Summary
يتم وصف أسلوب لتجزئة الأنواع هونتينجتين متحولة قابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان من الماوس المخ والخلية والثقافة. الطريقة الموصوفة مفيدة للتوصيف والتحديد الكمي للتمويه البروتين هونتينجتين والإيدز في تحليل البروتين التوازن في منشأ المرض ووجود اضطرابات
Abstract
تراكم البروتينات تجمعات المركزية لعلم الأمراض في مرض هنتنغتون (HD) والعديد من اضطرابات الأعصاب الأخرى. على وجه التحديد، من السمات مرضية رئيسية هد الشاذة تراكم متحولة HTT (مت) البروتين في مجمعات عالية الوزن الجزيئي وداخل الخلايا إدراج هيئات مؤلفة من شظايا وغيرها من البروتينات. الأساليب التقليدية قياس وفهم وتشمل المساهمات المقدمة من مختلف أشكال المجاميع المحتوية على مت fluorescence مجهرية وتحليل لطخة غربية، وتصفية فخ فحوصات.
بيد أن معظم هذه الطرق هي تكيف محددة ولذلك قد لا تحل الدولة كامل مت البروتين التمويه نظراً للطبيعة المعقدة للذوبان الكلي والقرار.
لتحديد هوية مهتت مجمعة ومختلف أشكال معدلة والمجمعات، الانفصال و solubilization المجاميع الخلوية وشظايا إلزامي. هنا يصف لنا طريقة لعزل وتصور مهتت القابلة للذوبان، مونومرات، ليغومرات، والشظايا، وتراكم وزن الجزيئي عالية غير قابلة للذوبان (همو) الأنواع مهتت. مت حمو المسارات مع تطور المرض، يتوافق مع قراءات سلوك الماوس، وقد تم الاندماج عن طريق التضمين بعض التدخلات العلاجية1. هذا النهج يمكن استخدامها مع الماوس المخ والأنسجة المحيطية، وثقافة الخلية ولكن يمكن أن تتكيف مع نظم نموذجية أو المرض السياقات الأخرى.
Introduction
تعطيل شبكات مراقبة جودة البروتين التي تكفل طي السليم وتدهور البروتينات الخلوية هو الوسطى المرجح لعلم الأمراض في مرض الزهايمر (AD)، ومرض باركنسون (PD)، مرض هنتنغتون (HD)، والأخرى "ميسفولدينج البروتين" اضطرابات2،3. ولذلك فهم مفصل لمكونات شبكة الاتصال بروتيوستاسيس ومساهماتها في علم الأمراض تعتبر حاسمة لتطوير تحسين التدخلات العلاجية. بسبب التوسع الشاذة من تكرار كاج داخل الجينات هد نتج عنه امتداد موسعة من بوليجلوتامينيس (polyQ) في هونتينجتين (HTT) البروتين4HD. ميزة مرضية متسقة في إمراضية عالية الدقة هو ميسفولدينج الناجمة عن ذلك، التراكم، وتجميع HTT في مناطق الدماغ والأنسجة المحيطية، التي أظهرت أن تتدخل في عدة طرق التوازن الخلية الطبيعية ووظيفة 5 , 6. HTT حين يتم التعبير عن أوبيكويتوسلي، والخلايا العصبية شوكي متوسطة في المخطط انتقائية الضعيفة والمتأثرة الأكثر صراحة مع ضمور القشرية الجديرة بالذكر أيضا المرتبطة بهد المرضية.
عادة خدمت تشكيل مجاميع HTT في الدماغ للمرضى عالية الدقة ونماذج حيوانية كعلامة وكيل لتطور المرض والسلبية المهيمنة للحصول على وظيفة مت7. على الرغم من أن آليات دقيقة من البروتين التي ميسفولدينج والتجميع قد تسهم السمية التي يسببها مت لا تزال غير واضحة، تشكيل هذه الإدراجات في الدماغ المرضى عالية الدقة ومختلف نماذج حيوانية سمة ثابتة ولا مفر منه. تضمينات تظهر أن تتألف إلى حد كبير من الشظايا HTT المتراكمة التي تحتوي على N--المحطة الطرفية توسيع polyQ، مشيراً إلى أن بروتيوليسيس وتجهيز كامل طول HTT فضلا عن بديل ذو8،وقد لعب9 قد تشكل دوراً هاما في الآلية المرضية للشظايا HTT ن hd.--المحطة الطرفية شكل باثولوجي HTT التي يمكن تجميع سريعاً، نوكلياتي، والتعجيل أو نشر عملية تجميع10.
