Summary
En metode er beskrevet til fraktionering af uopløselige og opløselige mutant huntingtin arter fra mus hjernen og celle kultur. Den beskrevne metode er nyttig til karakterisering og kvantificering af huntingtin protein flux og aids i at analysere protein homøostase i sygdom patogenese og perturbationer
Abstract
Ophobning af fejlfoldede proteiner er central for patologi i Huntington's chorea (HD) og mange andre neurodegenerative lidelser. Specifikt, en patologisk nøglefunktionerne i HD er afvigende ophobning af mutante HTT (mHTT) protein i høj molekylvægt komplekser og intracellulære optagelse organer består af fragmenter og andre proteiner. Konventionelle metoder til at måle og forstå bidrag af forskellige former for mHTT-holdige aggregater indeholde Fluorescens mikroskopi, western blot analyse og filter fælde assays.
Men de fleste af disse metoder er kropsbygning specifikke, og derfor kan ikke løse den fuld tilstand af mHTT protein flux på grund af den komplekse karakter af samlede opløselighed og opløsning.
For identifikation af aggregerede mHTT og forskellige ændrede former og komplekser er adskillelse og oploesning af cellulære aggregater og fragmenter obligatorisk. Beskriver her vi en metode til at isolere og visualisere opløselige mHTT, monomerer, oligomerer, fragmenter, og en uopløselig høj molekylvægt (HMW) akkumuleret mHTT arter. HMW mHTT spor med sygdomsprogression, svarer med musen adfærd udlæsninger, og har været gavnlig moduleres af visse terapeutiske indgreb1. Denne fremgangsmåde kan kun bruges med mus hjernen, perifere væv og cellekultur men kan tilpasses andre modelsystemer eller sygdom sammenhænge.
Introduction
Afbrydelse af protein kvalitetskontrol netværk, der sikrer korrekt falsning og nedbrydning af cellulære proteiner er sandsynligvis central til patologi i Alzheimers sygdom (AD), Parkinsons sygdom (PD), Huntington's chorea (HD), og andre "protein misfoldning" lidelser2,3. En detaljeret forståelse af proteostasis netværk komponenterne og deres bidrag til patologi er derfor afgørende at udvikle forbedrede terapeutiske indgreb. HD skyldes en unormal udvidelse af en CAG-gentagelse inden for HD-genet, som resulterer i en udvidet strækning af polyglutamines (polyQ) i huntingtin (HTT) protein4. En konsekvent patologiske funktion af HD patogenesen er den resulterende misfoldning, akkumulering og sammenlægning af HTT i regioner af hjernen og i perifere væv, som har vist sig at blande sig på flere måder med normal celle homøostase og funktion 5 , 6. mens HTT udtrykkes allestedsnærværende, mellemstore spiny neuroner i striatum er selektivt sårbare og mest åbenlyst ramte med bemærkelsesværdige kortikal atrofi også forbundet med HD patogenese.
Dannelsen af aggregater af HTT i hjernen hos HS-patienter og dyremodeller har typisk serveres som en proxy markør for sygdomsprogression og dominerende-negativ forstærkning af funktion for mHTT7. Selvom de præcise mekanismer ved hvilke protein misfoldning og sammenlægning kan bidrage til mHTT-induceret toksicitet er fortsat uklart, er dannelsen af disse optagelser i hjernen af HC-patienter og forskellige dyremodeller en invariant og uundgåelige funktion. Optagelser vises at være består stort set af akkumulerede HTT fragmenter der indeholder N-terminalen udvidet polyQ, der angiver at proteolyse og forarbejdning af fuld længde HTT samt alternativ splicing8,9 kan spille en vigtig rolle i patogenesen af HD. N-terminal HTT fragmenter kan udgøre en patologisk form af HTT, der kan samle hurtigt, samme, og fremskynde eller udbrede sammenlægning proces10.
