Summary
Um método é descrito por fracionamento de espécie mutante solúvel e insolúvel da cultura de cérebro e cela de rato. O método descrito é útil para a caracterização e quantificação de fluxo de proteína huntingtina e auxilia na análise de homeostase de proteína na patogênese da doença e na presença de perturbações
Abstract
O acúmulo de misfolded proteínas é central para a patologia na doença de Huntington (HD) e muitas outras doenças neurodegenerativas. Especificamente, uma chave característica patológica de HD é o acúmulo aberrante de proteína mutante HTT (mHTT) em complexos de alto peso molecular e corpos de inclusão intracelulares é composto por fragmentos e outras proteínas. Métodos convencionais para mensurar e compreender que as contribuições de várias formas de agregados contendo mHTT incluem microscopia de fluorescência, análise ocidental do Borrão e filtro armadilha de ensaios.
No entanto, a maioria desses métodos é conformação específica e portanto não pode resolver o estado completo de fluxo de proteína mHTT devido à natureza complexa da solubilidade agregada e resolução.
Para a identificação dos agregados do mHTT e várias formas modificadas e complexos, separação e solubilização dos agregados celulares e fragmentos é obrigatória. Aqui nós descrevemos um método para isolar e Visualizar mHTT solúvel, monômeros, oligômeros, fragmentos, e um insolúvel alto peso molecular (HMW) acumulado mHTT espécies. HMW mHTT faixas com a progressão da doença, corresponde-se com leituras de comportamento do rato e tem sido beneficamente modulada por determinadas intervenções terapêuticas1. Esta abordagem pode ser usada com cérebro de rato, cultura de células e tecidos periféricos, mas pode ser adaptada para outros sistemas modelo ou contextos de doença.
Introduction
O rompimento das redes de controle de qualidade de proteína que certifique-se de dobramento adequado e degradação de proteínas celulares são provável central para a patologia da doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD) e outros "enrolamento de proteínas" distúrbios de2,3. Uma compreensão detalhada dos componentes de rede de proteostasis e suas contribuições para a patologia são, portanto, crucial para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas melhoradas. HD é causada pelo aumento anormal de uma repetição CAG no gene HD, resultando em um estiramento expandido de polyglutamines (polyQ) na proteína de huntingtin (HTT)4. Uma característica patológica constante de patogênese de HD é o enrolamento resultante, acumulação e agregação de HTT em regiões do cérebro e em tecidos periféricos, que tem sido mostrado para interferir de várias maneiras com a função e a homeostase celular normal 5 , 6. enquanto HTT é expressado ubiquitously, médios neurônios espinhosos o striatum são seletivamente vulneráveis e mais abertamente afetada com notável atrofia cortical também associada à patogênese de HD.
A formação de agregados de HTT no cérebro de doentes de Huntington e modelos animais normalmente tem servido como um marcador de proxy para progressão da doença e ganho negativo dominante da função para o mHTT7. Embora os mecanismos precisos pelos quais proteínas enrolamento e agregação podem contribuir para toxicidade induzida pelo mHTT permanecem pouco claras, a formação destas inclusões no cérebro de doentes de Huntington e vários modelos animais é uma característica invariável e inevitável. Inclusões de aparecem ser composto em grande parte acumulada HTT fragmentos contendo o N-terminal expandido polyQ, indicando que a proteólise e processamento de longa-metragem HTT bem como alternativa de emenda8,9 pode desempenhar um importante papel na patogênese da HD. N-terminal HTT fragmentos pode constituir uma forma patológica de HTT que pode agregar rapidamente, nucleada e acelerar ou propagar a agregação processo10.
No entanto, a presença destas inclusões não necessariamente se correlaciona com toxicidade induzida por HTT ou célula morte11. HTT tem sido proposto para se submeter a um processo de agregação de um monômero solúvel através da espécie oligoméricas solúvel e fibrilas de β-folha para agregados insolúveis e inclusões12. Resolver essas várias espécies de proteína através de ensaios bioquímicos padrão tem sido um desafio no campo, devido a sua estabilidade em baixo-detergente do lysis e dificuldade em Visualizar usando padrão ensaios bioquímicos. Assim, considerações metodológicas são fundamentais para detectar o grau e o padrão do mHTT acumulada e agregado.
