整することができます。3-8% トリス酢酸ポリアクリルアミドゲル不溶性画分を使用してください。4-12% ビス トリス ゲルは可溶性画分に適しています。 - 簡単に 5 分遠心分離機のサンプル (沸騰) を沸騰 (15 s) サンプルを収集するために 6,000 x g で。
- 減らされたサンプルの製造元のプロトコルに従って SDS-PAGE および西部のしみ、分数を分析します。
注: 不溶性画分を 0.45 μ M 硝酸セルロースの膜に転送されたとき最もよい解決します。0.45 または 0.2 μ M 硝酸セルロースは興味の蛋白質のサイズによって可溶性画分に使用できます。高分子材料の最適な移転に必要ないくつかの最適化があります。 - タンパク質効率の読み込みを視覚化するタンパク質全体染色 (例えばMEMcode、参照テーブルの材料) で膜を染色します。
注: 西部のしみは、平均輝度によって分析できます。可溶性画分は、実験システムに適した家は維持蛋白質の最高に正規化することができます。相対的な蛋白質量として不溶性画分は、可逆的なタンパク質染色または別のしみにヒストン 3 正規化によって確認されました。
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Representative Results
水溶性と不溶性のセル lysates 分別を次の解像度は、ウエスタン解析とフィルター障害アッセイ (図 2) を使用して検出できます。例として HEK293T 細胞のトランスフェクション試薬 (例えば、lipofectamine 2000) を使用してを導入させた、HTT エクソン 1 エンコード cDNA 97 グルタミンを含む繰り返し15ポリ プロリンの豊富な地域に続いて、これらの細胞を許されました。特急 44 h. 細胞のいずれかの 5 μ m プロテアソームをブロックする MG132 または 18 収穫前に h ととして分離するためのコントロールとして DMSO 上記。分別のプロトコルに従い変異 HTT エクソン 1 水溶性モノマーとして約 45 kDa Bis トリス ページ ゲル 4-12%、3 ~ 8% トリス酢酸ページのゲル (図 2 a) の HMW の不溶性蓄積された種を解決します。水溶性モノマーを定量化し、家は維持蛋白質に正規化 (示す GAPDH として)。HMW、不溶性 mHTT は、相対的な蛋白質量として平均輝度によって定量化されます。MG132 阻害剤で治療、HMW、不溶性 mHTT の対応する増加と共に mHTT の水溶性モノマーの顕著な減少があります。
不溶性画分は、不溶性、維 mHTT16 (図 2 b) を解決するフィルター遅滞試金など追加の手法によって分析できます。97Q HTT エクソン 1、相撲 1 彼または彼相撲 2、HeLa 細胞は上記のように導入同様にさせた。セル分別に 18 h の DMSO と MG132 扱われた西部のしみとフィルター遅滞試金を使用して分析.データは、発現相撲アイソ フォームの存在が分画法と線維性不溶性 mHTT の両方を高めることを示しています。MG132 の添加は、不溶性の mHTT 種の増加を悪化させます。HWM mHTT の種は、過剰発現または HD 疾患ターゲット両方 HeLa 細胞13とマウス症1 (図 2D) PIAS1 の削減によっても調整することができます。HD、R6/2 PIAS1、に対する siRNA のウイルスの配信を使用しての急速な進化のマウスモデルで PIAS1 のノックダウンは、HMW 不溶性 mHTT の蓄積を軽減します。R6/2 マウス PIAS1 のウイルスの過剰発現は、HMW 不溶性 mHTT (図 2 D)1の顕著な増加に します。分数の間の溶解度の変化は、定量化は、このプロトコルがこの病気の介入の臨床生化学的評価に適した手法を作る病原性突然変異体蛋白質種の変調を追跡できますを示します。不溶性の変化、mHTT の維種もフラックスは MG132 による治療または PIAS11などの潜在的な治療上のターゲットの調節によって調節蛋白質種をキャプチャします。