Men tilstedeværelsen af disse optagelser, ikke nødvendigvis er korrelerer med HTT-fremkaldt toksicitet eller celle død11. HTT har foreslået at gennemgå en sammenlægning proces fra en opløselig monomer gennem opløselige oligomere arter og β-plade fibriller til uopløselige aggregater og indeslutninger12. Løse disse forskellige protein arter via standard biokemiske analyser har været en udfordring i feltet på grund af deres stabilitet i lav-vaskemiddel lysisbuffer og svært ved at visualisere ved hjælp af standard biokemiske assays. Således er metodiske overvejelser kritisk i påvisning af grad og mønster af akkumulerede og samlede mHTT.
Protokollen præsenteres her er en metode til at visualisere flere mellemprodukter af HTT, specielt dannelsen af en uopløselig HMW HTT arter, der vises til nøje styr med HD patogenese og sygdom progression1,13 ,14. At være i stand til at løse og spore flere arter af mHTT giver forskere et biokemisk værktøj at studere sygdom patogenese og vurdere potentielle terapeutiske interventioner gennem deres graduering og indvirkning på sygdommen patogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animalske etik erklæring - eksperimenter blev udført i nøje overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health og en godkendt dyreforskning protokol af den institutionelle Animal Care og brug Udvalget ( IACUC) på University of California, Irvine, et AAALAC akkrediteret institution. Alle bestræbelser var at mindske dyrenes lidelser.
1. forberedelse af Lysis buffere
- Forberede "Vandopløseligt" lysisbuffer (10 mM Tris pH 7,4, 1% Triton-X 100, 150 mM NaCl, 10% glycerol) og sterile filtreres gennem 0,22 µm filter.
- For en arbejder "Vandopløseligt" lysisbuffer, måle N-Ethylmaleimide (NEM) og grundigt opløses i 100 mM phenylmethysulfonyl fluor (PMSF) opløses i 100% EtOH.
Bemærk: Lysis Buffer hæmmere: (i) 20 mM N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0,2 mM PMSF; (iii) 1 mM natrium orthovanadate (Na3VO4); (iv) 1 µg/mL leupeptin; (v) 1 µg/mL aprotinin; (vi) 20 mM natriumfluorid (NaF).
Forsigtig: Bære en ansigtsmaske, når du arbejder med NEM hele protokollen. Arbejder lysisbuffer skal gøres frisk at sikre aktiv hæmmere. - For opløselige lysisbuffer med proteasehæmmere, tilføje hæmmere i følgende rækkefølge: natriumfluorid (NaF), op til mærket med kolde lysisbuffer, natrium orthovanadate (Na3VO4), Aprotinin og Leupeptin.
- For en arbejder "Vandopløseligt" lysisbuffer, måle N-Ethylmaleimide (NEM) og grundigt opløses i 100 mM phenylmethysulfonyl fluor (PMSF) opløses i 100% EtOH.
- For "Uopløseligt" lysisbuffer supplement til 4% SDS ved at tilføje 500 µL af 20% SDS til 2 mL af "Opløseligt" lysisbuffer. Forlade ved stuetemperatur.
Bemærk: SDS vil bundfald ud når det opbevares ved 4 ° C; holde dette ved stue temp. Endelige lysisbuffer sammensætning: 10 mM Tris (pH 7,4); 1% Triton X-100; 150 mM NaCl; 10% glycerol; 4% SDS (uopløseligt kun).
2. opløselige/uopløselige fraktionering protokol
Bemærk: Se figur 1 for en skematisk.
- Label to sæt af rør til hver prøve: "Opløseligt" og "Uopløselige."
- Tilføj X-µL af iskold arbejder opløselige lysisbuffer suppleret med proteasehæmmere (Se 1.1.1) til væv.
Bemærk: X = mængde varierer afhængigt af væv beløb; Se tabel 1. - For mus hjernevæv (dvs., striatum), dounce langsomt 30 gange i glas 1 mL douncer og afpipetteres i "Uopløseligt" mærket tube (holde på is).
Bemærk: Pas på ikke at bryde overfladen af flydende efter start douncing, som boblerne vil form og kan give ufuldstændige homogenisering. - Celler (dvs., HeLa, HEK293T), skyl celler med kolde, 1 x PBS. Fjern PBS og anvende minimal mængde af lysisbuffer på celler og løft med celle skraber.