O protocolo apresentado aqui fornece um método para visualizar vários intermediários de HTT, especificamente a formação de uma espécie de HMW HTT insolúvel que aparece acompanhar de perto com HD patogênese e doença progressão1,13 ,14. Ser capaz de resolver e controlar múltiplas espécies de mHTT fornece pesquisadores uma ferramenta bioquímica para estudar a patogênese da doença e avaliar intervenções terapêuticas potenciais através da sua modulação e impacto na patogênese da doença.
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Protocol
Declaração de ética animal - experimentos foram realizados em estrita conformidade com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório de institutos nacionais de saúde e um protocolo de pesquisa animal aprovado pelo (Comité de uso e cuidado institucional do Animal IACUC) da Universidade da Califórnia, Irvine, um AAALAC credenciada instituição. Foram envidados todos os esforços para minimizar o sofrimento dos animais.
1. preparação de Buffers de Lise
- Prepare-se "Solúvel" lise (pH de Tris 10 mM 7.4, 1% Triton X 100, 150 mM NaCl, 10% de glicerol) e filtro estéril através de filtro de 0,22 µm.
- Para um trabalho "Solúvel" do lysis, medir N-proteà (NEM) e dissolver completamente em 100mm phenylmethysulfonyl flúor (PMSF) dissolvido em 100% EtOH.
Nota: Lysis Buffer inibidores: (i) 20 mM N-proteà (NEM); (ii) 0.2 mM PMSF; (iii) 1mm ortovanadato de sódio (at3vo +4); (iv) 1 leupeptin µ g/mL; (v) 1 aprotinina µ g/mL; (vi) 20mm fluoreto de sódio (NaF).
Atenção: Use uma máscara quando se trabalha com NEM em todo o protocolo. Trabalhar lise deve ser feita fresco para garantir ativos inibidores. - Para tampão de Lise solúvel com inibidores de protease, adicionar inibidores na seguinte ordem: fluoreto de sódio (NaF), volume com Lise fria, ortovanadato de sódio (at3vo +4), aprotinina e Leupeptin.
- Para um trabalho "Solúvel" do lysis, medir N-proteà (NEM) e dissolver completamente em 100mm phenylmethysulfonyl flúor (PMSF) dissolvido em 100% EtOH.
- Para "Insolúveis" tampão de Lise, suplemento 4% SDS adicionando 500 µ l de SDS 20% para 2 mL de tampão de lise "Solúvel". Deixe em temperatura ambiente.
Nota: SDS vai precipitar-se quando mantidos a 4 ° C; manter em temperatura ambiente. Composição do lysis final: 10 mM Tris (pH 7,4); 1% Triton X-100; 150 mM NaCl; 10% de glicerol; 4% SDS (só insolúvel).
2. solúveis/insolúveis fracionamento protocolo
Nota: Consulte a Figura 1 para um esquema.
- Dois conjuntos de tubos para cada amostra de etiqueta: "Solúvel" e "Insolúveis".
- Adicione X-µ l de gelado trabalho solúvel lise suplementado com inibidores de protease (ver 1.1.1) ao tecido.
Nota: X = Volume varia dependendo da quantidade de tecido; Consulte a tabela 1. - Para o tecido de cérebro de rato (ou seja, corpo estriado), homogenizacao lentamente 30 vezes em vidro douncer de 1 mL e pipeta em "Insolúveis" rotulado tubo (manter no gelo).
Nota: Tenha cuidado para não quebrar a superfície do líquido depois de começar a douncing, como bolhas irão formar e podem produzir a homogeneização incompleta. - Para as células (ou seja, HeLa, HEK293T), enxague as células uma vez com o frio, 1X PBS. Remover PBS e aplicar o volume mínimo de lise de células e levantar com raspador de célula.