ومع ذلك، وجود هذه تضمينات لا يرتبط بالضرورة مع السمية التي يسببها HTT أو خلية الموت11. واقترح للخضوع لعملية تجميع من مركب قابل لذوبان من خلال الأنواع القابلة للذوبان أوليجوميريك وييفات β-ورقة للمجاميع غير قابلة للذوبان وتضمينات12HTT. وقد حل هذه الأنواع المختلفة من البروتين عن طريق فحوصات الكيمياء الحيوية القياسية تحديا في الميدان نظراً لاستقرارها في المخزن المؤقت لتحلل منخفضة-المنظفات وصعوبة في تصور استخدام الاختبارات البيوكيميائية القياسية. وهكذا، الاعتبارات المنهجية الحاسمة في الكشف عن درجة ونمط مت المتراكمة ومجمعة.
وينص البروتوكول على المقدمة هنا طريقة لتصور وسيطة العديد من HTT، على وجه التحديد تشكيل أنواع HTT حمو تستعصي على الحل الذي يظهر لتتبع عن كثب مع هد المرضية والأمراض التقدم1،13 ،14. التمكن من حل وتتبع الأنواع المتعددة من مت يوفر الباحثين أداة بيوكيميائية دراسة منشأ المرض وتقييم التدخلات العلاجية المحتملة عن طريق التحوير وأثر على منشأ المرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان أخلاقيات الحيوان-أجريت تجارب صارمة وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية "المعاهد الوطنية للصحة"، وبحوث حيوانية معتمدة لبروتوكول (لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية IACUC) في جامعة كاليفورنيا في إيرفين، معتمدة آآلاك المؤسسة. قدمت جميع الجهود المبذولة لتقليل معاناة الحيوانات.
1-إعداد المخازن المؤقتة لتحلل
- إعداد "القابلة للذوبان" المخزن المؤقت لتحلل (10 ملم تريس الأس الهيدروجيني 7.4، 1% تريتون العاشر 100، 150 مم كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 10 ٪) وتصفية عقيمة خلال 0.22 ميكرومتر تصفية.
- عامل "القابلة لذوبان" تحلل من المخزن المؤقت، قياس N-اثيلماليميدي (NEM) ودقة تذوب في 100 مم فينيلميثيسولفونيل الفلوريد (بمسف) المذابة في 100% EtOH.
ملاحظة: تحلل مثبطات المخزن المؤقت: (ط) 20 مم ن-اثيلماليميدي (NEM)؛ (ثانيا) 0.2 مم بمسف؛ (ثالثا) 1 مم أورثوفاناداتي الصوديوم (Na3فو4)؛ (رابعا) 1 ميكروغرام/مل ليوبيبتين؛ (ت) 1 ميكروغرام/مل أبروتينين؛ (سادسا) 20 مم فلوريد الصوديوم (NaF).
تنبيه: ارتداء قناع لوجه عند العمل مع NEM في جميع أنحاء البروتوكول. ويجب بذل العمل تحلل المخزن المؤقت الطازجة لضمان مثبطات النشطة. - تحلل القابلة للذوبان من المخزن المؤقت مع مثبطات البروتياز، إضافة مثبطات بالترتيب التالي: فلوريد الصوديوم (NaF)، ما يصل إلى حجم المخزن المؤقت لتحلل البارد، أورثوفاناداتي الصوديوم (Na3فو4) و Aprotinin وليوبيبتين.
- عامل "القابلة لذوبان" تحلل من المخزن المؤقت، قياس N-اثيلماليميدي (NEM) ودقة تذوب في 100 مم فينيلميثيسولفونيل الفلوريد (بمسف) المذابة في 100% EtOH.