Bemærk: Ovenfor cellelinjer, celler var belagt på 5 x 105 celler pr. 6 godt plade og vokset til i nærheden af confluency. Man er godt sammenlignes med rumfang, der benyttes til musen striatum. - Overføre homogenatet eller cellen lysate i mærket, "Uopløseligt" rør og lyse på ice 1 h (Start ur efter sidste rør er behandlet).
Bemærk: For cellelysater, hakkede flere gange til at bryde op celle klumper før du starter inkubation. Undgå dannelsen af boblerne. Kort vortex puls hver prøve for 1 s halvvejs gennem lysing. - Der centrifugeres prøver ved 4 ° C ved 15.000 x g i 20 min.
- Genskab supernatanten som "Opløseligt" brøk.
- Fjerne med pipette, være omhyggelig med ikke at forstyrre pellet/overskyet lag, da dette vil forurene brøken. Med pipette overfoeres opløselige brøkdel i "Opløseligt" mærket tube. Holde på is.
- Vaske pellet med 500 µL af lysisbuffer (x2) og centrifugeres ved 4 ° C ved 15.000 x g i 5 min efter hver vask; Det er okay, hvis nogle af de overskyede lag er pipetted off.
- Efter sidste vask, fjerne alle resterende vaskebuffer forlader kun væv pellet.
Bemærk: Fra dette punkt, uopløselige prøver skal nu opbevares ved stuetemperatur. - Resuspend pellet med X-µL lysisbuffer suppleret med 4% SDS (lydstyrken kan justeres afhængigt af pellet størrelse, se tabel 1).
- Der sonikeres hver prøve for 30 s ved stuetemperatur med en sonde sonikator (125 Watts, 20 kHz, puls, Amplitude 40%, se Tabel af materialer).
- Kog prøver (rullende kog) i 30 min. Kort der centrifugeres (15 s) på 6.000 x g, ikke mister enhver prøve.
- Udføre DC (vaskemiddel kompatibel) protein assay (Se Tabel af materialer) eller Lowry protein assay at måle proteinkoncentration (anbefalet begyndte fortyndinger på 1/5 af prøven i respektive lysisbuffer for cellekultur og 1/10 for væv lysates).
Bemærk: Protein fusioner vil skulle læses ved hjælp af en DC eller Lowry assay på grund af høje vaskemiddel koncentration. - Alikvot prøver i 50 µL partier til at undgå at fryse-tø spørgsmål.
Bemærk: Protokol kan stå i pause her før yderligere biokemiske analyser ved at gemme begge fraktioner ved-20 ° C.
3. vestlige skamplet og kvantificering
- Udføre western blotting som rapporteret andetsteds1,13 ved at fortynde 30 µg af prøve 1:1 i loading bufferen (1,6 x lastning farvestof, 1 x reduktion).
Bemærk: 30 µg protein per fraktion er tilstrækkelig, men kan justeres til optimal opløsning. 3 - 8% Tris-acetat poly-acrylamid gel bør anvendes til de uopløselige brøkdel. 4 - 12% bis-Tris geler anbefales til den vandopløselige fraktion. - Kog prøver (rullende kog) i 5 min. Centrifuge kort (15 s) på 6.000 x g at indsamle prøven.
- Analysere fraktioner af SDS-PAGE og western blot, efter fabrikantens protokol for reducerede prøver.
Bemærk: Uopløselig brøkdel løser bedst, når overføres til 0,45 µM nitrocellulose membran. 0,45 eller 0,2 µM nitrocellulose kan bruges til den vandopløselige fraktion, afhængigt af størrelsen af protein af interesse. Nogle optimering kan være påkrævet for bedste overførsel af HMW materialer. - Pletten membran med hele protein pletten (f.eks.MEMcode, se Tabel af materialer) til at visualisere protein lastning effektivitet.