Nota: Para acima da linha de celular, células foram banhadas em 5 x 105 células por 6 placa bem e crescidas para perto de confluência. Um bem é comparável aos volumes utilizados para striatum do rato. - Transferir homogeneizado ou lisado em celular rotulado, "Insolúveis" tubos e lyse no gelo 1h (relógio de início após o processamento final tubo).
Nota: Para lisados celulares, Triture várias vezes para quebrar aglomerados de células antes de começar a incubação. Evite a formação de bolhas. Brevemente o vórtice pulso cada amostra para 1 s lise no meio. - Centrifugar as amostras a 4 ° C a 15.000 x g por 20 min.
- Recupere o sobrenadante como a fração de "Solúvel".
- Remover com pipeta, tenha cuidado para não perturbar a camada de sedimento/nublado como este vai contaminar a fração. Na fracção solúvel em "Solúvel" pipeta rotulada de tubo. Manter-se no gelo.
- Lave o pellet com 500 µ l de tampão de lise (x2) e centrifugar a 4 ° C a 15.000 x g por 5 min depois de cada lavagem; é okey se alguns da camada turva é pipetado fora.
- Após a lavagem final, remova todos os restantes tampão de lavagem, deixando apenas a pelota de tecido.
Nota: A partir deste ponto, amostras insolúveis agora devem ser mantidas em temperatura ambiente. - Ressuspender pelota com X-µ l tampão de Lise suplementado com SDS de 4% (Volume pode ser ajustado dependendo do tamanho da pelota; ver tabela 1).
- Proceda à sonicação cada amostra por 30 s em temperatura ambiente com um sonicador de sonda (125 Watts, 20kHz, pulso, Amplitude de 40%, consulte Tabela de materiais).
- Ferva amostras (rolamento ebulição) por 30 min; Centrifugue brevemente (15 s) a 6.000 x g, de não perder qualquer amostra.
- Realizar o ensaio da proteína de DC (detergente compatível) (ver Tabela de materiais) ou ensaio de proteínas Lowry para medir a concentração de proteína (recomendada começou diluições de 1/5 da amostra em tampão de Lise respectivos para cultura de células e 1/10 para lysates do tecido).
Nota: As concentrações de proteína terá que ser lido usando um ensaio de DC ou Lowry devido à alta concentração de detergente. - Alíquotas amostras em 50 lotes µ l para evitar problemas de congelamento e descongelamento.
Nota: Protocolo pode ser pausado aqui antes da posterior análise bioquímica, armazenando as duas fracções a-20 ° C.
3. quantificação e ocidental do borrão
- Execute borrões ocidentais como relatado em outros lugares1,13 µ g de 30 diluição da amostra 1:1 em carregando buffer (1.6 x tintura, 1 x redução de carga).
Nota: 30 µ g de proteína por fração é suficiente, mas pode ser ajustado para resolução ideal. 3 - géis de poli-acrilamida de Tris-Acetato de 8% devem ser usados para a fração insolúvel. 4 - géis de bis-Tris 12% são recomendadas para a fração solúvel. - Ferva amostras (rolamento fervura) por 5 min. centrifugador brevemente (15 s) a 6.000 x g para coletar a amostra.
- Analise fracções por SDS-PAGE e borrão ocidental, de acordo com o protocolo do fabricante para amostras reduzidas.
Nota: A fração insolúvel resolve melhor quando transferido para uma membrana de nitrocelulose 0,45 µM. nitrocelulose de 0.45 ou 0,2 µM pode ser usado para a fração solúvel, dependendo do tamanho da proteína de interesse. Alguma otimização pode ser necessária para melhor transferência de materiais HMW. - Mancha de membrana com mancha toda proteína (por exemplo, MEMcode, veja a Tabela de materiais) para visualizar a proteína eficiência de carregamento.