- "غير قابلة للذوبان" تحلل من المخزن المؤقت، تكملة للحزب الديمقراطي الصربي 4% بإضافة 500 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 20% إلى 2 مل من المخزن المؤقت لتحلل "سولوبلي". تترك في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: الحزب الديمقراطي الصربي سوف يعجل بها عندما أبقى على 4 درجة مئوية؛ الحفاظ على هذا في غرفة درجة الحرارة. التكوين "المخزن المؤقت لتحلل" النهائي: 10 ملم تريس (درجة الحموضة 7.4)؛ 1% Triton X-100؛ 150 مم كلوريد الصوديوم؛ والغليسيرول 10%؛ SDS 4% (غير قابلة للذوبان فقط).
2. بروتوكول تجزئة الذوبان/غير قابلة للذوبان
ملاحظة: انظر الشكل 1 لتخطيطي.
- قم بتسمية مجموعتين من أنابيب لكل عينة: "سولوبلي" و "تستعصي على الحل".
- إضافة ميليلتر X المثلج المخزن المؤقت القابلة للذوبان تحلل العامل تستكمل مع مثبطات البروتياز (انظر 1.1.1) للأنسجة.
ملاحظة: X = حجم يختلف اعتماداً على كمية الأنسجة؛ انظر الجدول 1. - للماوس أنسجة المخ (أي، المخطط)، دونس المسمى ببطء 30 مرة في الزجاج 1 مل دونسير وبيبيت في "الذوبان" أنبوب (الحفاظ على الجليد).
ملاحظة: أن يكون حريصا على عدم كسر سطح السائل بعد بدء دونسينج، كما سوف تشكل فقاعات وقد تسفر عن التجانس غير مكتملة. - للخلايا (أي، هيلا، HEK293T)، شطف خلايا مرة واحدة مع الباردة، 1 x PBS. إزالة برنامج تلفزيوني وتطبيق حد أدنى حجم المخزن المؤقت لتحلل الخلايا ورفع مع مكشطة الخلية.
ملاحظة: لفوق خطوط الخلايا، خلايا مطلي في 5 × 105 خلايا كل لوح جيدا 6 ونمت بالقرب من كونفلوينسي. واحد أيضا مماثل لوحدات التخزين المستخدمة للمخطط الماوس. - نقل هوموجيناتي أو خلية في المسمى، أنابيب "قابلة للحل" وعلى الجليد ح 1 (ساعة بدء بعد معالجة أنبوب النهائي).
ملاحظة: للخلية ليساتيس، تريتوراتي عدة مرات لتفريق كتل الخلايا قبل ابتداء من الحضانة. تجنب تشكيل الفقاعات. باختصار دوامة النبض كل عينة ل 1 ثانية في منتصف الطريق من خلال ليسينج. - الطرد المركزي عينات من 4 درجة مئوية في 15,000 س ز لمدة 20 دقيقة.
- استعادة المادة طافية كجزء "سولوبلي".
- إزالة مع بيبيت، يجب الحرص على عدم تعكير طبقة بيليه/غائم كهذا سوف تلوث الكسر. كسر بيبيت القابلة للذوبان في "سولوبلي" المسمى الأنبوب. الحفاظ على الجليد.
- أغسل بيليه مع 500 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت (x2) وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 15,000 س ز لمدة 5 دقائق بعد كل غسل؛ فلا بأس إذا كان بعض طبقة غائم هو بيبيتيد قبالة.
- بعد الغسيل النهائي، قم بإزالة جميع العازلة غسيل المتبقية تاركة فقط بيليه الأنسجة.
ملاحظة: من هذه النقطة، عينات غير قابلة للذوبان ينبغي الآن أن يوضع في درجة حرارة الغرفة. - ريسوسبيند بيليه مع المخزن المؤقت لتحلل X-ميليلتر وتستكمل مع الحزب الديمقراطي الصربي 4% (يمكن ضبط حجم اعتماداً على حجم بيليه؛ انظر الجدول 1).
- Sonicate كل عينة لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة مع سونيكاتور مسبار (125 واط، 20 كيلوهرتز، النبض، السعة 40%، انظر الجدول للمواد).
- يغلي عينات (المتداول يغلي) لمدة 30 دقيقة؛ الطرد المركزي بإيجاز (15 ق) في 6,000 ز العاشر فيما يتعلق بعدم فقدان أي عينة.
- إجراء مقايسة البروتين DC (المنظفات متوافقة) (انظر الجدول للمواد) أو البروتين لوري قياس تركيز البروتين (أوصى بتخفيف بدأت من 1/5 للعينة في المخزن المؤقت لتحلل كل منهما لثقافة الخلية و 1/10 للأنسجة ليساتيس).