図 1: 可溶性/不溶性分画のプロトコルおよび蛋白質の解像度。(A) 分別のプロトコルのための視覚的パイプライン。ここで説明したプロトコル マウス ティッシュか細胞培養サンプルに適用することができますが、他のサンプル タイプへの適応に適しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 代表結果水溶性・不溶性分別と分析。4-12% の Bis トリス、3 ~ 8% トリス酢酸ページ ゲル上で丁重に解決 HEK293T セル lysates から (A) 水溶性及び不溶性画分GAPDH のコントロールを読み込むに正規化された可溶性画分は、MG132 への露出に基づく mHTT エクソン 1 水溶性モノマーの変動を示しています。不溶性画分は、HMW mHTT の蓄積された種は MG132 処理による変調もことを示しています。西部のしみとフィルター遅延解析を用いた HeLa 細胞ライセートから水溶性と不溶性分画の (B) 解析: 97Q HTT や相撲 2 彼相撲 1 エクソン 1 の 5 μ m 処理 HeLa 細胞の 18 hr.* (C) MG13297Q HTT エキソン 1 とどちらかを過剰発現 HeLa 細胞から水溶性と不溶性分画 PIAS1 の過剰発現または後潜在的な治療 target.* (D) を変調コムギグルテニンサブ mHTT 蓄積の PIAS1 ショー規制に対する siRNA で処理マウス症から不溶性画分は PIAS1 に対してマイクロ Rna と扱われ、3-8% トリス酢酸ページ ゲルを変調の HWM 不溶性 mHTT * * で解決。パネル (B ・ C) は、許可13に変更されています。パネル (D) は、権限1に変更されています。* ・ オルークらからの転載。アクセス許可と13 * * Ochabaらから転載1エルゼビアから権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 組織 (大脳半球) | おおよその重量 (mg) | ボリューム可溶性 (μ L) | ボリューム不溶性 (μ L) |
| マウス線条体 | 30 | 250 | 150 |
| マウス皮質 | 100 | 500 | 250 |
| マウス海馬 | 30 | 250 | 150 |
| マウス小脳 | 40 | 250 | 150 |
| マウス骨格筋 * | 100 | 300 | 150 |
| マウス肝臓 (葉) | 100 | 400 | 200 |
| * 結合組織を形成する乳白色のインターフェイス;汚染を避けるために削除します。 | |||
表 1: 両方の水溶性と不溶性の換散バッファーの組織固有の分別のボリューム (X) を提案した.不溶性のペレットのサイズに応じて調整することができます材料の量を開始に基づく不溶性の換散バッファーのボリューム。
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Discussion
定量的な一貫性のある結果を確保するため上記のプロトコルのいくつかの対策が必要です。両方分数で mHTT が複数の凍結融解時に時間をかけて集計を自発的に形成するまず、特に高濃度で。したがって、タンパク質プレップの因数を凍結し、上記のプロトコルで説明されているように分析を実行する前に必要な量のみを解凍するが重要です。さらに、不溶性画分利回り融解時に白い鉛塩法は、再構成は追加 5 s 超音波パルス、5 分沸騰させると、再定量生化学的アッセイによる解析する前に、必要にあります。
この試金のため定量的な解像度は、読み込みコントロールまたは各サンプル内の家は維持遺伝子の可溶性画分の平均輝度を正規化することで達成可能です。下図のように、GAPDH として使用された家は維持遺伝子可溶性画分のそれは主に細胞質 (図 1) に局在するよう。他の一般的に使用される家は維持蛋白質は、アクチン、α-チューブリンと Erk 1/2 です。ただし、適切な正規化蛋白質は左右されない正確な正規化の定常状態式を確保するために検討されているシステムの最適化必要があります。不溶性画分を原油の核分画として提供していますようにヒストン 3 の存在と GAPDH1の欠如によって、ページのゲルに限界検出一般的 3-8% の解決は核マーカーを使用しました。したがって、不溶性画分は、蛋白質量の相対的な表現として生信号強度値を用いた定量化に適しています。ただし、可逆的なタンパク質汚れなどの全体蛋白質のマーカーは読み込みタンパク質の変化のコントロールに使用され、不溶性画分の正規化係数として適応されることがあります。