Nota: Borrões ocidentais podem ser analisados pela intensidade média de pixel. Frações solúveis podem ser normalizadas para uma proteína de domésticas melhor adequada para o sistema experimental. Fração insolúvel como abundância relativa de proteína foi verificada por proteína reversível coloração ou normalização de histona 3 no blot separado.
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Representative Results
Resolução de lisado celular solúvel e insolúvel após fracionamento pode ser detectada usando ocidentais ensaios retardo análise e filtro (Figura 2). Como exemplo, HEK293T células foram transfectadas usando o reagente de transfeccao (por exemplo, lipofectamine 2000), com o exon HTT 1 codificação cDNA contendo glutamina 97 repete15 , seguido pela região rica poli prolina e essas células foram autorizadas a expresso por células de h. 44 foram tratadas com qualquer 5 µM MG132 para bloquear a Proteassoma ou DMSO como um controle para 18 h antes da colheita e lisados como descrito acima. Seguindo o protocolo de fracionamento, mutante exon HTT 1 resolve como um monômero solúvel em torno de 45 kDa em 4-12% Bis-Tris página géis e como uma espécie de acumulada insolúvel HMW em géis de Tris-Acetato-página 3-8% (Figura 2A). Monômero solúvel pode ser quantificado e normalizado para uma proteína de domésticas (mostrado aqui como GAPDH). HMW, mHTT insolúvel é quantificada como abundância relativa de proteínas pela intensidade média de pixel. Quando tratados com o inibidor de MG132, há uma diminuição perceptível no monômero solúvel do mHTT juntamente com um aumento correspondente em HMW, mHTT insolúvel.
Frações insolúveis podem ser analisadas por técnicas adicionais, como um ensaio de retardo de filtro para resolver mHTT insolúveis, fibrillar16 (Figura 2B). Células HeLa foram similarmente transfected como acima com exon 97Q-HTT 1 e a sua-sumô-1 ou His-sumô-2. As células foram tratadas com DMSO ou MG132 por 18 h antes de fracionamento e analisaram usando borrão ocidental e ensaios de retardo de filtro. Os dados mostram que a presença de Blumental sumô isoform aumenta tanto HMW e fibrilar insolúvel mHTT. Adição de MG132 exacerba o aumento da espécie mHTT insolúvel. Espécie de HWM mHTT também pode ser modulado pela superexpressão ou redução do alvo doença HD, PIAS1 em ambos HeLa células13 e mouse striata1 (Figura 2-D). Nocaute de PIAS1 no modelo do mouse rapidamente progredindo de HD, o R6/2, usando entrega viral de um siRNA contra PIAS1, reduz o acúmulo de HMW mHTT insolúvel. Superexpressão viral de PIAS1 em camundongos R6/2 leva a um aumento notável na HMW insolúvel mHTT (Figura 2D)1. A mudança na solubilidade entre fracções é quantificável e indica que este protocolo pode controlar modulação de espécies patogénicas proteína mutante, inventando uma técnica adequada para avaliações bioquímicas pré-clínicas de intervenção de doença. Mudanças no insolúvel, espécie fibrillar do mHTT também captura fluxo entre as espécies de proteína que são moduladas por tratamento com MG132 ou regulamento de alvos terapêuticos, tais como PIAS11.