Bemærk: Western blotting kan analyseres af gennemsnitlig pixel intensitet. Opløselige fraktioner kan normaliseres med en hus-holder protein bedst egnet til den eksperimentelle system. Uopløselige brøk som relative protein overflod blev bekræftet af reversibel protein farvning eller Histon 3 normalisering på separate skamplet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Opløsning af opløselige og uopløselige cellelysater efter fraktionering kan påvises ved hjælp af vestlige analyse og filter retardering assays (figur 2). Som et eksempel, HEK293T celler blev transfekteret ved hjælp af Transfektion reagens (fx, lipofectamine 2000), med HTT exon 1 kodning cDNA indeholdende 97 glutamin gentager15 efterfulgt af poly prolin rig region, og disse celler fik lov til at udtrykkelig for 44 h. celler blev behandlet med enten 5 µM MG132 at blokere proteasom eller DMSO som et kontrolelement til 18 h før høst og mængden som beskrevet ovenfor. Efter fraktionering protokol løser mutante HTT exon 1 som en opløselig monomer omkring 45 kDa på 4-12% Bis-Tris side geler og som en HMW uopløselige akkumulerede arter på 3-8% Tris-acetat side geler (figur 2A). Opløselige monomer kan kvantificeres og normaliseret til et hus-holder protein (vist her som GAPDH). HMW, uopløselige mHTT er kvantificeret som relative protein overflod af gennemsnitlig pixel intensitet. Når behandlet med hæmmer MG132, er der en mærkbar nedgang i opløselige monomer af mHTT sammen med en tilsvarende stigning i HMW, uopløselige mHTT.
Uopløselige fraktioner kan analyseres af supplerende teknikker som et Filter retardering assay at løse uløseligt, fibrillar mHTT16 (figur 2B). HeLa celler blev ligeledes transfekteret som ovenfor med 97Q-HTT exon 1, og hans-SUMO-1 eller hans-SUMO-2. Celler blev behandlet med enten DMSO eller MG132 til 18 h før fraktionering og analyseret ved hjælp af vestlige skamplet og filter retardering assays. Data viser, at tilstedeværelsen af overexpressed SUMO isoform øger både HMW og fibrillære uopløselige mHTT. Tilsætning af MG132 forværrer stigning i arter, uopløselige mHTT. HWM mHTT arter kan også gradueres ved overekspression eller reduktion af HD sygdom target, PIAS1 i begge HeLa celler13 og mus striata1 (figur 2 c-D). Knockdown af PIAS1 i den hastigt fremadskridende musemodel af HD, R6/2, ved hjælp af viral levering af en siRNA mod PIAS1, reducerer ophobning af HMW uopløselige mHTT. Viral overekspression af PIAS1 i R6/2-mus fører til en bemærkelsesværdig stigning i HMW uopløselige mHTT (figur 2D)1. Ændringen i opløselighed mellem fraktioner er kvantificerbare og angiver, at denne protokol kan spore graduering af patogene mutant protein arter, hvilket gør dette til en passende teknik til præ-klinisk biokemiske vurderinger af sygdom intervention. Ændringer i uopløseligt, fibrillar arter af mHTT også fange flux mellem protein arter, der er moduleret af behandling med MG132 eller regulering af potentielle terapeutiske mål, såsom PIAS11.