ملاحظة: سيكون تركيزات البروتين قراءتها باستخدام مقايسة DC أو لوري بسبب ارتفاع تركيز المنظفات. - الكوة عينات إلى 50 ميليلتر دفعات لتفادي تجميد أذاب القضايا.
ملاحظة: بروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا قبل إجراء مزيد من التحليلات الكيميائية الحيوية عن طريق تخزين الكسور سواء عند-20 درجة مئوية.
3-الغربية وصمة عار والتقدير الكمي
- إجراء البقع الغربية كما ورد في مكان آخر1،13 بتمييع ميكروغرام 30 من عينة 1:1 في تحميل المخزن المؤقت (1.6 × تحميل صبغ، 1 x الحد).
ملاحظة: 30 ميكروغرام من البروتين للكسر غير كافية، ولكن يمكن تعديلها للقرار الأمثل. 3-8% تريس-اسيتات بولي اكريلاميد الجل ينبغي أن تستخدم للكسر غير قابلة للذوبان. 4-وأوصت الجل تريس مكررا 12% للكسر القابلة للذوبان. - يغلي عينات (المتداول يغلي) لأدنى 5 أجهزة الطرد المركزي بإيجاز (15 ق) في 6,000 ز x لجمع العينة.
- تحليل الكسور جانب لطخة غربية، والحزب الديمقراطي الصربي-صفحة وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة للحصول على نماذج انخفاض.
ملاحظة: يحل أفضل عند نقلها على 0.45 ميكرومتر النيتروسليلوز الغشاء جزء غير قابل للذوبان. يمكن استخدام 0.45 أو 0.2 ميكرون النيتروسليلوز للكسر القابلة للذوبان، تبعاً لحجم بروتين الفائدة. قد تكون بعض التحسين المطلوبة لنقل أفضل المواد حمو. - وصمة عار الغشاء مع البروتين كلها وصمة عار (مثلاً، ميمكودي، انظر الجدول للمواد) لتصور البروتين تحميل الكفاءة.
ملاحظة: يمكن تحليل البقع الغربية بكثافة بكسل يعني. يمكن تطبيعها قابلة للذوبان لبروتين حفظ البيت أفضل ملاءمة للنظام التجريبي. تم التحقق من كسور غير قابلة للذوبان كوفرة البروتين النسبية تلطيخ البروتين عكسها أو تطبيع 3 هيستون على اسطوانة منفصلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن الكشف عن قرار ليساتيس الخلية القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان بعد تجزئة استخدام فحوصات تأخر التحليل وتصفية الغربية (الشكل 2). على سبيل مثال، تم transfected الخلايا HEK293T استخدام كاشف تعداء (مثلاً، ليبوفيكتاميني 2000) ومع إكسون HTT يكرر كدنا ترميز 1 يحتوي على الجلوتامين 9715 تليها منطقة بولي برولين الغنية وسمح لهذه الخلايا إلى صريحة لتعامل الخلايا 44 h. مع أما مكم 5 MG132 حظر بروتوزوم أو [دمس] كعنصر تحكم ل 18 ساعة قبل الحصاد وتفكيك كالموصوفة أعلاه. وبعد وجود البروتوكول، يحل متحولة HTT إكسون 1 كمركب قابل لذوبان كاتشين حوالي 45% 4-12 مكررا-تريس "الصفحة" والهلام والأنواع همو متراكمة غير قابلة للذوبان في الهلام تريس-خلات "الصفحة" 3-8 في المائة (الشكل 2A). مركب قابل للذوبان يمكن تحديده كمياً وتطبيع لبروتين حفظ البيت (سيظهر هنا جابده). هو كمياً حمو، مت غير قابلة للذوبان كوفرة البروتين النسبية بكثافة بكسل يعني. عندما تعامل مع مثبط MG132، هناك انخفاض ملحوظ في مركب قابل للذوبان من مهتت جنبا إلى جنب مع زيادة مقابلة في همو، مهتت غير قابلة للذوبان.