Figura 1: resolução de protocolo e proteínas solúveis/insolúveis fracionamento. (A) Visual pipeline para protocolo de fracionamento. O protocolo descrito aqui pode ser aplicado a amostras de cultura de tecidos ou células de rato, mas é adequado para adaptação a outros tipos de amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: representante resultados para análises e solúvel e insolúvel fractionations. (A) solúvel e insolúvel em fracções de lisados celulares HEK293T, resolvidos em um Bis de 4-12%-Tris e géis de Tris-Acetato-página 3-8%, com todo o respeito. Fração solúvel normalizada para controle de carregamento de GAPDH mostra flutuação de monômero de solúvel mHTT exon 1 com base na exposição ao MG132. Fração insolúvel mostra que espécie de acumulada HMW do mHTT também é modulada por tratamento MG132. (B) análise de frações solúveis e insolúveis de célula HeLa lysates usando análises de retardo ocidentais do Borrão e filtro: as células HeLa foram transfectadas com His-sumô-1 ou 2 de sumô e/ou 97Q-HTT exon 1 e tratadas com 5 µM MG132 para hr.* 18 (C) Solúvel e insolúvel fraccionamento de células HeLa superexpressão exon 97Q-HTT 1 e também overexpressed PIAS1 ou tratada com um siRNA contra PIAS1 Visualizar regulamento de acúmulo de mHTT HMW depois modulando um potencial terapêutico target.* (D) Frações insolúveis de rato striata tratadocom com microRNA contra PIAS1 e resolvido na Tris-Acetato-página 3-8% géis modulação de mostrar de HWM insolúvel mHTT * *. Painéis (B-C) foram modificados com permissão13. Painel (D) foi modificada com permissão1. * Reproduzido de O'Rourke et al. 13 com permissão... * * reproduzido de Ochaba et al 1 com permissão da Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tecido (por hemisfério) | Peso aproximado (mg) | Volume de solúvel (µ l) | Insolúvel de volume (µ l) |
| mouse Striatum | 30 | 250 | 150 |
| Córtex de rato | 100 | 500 | 250 |
| Hipocampo de rato | 30 | 250 | 150 |
| Cerebelo de rato | 40 | 250 | 150 |
| rato músculo esquelético * | 100 | 300 | 150 |
| rato de fígado (lobo) | 100 | 400 | 200 |
| * tecido conjuntivo interface leitoso de formulários; remover para evitar contaminação | |||
Tabela 1: sugeriu volumes (X) para fracionamento de tecido-específica para ambos os buffers de Lise solúveis e insolúveis. Volume de tampão de Lise insolúvel com base na começando a quantidade de material, que pode ser ajustado em conformidade, com base no tamanho de sedimento insolúvel.
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Discussion
Algumas precauções são necessárias para os protocolos acima garantir resultados consistentes e quantitativos. Primeiro, mHTT em ambas as fracções espontaneamente irá formar agregados ao longo do tempo, após vários ciclos de descongelamento de congelamento, particularmente quando em alta concentração. Assim, é fundamental para congelar alíquotas das preparações de proteína e descongelar somente o volume necessário antes de executar o ensaio conforme descrito no protocolo acima. Além disso, se fração insolúvel produz dessensibilizador branco após descongelamento, reconstituição pode ser necessária por um adicional 5 s sonication pulso, ferver 5 min e re-quantificação antes da análise, através de ensaios bioquímicos.
Resolução quantitativa para este ensaio é alcançável normalizando pixel média intensidade da fração solúvel com a de um controle de carregamento ou domésticas gene dentro de cada amostra. Como mostrado aqui, GAPDH foi usado como um gene de domésticas para a fração solúvel como ele localiza predominantemente para o citosol (Figura 1). Outras proteínas domésticas comumente usadas são a actina, α-tubulina e Erk 1/2. No entanto, proteínas de normalização apropriada devem ser otimizadas para o sistema sendo estudado para garantir a expressão de estado estacionário para normalização precisa e influenciada. Enquanto a fração insolúvel serve como uma fração nuclear bruta como visto pela presença de histona 3 e falta de GAPDH1, resolução em 3-8% página geles detectabilidade de limites para comumente utilizados marcadores nucleares. Portanto, a fração insolúvel é apropriada para quantificação, usando o valor de intensidade de sinal bruto como uma representação relativa abundância de proteína. No entanto, marcadores de proteína inteira, tais como manchas de proteína reversíveis, são usados para controle das variações de carga de proteína e podem ser adaptados como um fator de normalização para fração insolúvel.