Figur 1: opløselige/uopløselige fraktionering protokol og protein opløsning. (A) visuelle rørledning til fraktionering protokol. Protokollen beskrevet her kan anvendes på musen vævs- eller kultur prøver men er velegnet til tilpasning til andre prøve typer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentant resultater af opløseligt og uopløselige fractionations og analyser. (A) opløseligt og uopløseligt fraktioner fra HEK293T cellelysater løst på en 4-12% Bis-Tris og 3-8% Tris-acetat side geler, respektfuldt. Opløselige brøkdel normaliseret til GAPDH lastning kontrol viser udsving af mHTT exon 1 opløselige monomer baseret på eksponering for MG132. Uopløselige brøkdel viser, at HMW akkumulerede arter af mHTT også moduleres af MG132 behandling. (B) analyse af opløselige og uopløselige fraktioner fra HeLa cellelysater ved hjælp af vestlige skamplet og filter retardering analyser: HeLa celler blev transfekteret med hans-SUMO-1 eller SUMO-2 og/eller 97Q-HTT exon 1 og behandlet med 5 µM MG132 for 18 hr.* (C) Opløselige og uopløselige fraktionering fra HeLa celler overekspression 97Q-HTT exon 1 og enten overexpressed PIAS1 eller behandlet med en siRNA mod PIAS1 Vis regulering af HMW mHTT ophobning efter modulerende en potentiel terapeutisk target.* (D) Uopløselige fraktioner fra mus striata behandlet med mikroRNA mod PIAS1 og løst på 3-8% Tris-acetat side geler Vis modulering af HWM uopløselige mHTT **. Paneler (B-C) er blevet ændret med tilladelse13. Panel (D) er blevet ændret med tilladelse1. * Genoptrykt fra O'Rourke mfl. 13 med tilladelse. ** Genoptrykt fra Ochaba et al. 1 med tilladelse fra Elsevier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Væv (pr. halvkugle) | Omtrentlig vægt (mg) | Volumen opløselig (µL) | Volumen uopløselige (µL) |
| musen Striatum | 30 | 250 | 150 |
| musen Cortex | 100 | 500 | 250 |
| musen Hippocampus | 30 | 250 | 150 |
| musen Cerebellum | 40 | 250 | 150 |
| musen skelet muskel * | 100 | 300 | 150 |
| musen leveren (lap) | 100 | 400 | 200 |
| * bindevæv danner mælkeagtig interface; Fjern for at undgå kontaminering | |||
Tabel 1: foreslåede mængder (X) til væv-specifikke fraktionering for både opløselige og uopløselige lysis buffere. Uopløselige lysis buffer volumen baseret på begyndende mængden af materiale, som kan justeres i overensstemmelse hermed baseret på uopløselige pellet størrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nogle forholdsregler er nødvendige for de ovenstående protokoller til at sikre konsekvent og kvantitative resultater. Første mHTT i begge fraktioner spontant vil danne aggregater over tid på flere fryse tø cykler, især når de er i en høj koncentration. Det er således afgørende at fryse delprøver af protein preps, og tø kun den nødvendige mængde, inden du kører analysen, som beskrevet i ovennævnte protokol. Yderligere, hvis uopløselige brøkdel udbytter hvid fældningsmiddel efter optøning, rekonstitution kan være nødvendigt ved en yderligere 5 s sonikering puls, 5 min. Kog og re kvantitering inden analyse via biokemiske assays.
Kvantitative opløsning for denne analyse er opnåelige ved normalisering betyder pixel intensiteten af opløselige brøkdel en loading kontrol eller hus-holder gen inden for hver enkelt prøve. Som vist her, anvendtes GAPDH som et hus-holder gen for den vandopløselige fraktion som det overvejende lokaliserer til cytosol (figur 1). Andre almindeligt anvendte hus-holder proteiner er actin, α-tubulin og Erk 1/2. Dog bør velegnet normalisering proteiner optimeres til systemet ved at blive undersøgt for at sikre stabil tilstand udtryk for nøjagtig og upåvirket normalisering. Mens de uopløselige brøkdel fungerer som en rå nukleare fraktion som set af tilstedeværelsen af Histon 3 og manglende GAPDH1, anvendte opløsning på 3-8% siden geler grænser sporbarhed til almindeligt nukleare markører. De uopløselige brøkdel er derfor velegnet til kvantificering ved hjælp af rå signal intensitetsværdien som en relativ repræsentation af protein overflod. Men hele protein markører, såsom reversible protein pletter, bruges til at kontrollere for variationer i protein lastning og kan tilpasses som en normalisering faktor for uopløselig brøkdel.
Derudover mens fraktionering giver et middel til at løse uopløselige og opløselige mHTT arter, gennemgår mHTT mange konformationelle ændringer hele sygdom patogenese, hvoraf nogle ikke vil skelnes i de uopløselige brøkdel. Derudover kan nogle konformationer gavnlig bidrager sygdom resultat og fungere som stabil clearance mellemprodukter. Det er derfor vigtigt at identificere andre mHTT konformere, der korrelerer med udfald for patogenesen. Nogle optimering kan være nødvendigt at visualisere andre mHTT mellemprodukter. For at løse dette, forhøjes SDS procentsats til 20% hvis samlet er resistente over for lavere koncentrationer.