كسور غير قابلة للذوبان يمكن تحليلها باستخدام تقنيات إضافية مثل مقايسة "تصفية التخلف العقلي" لحل مهتت غير قابلة للذوبان، فيبريلار16 (الشكل 2). وبالمثل تم transfected خلايا هيلا كما هو وارد أعلاه مع إكسون 97Q HTT 1، وأما صاحب سومو-1 أو 2 سومو صاحب. تم علاج مع [دمس] أو MG132 ح 18 قبل وجود الخلايا وتحليلها باستخدام لطخة غربية وتصفية التخلف العقلي فحوصات. وتبين البيانات أن وجود overexpressed السومو isoform يزيد حمو ومت فيبريلاري غير قابلة للذوبان. إضافة MG132 تفاقم الزيادة في الأنواع مت غير قابلة للذوبان. HWM مت الأنواع يمكن أيضا أن تكون عن طريق التضمين overexpression أو الحد من هد المرض الهدف، PIAS1 في كلا هيلا الخلايا13 والماوس سترياتا1 (الشكل 2-د). ضربة قاضية ل PIAS1 في نموذج الماوس تتقدم سرعة عالية الدقة، R6/2، باستخدام إيصال الفيروسية siRNA ضد PIAS1، يقلل من تراكم حمو مت غير قابلة للذوبان. أوفيريكسبريشن الفيروسية من PIAS1 في الفئران R6/2 يؤدي إلى زيادة ملحوظة في حمو مت غير قابلة للذوبان (الشكل 2D)1. التغيير في الذوبان بين الكسور القابلة للقياس الكمي ويشير إلى أن هذا البروتوكول يمكن أن تعقب تحوير أنواع البروتين متحولة المسببة للأمراض، مما يجعل هذا أسلوب مناسب لتقييمات البيوكيميائية قبل الإكلينيكية للمرض التدخل. التغييرات غير قابلة للذوبان، فيبريلار أنواع مت أيضا التقاط التمويه بين أنواع البروتين الذي يتم عن طريق العلاج مع MG132 أو تنظيم الأهداف العلاجية المحتملة، مثل PIAS11التضمين.
رقم 1: وجود القابلة للذوبان/الذوبان القرار البروتوكول والبروتين. (أ) خط أنابيب البصرية لوجود البروتوكول. البروتوكول هو موضح هنا يمكن تطبيقها على عينات الماوس الثقافة الأنسجة أو الخلايا ولكن هو مناسبة للتكيف لأنواع العينات الأخرى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الممثل وينتج عن فراكتيونيشنز سولوبلي وغير قابلة للذوبان وتحليلات- الكسور سولوبلي (A) وغير قابلة للذوبان من ليساتيس خلية HEK293T حل من % 4-12 مكررا-تريس والجل خلات تريس "الصفحة" 3-8 في المائة، مع الاحترام. يظهر جزء قابل للذوبان تطبيع لتحميل عنصر التحكم جابده تقلب مت إكسون 1 مركب قابل للذوبان استناداً إلى التعرض إلى MG132. يظهر جزء غير قابل للذوبان أن الأنواع حمو المتراكمة من مت هو أيضا عن طريق العلاج MG132 التضمين. (ب) تحليل للكسور القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان من ليساتيس هيلا الخلية باستخدام تحليلات التخلف العقلي وصمة عار وتصفية الغربية: خلايا هيلا transfected مع إكسون 1 سومو صاحب أو سومو-2 و/أو 97Q-HTT 1 وتعامل مع 5 ميكرومتر MG132 ل hr.* 18 (ج) وجود القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان من خلايا هيلا أوفيريكسبريسينج 97Q-HTT إكسون 1 وأما أوفيريكسبريسيد PIAS1 أو تعامل مع siRNA ضد تنظيم المعرض PIAS1 همو مهتت تراكم بعد تحوير الهدف علاجية محتملة (د) كسور غير قابلة للذوبان من الماوس سترياتا تعامل مع ميكرورنا ضد PIAS1 وتحل في 3-8% "صفحة" تريس-خلات الجل إظهار تحوير HWM غير قابلة للذوبان مهتت * *. تم تعديل لوحات (ب-ج) مع إذن13. وقد تم تعديل الفريق (د) مع الإذن1. * طبع من اورورك et al. 13 مع إذن. * * طبع من أوتشابا et al. 1 بتصريح من السفير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الأنسجة (الواحدة والنصف من الكرة الأرضية) | الوزن التقريبي (mg) | وحدة التخزين القابلة للذوبان (ميليلتر) | وحدة التخزين غير قابلة للذوبان (ميليلتر) |