Além disso, enquanto o fracionamento fornece um meio de resolver a espécie mHTT solúvel e insolúvel, mHTT sofre inúmeras mudanças conformacionais em toda a patogênese da doença, alguns dos quais não serão distinguíveis na fração insolúvel. Além disso, algumas conformações podem contribuir beneficamente para resultado de doença e agir como intermediários de liberação estável. Portanto, é importante identificar outras mHTT conformistas que correlacionam com resultados para a patogênese. Alguma otimização pode ser necessária para visualizar outros intermediários do mHTT. Para resolver isso, percentagem de SDS pode ser aumentada para 20% se a agregação é resistente para reduzir as concentrações.
Este protocolo demonstra as condições de fracionamento de proteínas e ensaios resultantes que detectam diferentes conformações e fragmentos de acumulação do mHTT e agregação em cultura de células e um modelo de rato transgénico do HD. Este tipo de isolamento da proteína bioquímica é planeado para avaliação da progressão da doença em outros modelos de HD e pode contribuir para a crescente compreensão da dinâmica do mHTT dentro da célula e seu impacto sobre a patologia da doença.
Após fracionamento, as amostras podem ser processadas em inúmeras maneiras. SDS-PAGE, seguido de análise ocidental do borrão resolverá mHTT solúvel e insolúvel espécie para fornecer uma avaliação relativa em níveis do mHTT espécie1. Também é possível avaliar fracções em ensaios bioquímicos adicionais para avaliar mHTT espécies. Por exemplo, eletroforese em gel de agarose (idade) pode resolver e detectar mHTT solúvel, oligoméricas, enquanto um ensaio de retardo (FR) do filtro é uma poderosa ferramenta para detectar mHTT insolúveis, fibrilar espécie16,17.
Uma vantagem adicional que deste ensaio apresenta é a avaliação de mislocalization proteína associada com a patogênese. Como demonstrámos no 18, este protocolo de fracionamento permite a visualização e acompanhamento das proteínas tais como Rangap1, que parecem ser sequestrado por grandes agregados insolúveis e não pode resolver em um gel de página padrão. Além disso, como este ensaio também serve como uma separação nuclear/citoplasmática bruta, um pode também calibrar mislocalization de proteínas, por exemplo, p65, em HD do mouse modelos1.
Uma proeminente motivação para análise de agregação do mHTT e acumulação é o desenvolvimento de novos diagnósticos de HD e terapêutica. Foram identificados compostos que inibem ou reverter mHTT agregação de telas de alta produtividade e alvo de testes1,12,19,20,21. No entanto, dada a dificuldade de resolver muitas das formas do mHTT, avaliação de modulação de agregação não foi sempre viável. Métodos tradicionais de Lise podem alienar os restos celulares peletizados que potencialmente contêm proteína insolúvel de agregado, ou buffers de Lise não podem conter bastante detergente para solubilização. O método descrito aqui fornece uma plataforma para isolar e detecção de forma agregada do mHTT que pode ser usado como um marcador bioquímico na célula com base ou avaliações pré-clínicas na vivo .
Os ensaios aqui descritos podem ser aplicados a outras proteínas misfolded. Devido a característica dinâmica de misfolded proteínas, estes ensaios podem ser efetivamente juntamente com outras análises para descobrir em profundidade mecanismos de homeostase de proteína e agregação. Estas análises incluem medição dos níveis de estado estacionário de agregados e suas partições em frações de célula diferente (Figura 1) ou análise de proteína dobráveis/agregação usando proteínas recombinantes purificadas. Estes ensaios vão ajudar a distinguir efeitos directos ou indirectos de modulação genética ou farmacológico na degradação proteica ou agregação. Com base no anterior em vitro fracionada por synuclein agregação avaliações22, desde que aplicámos este trabalho para modelos de rato da doença de Parkinson para resolver várias conformações de um synuclein23. Portanto, protocolos descritos neste trabalho podem ser aplicados a outros modelos do enrolamento de proteínas e de agregação e podem contribuir para a descoberta e desenvolvimento de novas terapias alvejando proteínas agregadas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH (RO1-NS090390). Gostaríamos também de agradecer ao Dr. Joan Steffanfor assistência técnica e discussão durante o desenvolvimento deste teste.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
References
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