さらに、分別、不溶解性および溶ける mHTT の種を解決する手段が、mHTT は病気の発症、いくつかの不溶性画分に区別されません全体で多数の構造変化を経る。さらに、いくつかの立体構造が病気の結果に有益に貢献し、安定したクリアランス中間体として機能します。したがって、病態の結果と相関関係がある他の mHTT コンフォーマを識別するために重要です。いくつかの最適化その他 mHTT の中間体を可視化する必要があります。これに対処するためは、SDS の割合を 20% 増やすことが集計が濃度を低下させる抵抗力がある場合。
このプロトコルは、タンパク質分画条件と結果のアッセイの培養細胞およびトランスジェニック マウス モデルの hd の mHTT の蓄積と集計の断片と様々 なを検出するを示します。この種の生化学的タンパク質分離他の HD モデルで病気の進行の評価の想定し、セルと病に与える影響の中で mHTT 原動力の成長の理解に貢献するかもしれない。
分別後のサンプルは、さまざまな方法で処理できます。西部のしみの分析に続いて SDS-PAGE mHTT 種1のレベルの相対的な評価を提供するために水溶性と不溶性の mHTT 種が解決されます。また、mHTT の種をさらに評価するために生化学的な試金追加分数を評価することが可能です。例えば、アガロース電気泳動 (歳) は解決し、フィルター遅滞 (FR) 試金不溶解性、線維性の mHTT 種16,17を検出する強力なツールですが、水溶性、オリゴマーの mHTT を検出できます。
この試金、付加的な利点は、病因に関連付けられているタンパク質のサッカード定位誤りの評価です。ここで18に示したようこの分別のプロトコルにより可視化と大きな不溶性凝集によって隔離するのに表示されます、標準ページのゲルでは解決されない場合があります Rangap1 のような蛋白質の追跡できます。さらに、このアッセイは、原油の核/細胞質分離としても使用、としては蛋白質、例えば、HD マウス モデル1の p65 のサッカード定位誤りもゲージ 1 つ。
MHTT の集約と蓄積の解析の著名な動機は、新規の HD の診断と治療法の開発です。MHTT 集計に戻したりを阻害する化合物は、高スループットの画面とターゲットを絞ったテスト1,12,19,20,21から識別されています。ただし、mHTT の形態の解決の難しさを考えると、集計変調の評価常にされていない可能です。不溶性の総蛋白質が含まれる可能性小球形にされた細胞の残骸の処分することが伝統的な換散方法や換散バッファーは十分な洗剤の可溶化を含めることはできません。ここで説明する方法は、分離とセルベースや体内の前臨床評価における生化学的マーカーとして使用することができます mHTT の集合的な形態を検出するためのプラットフォームを提供します。
ここで説明アッセイは、他のタンパク質に適用できます。誤って折りたたまれたタンパク質の動的機能によりこれらのアッセイに蛋白質の恒常性と集計の詳細なメカニズムを明らかにする他の解析を効果的に結合できます。これらの解析は、定常状態レベルの集計と異なる細胞画分 (図 1) でパーティションまたは集約の解析蛋白質折りたたみ/精製組換え蛋白質を用いた測定を含めます。これらのアッセイは、タンパク質分解または集計の遺伝的または薬理学的変調の直接または間接効果を区別するのに役立ちます。建物は以前の in vitroシヌクレイン、分別集計評価22、以来行ったこの仕事シヌクレインは23の様々 な構造を解決するパーキンソン病マウスモデルを作製する.したがって、この作業で説明されているプロトコルはタンパクと集計の他のモデルに適用することがあります、発見と集約された蛋白質をターゲットと新しい治療法の開発に貢献するかもしれない。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、NIH (RO1 NS090390) によって支えられました。博士ジョアン Steffanfor 技術支援とこの試金の開発の間に議論に感謝も申し上げます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
References
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