| ماوس المخطط | 30 | 250 | 150 |
| ماوس قشرة | 100 | 500 | 250 |
| ماوس الحصين | 30 | 250 | 150 |
| ماوس المخيخ | 40 | 250 | 150 |
| ماوس الهيكل العظمى العضلات * | 100 | 300 | 150 |
| ماوس الكبد (فلقة) | 100 | 400 | 200 |
| * النسيج الضام أشكال اللبني واجهة؛ إزالة لتجنب التلوث | |||
الجدول 1: اقترح وحدات التخزين (X) لوجود الأنسجة على حدة لكل المخازن المؤقتة لتحلل القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان. حجم المخزن المؤقت تحلل تستعصي على الحل استناداً إلى ابتداء من كمية المواد، التي يمكن تعديلها تبعاً لذلك استناداً إلى حجم بيليه غير قابلة للذوبان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بعض الاحتياطات اللازمة للبروتوكولات المذكورة أعلاه لضمان تحقيق نتائج متسقة والكمية. أولاً، مت في كلا كسور عفوية ستشكل المجاميع مع مرور الوقت على عدة دورات ذوبان التجميد، لا سيما عندما تكون في تركيزات عالية. وبالتالي من الضروري تجميد مختبرين محضرات البروتين، وذوبان الجليد فقط حجم اللازمة قبل أن يعمل في التحليل كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. علاوة على ذلك، إذا كان جزء غير قابل للذوبان غلة مرسب الأبيض عند ذوبان الجليد، يلزم إعادة تشكيل s 5 إضافية sonication نبض، ويغلي مدة 5 دقائق، وإعادة كوانتيتاتيون قبل التحليل عن طريق فحوصات الكيمياء الحيوية.
القرار الكمية لهذا التحليل يمكن تحقيقه بتطبيع كثافة بكسل يعني الكسر القابلة للذوبان لأن عنصر تحكم تحميل أو حفظ البيت الجينات داخل كل عينة. كما هو موضح هنا، جابده كجين حفظ البيت للكسر القابلة للذوبان كما أنه يموضع غالباً إلى سيتوسول (الشكل 1). أخرى بروتينات حفظ البيت استخداماً هي أكتين و α-tubulin إيرك 1/2. ومع ذلك، ينبغي أن يكون الأمثل البروتينات تطبيع مناسبة للنظام قيد الدراسة لضمان التعبير حالة ثابتة لتطبيع دقيقة ونفوذ. بينما الكسر غير قابل للذوبان بمثابة جزء نووية خام كما يتضح من وجود هستون 3 والافتقار إلى جابده1، القرار في 3-8% صفحة الهلام حدود الكشف يشيع استخدام علامات النووية. ولذلك، الكسر غير قابلة للذوبان مناسبة للقياس الكمي باستخدام قيمة كثافة إشارة الخام كتمثيل نسبي لوفرة البروتين. بيد أن علامات البروتين الكامل، مثل البقع البروتين عكسها، تستخدم لمراقبة للاختلافات في البروتين تحميل ويمكن تكييفها كعامل تطبيع لجزء غير قابل للذوبان.
بالإضافة إلى ذلك، في حين يوفر وجود وسيلة لحل الأنواع مت غير قابلة للذوبان والقابل للذوبان، يخضع مت العديد من التغييرات كونفورماشونال في جميع أنحاء المرض المرضية، التي لن تكون مميزة في الكسر غير قابلة للذوبان. وعلاوة على ذلك، قد تسهم نتائج المرض مفيد بعض والتشكلات ويتصرف كوسيطة التخليص مستقرة. ولذلك من المهم تحديد كونفورميرس مت أخرى ترتبط بالنتائج المرضية. قد تكون بعض التحسين اللازمة لتصور أخرى وسيطة مت. لمعالجة هذه المشكلة، يمكن زيادة نسبة مخزونات النشر الاستراتيجي إلى 20% إذا كان المجموع الكلي مقاوم لخفض تركيزات.