Denne protokol viser protein fraktionering betingelser og deraf følgende assays, der registrerer forskellige konformationer og fragmenter af mHTT ophobning og sammenlægning i både cellekultur og en transgene musemodel af HD. Denne type af biokemiske protein isolation er forestillede sig for vurdering af sygdomsprogression i andre HD-modeller og kan bidrage til den voksende forståelse af mHTT dynamik inden for cellen og deres indvirkning på sygdommen patologi.
Efter fraktionering, kan prøver behandles på mange måder. SDS-PAGE efterfulgt af western blot analyse vil løse opløselige og uopløselige mHTT arter for at give en relativ vurdering på niveauer af mHTT arter1. Det er også muligt at evaluere fraktioner i supplerende biokemiske assays til yderligere vurdere mHTT arter. For eksempel, kan Agarosen gelelektroforese (alder) løse og opdage opløselige, oligomere mHTT, mens en filter retardering (FR) assay er et kraftfuldt værktøj til at detektere uopløselige, fibrillære mHTT arter16,17.
En yderligere fordel i dette assay præsenterer er vurderingen af protein mislocalization tilknyttet patogenese. Som vi viste i 18, fraktionering protokollen giver mulighed for visualisering og sporing af proteiner som Rangap1, som synes at være afsondret af store uopløselige aggregater og kan ikke fortolkes på en standard side gel. Derudover som denne analyse fungerer også som en rå nukleare/cytoplasmatisk adskillelse, kan man også måle mislocalization af proteiner, fx, p65, i HD mus modeller1.
En fremtrædende motivation for analyse af mHTT sammenlægning og akkumulering er udviklingen af nye HD diagnostik og terapi. Stoffer, der hæmmer eller vende mHTT sammenlægning er blevet identificeret fra høj overførselshastighed skærme og målrettede test1,12,19,20,21. Dog har givet vanskeligheder med at løse mange af former for mHTT, evaluering af sammenlægning graduering ikke altid været muligt. Traditionelle lysis metoder kan disponere over pelleted celleaffald, der potentielt indeholder uopløselige samlede protein, eller lysis buffere kan ikke indeholde nok vaskemiddel til oploesning. Metoden beskrevet her giver en platform til isolering og afsløre en aggregeret form af mHTT, der kan bruges som biokemiske markør i celle-baserede eller prækliniske i vivo vurderinger.
Assays beskrives her kan anvendes på andre fejlfoldede proteiner. På grund af den dynamiske funktion af fejlfoldede proteiner, kan disse assays kobles effektivt med andre analyser at afdække dybdegående mekanismer af protein homøostase og sammenlægning. Disse analyser omfatter måling af steady state niveauer af aggregater og deres partitioner i forskellige celle fraktioner (figur 1) eller analyse af protein foldning/sammenlægning ved hjælp af renset rekombinante proteiner. Disse analyser vil bidrage til at skelne mellem direkte eller indirekte virkninger af genetiske eller farmakologiske graduering på protein nedbrydning eller sammenlægning. Bygger på tidligere in vitro- a-synuclein fraktioneret sammenlægning vurderinger22, har vi siden anvendt dette arbejde på Parkinsons sygdom musemodeller til at løse forskellige konformationer af en synuclein23. Derfor protokoller er beskrevet i dette arbejde kan anvendes på andre modeller af protein misfoldning og sammenlægning, og kan bidrage til opdagelse og udvikling af nye therapeutics målretning aggregerede proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH (RO1-NS090390). Vi vil også gerne takke Dr. Joan Steffanfor teknisk bistand og diskussion under udviklingen af denne analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
References
- Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
- La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
- Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
- Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
- Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
- Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
- Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
- Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
- Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
- Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
- O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
- Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
- Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
- Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
- Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
- Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
- Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).