هذا البروتوكول يوضح شروط وجود البروتين وفحوصات الناتجة التي تكشف عن مختلف والتشكلات وشظايا مت التكديس والتجميع في خلية ثقافة ونموذج الفأر وراثيا عالية الدقة. هذا النوع من العزل البروتين البيوكيميائية من المتصور لتقييم تطور المرض في نماذج أخرى عالية الدقة وقد تسهم في الفهم المتزايد لديناميات مت داخل الخلية وتأثيرها على أمراض المرض.
بعد تجزئة، يمكن معالجة العينات بطرق عديدة. سيتم حل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تليها تحليل لطخة غربية الأنواع القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان مت تقديم تقييم نسبي في مستويات مت الأنواع1. من الممكن أيضا لتقييم الكسور في فحوصات الكيمياء الحيوية إضافية مواصلة تقييم الأنواع مت. على سبيل المثال، يمكن حل [اغروس] هلام التفريد (عمر) وكشف مت القابلة للذوبان، أوليجوميريك، في حين مقايسة تصفية التخلف العقلي (FR) أداة قوية للكشف عن الأنواع مت غير قابلة للذوبان، فيبريلاري،من1617.
ميزة إضافية ويعرض هذا التحليل هو تقييم البروتين ميسلوكاليزيشن المرتبطة بنشوء المرض. وكما أظهرنا في 18، يسمح هذا البروتوكول تجزئة في التصور وتتبع من البروتينات مثل Rangap1، التي يبدو أن يعزل بمجاميع كبيرة غير قابلة للذوبان، وقد لا تحل في جل الصفحات قياسية. بالإضافة إلى ذلك، حسب هذا التحليل أيضا بمثابة فصل النووية/هيولى خام، أحد أيضا قياس ميسلوكاليزيشن للبروتينات، مثلاً، p65، في نماذج الماوس HD1.
هو حافز بارز لتحليل مهتت التجميع والتكديس تطوير رواية هد التشخيص والمداواة. وقد حددت المركبات التي تمنع أو عكس تجميع مهتت من شاشات الفائق واختبارات المستهدفة1،12،19،،من2021. ومع ذلك، نظراً للصعوبة في حل العديد من أشكال مت، تقييم تحوير التجميع لم يكن دائماً ممكناً. الأساليب التقليدية تحلل يمكن التخلص من الحطام الخلوية الأعلاف التي يحتمل أن تحتوي على البروتين الكلي غير قابلة للذوبان، أو تحلل المخازن المؤقتة قد لا تحتوي على المنظفات ما يكفي سولوبيليزيشن. الأسلوب الموصوفة هنا يوفر منبرا لعزل وكشف شكل مت يمكن استخدامها كعلامة الكيمياء الحيوية في الخلية على أساس أو تقييمات ما قبل السريرية في فيفو مجمعة.
يمكن تطبيق الاختبارات الموصوفة هنا للبروتينات تجمعات أخرى. بسبب الميزة الحيوية للبروتينات تجمعات، يمكن إضافة هذه الاختبارات فعالية مع تحليلات أخرى للكشف عن آليات متعمقة للبروتين التوازن والتجميع. وتشمل هذه التحاليل قياس مستويات حالة ثابتة من المجاميع وعلى الأقسام الموجودة في خلية مختلفة كسور (الشكل 1) أو تحليل البروتين قابلة للطي/التجميع باستخدام البروتينات المؤتلف المنقي. هذه الاختبارات سوف يساعد على التمييز بين الآثار المباشرة أو غير المباشرة للتحوير الوراثي أو دوائية على تدهور البروتين أو التجميع. بناء على السابق في المختبر في سينوكلين مجزأ تجميع تقييمات22، منذ ذلك الحين المطبقة لدينا هذا العمل إلى نماذج الماوس مرض باركنسون لحل مختلف والتشكلات سينوكلين23. ولذلك، البروتوكولات المذكورة في هذا العمل يمكن تطبيقها على نماذج أخرى من البروتين ميسفولدينج والتجميع، وقد تسهم اكتشاف وتطوير علاجات جديدة استهداف البروتينات المجمعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (RO1-NS090390). ونود أيضا أن نشكر الدكتور جوان ستيفانفور المساعدة التقنية والمناقشة أثناء وضع هذا التحليل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
References
- Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
- La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
- Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
- Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
- Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
- Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
- Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
- Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
- Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
- Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
- O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
- Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
- Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
- Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
- Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
- Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
- Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).
