Summary
Un metodo è descritto per il frazionamento delle specie solubili e insolubili huntingtina mutata dalla coltura delle cellule e del cervello del mouse. Il metodo descritto è utile per la caratterizzazione e la quantificazione del flusso di proteina huntingtina ed aids nell'analizzare omeostasi della proteina nella patogenesi della malattia e in presenza di perturbazioni
Abstract
L'accumulo di proteine misfolded è centrale per la patologia nella malattia di Huntington (HD) e molte altre patologie neurodegenerative. In particolare, una caratteristica patologica chiave di HD è l'aberrante accumulo della proteina mutante HTT (mHTT) in complessi ad alto peso molecolare e i corpi di inclusione intracellulari è composto da frammenti e altre proteine. I metodi convenzionali per misurare e comprendere che i contributi delle varie forme di mHTT contenenti aggregati includono microscopia a fluorescenza, l'analisi western blot e filtro trappola saggi.
Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono conformazione specifica e pertanto non può risolvere lo stato di cambiamento continuo della proteina mHTT a causa della natura complessa di aggregazione solubilità e la risoluzione completa.
Per l'identificazione di mHTT aggregati e varie forme modificate e complessi, separazione e solubilizzazione degli aggregati cellulari e frammenti è obbligatorio. Qui descriviamo un metodo per isolare e visualizzare mHTT solubile, monomeri, oligomeri, frammenti, e un insolubile ad alto peso molecolare (HMW) accumulato mHTT specie. HMW mHTT tracce con progressione di malattia, corrisponde con le letture di comportamento del mouse e ha stato favorevolmente modulata da determinati interventi terapeutici1. Questo approccio può essere utilizzato con cervello di topo, tessuti periferici e coltura delle cellule, ma può essere adattato ad altri sistemi di modello o contesti di malattia.
Introduction
L'interruzione delle reti di controllo di qualità di proteina che assicurano il corretto ripiegamento e degradazione delle proteine cellulari è probabile centrale per la patologia nel morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD) e altri "misfolding proteico" disordini di2,3. Conoscere in dettaglio i componenti di rete proteostasis e i loro contributi alla patologia sono quindi cruciali per lo sviluppo di interventi terapeutici migliorati. MH è causata dall'espansione anormale di una ripetizione di CAG nel gene HD risultante in un tratto espanso di polyglutamines (poliQ) nella proteina huntingtina (HTT)4. Una caratteristica patologica coerenza della patogenesi dell'HD è il misfolding risultante, accumulo e l'aggregazione di HTT in regioni del cervello e nei tessuti periferici, che ha dimostrato di interferire in vari modi con funzione e omeostasi cellulare normale 5 , 6. HTT mentre è espressa ubiquitariamente, neuroni medi spinosi nello striato sono selettivamente vulnerabili e più apertamente interessata con atrofia corticale notevole anche associato con la patogenesi dell'HD.
La formazione di aggregati di HTT nel cervello di pazienti con MH e modelli animali in genere ha servito come un marcatore di proxy per la progressione della malattia e dominante-negativo guadagno di funzione per mHTT7. Anche se i meccanismi precisi di quale proteina misfolding e aggregazione può contribuire alla tossicità indotta da mHTT rimangono poco chiari, la formazione di queste inclusioni nel cervello dei pazienti di HD e vari modelli animali è una caratteristica invariante e inevitabile. Inclusioni appaiono per essere composto in gran parte accumulate HTT frammenti contenenti il N-terminale ampliato polyQ, indicando tale proteolisi ed elaborazione di Full-Length HTT, nonché8,di splicing alternativo9 possono svolgere un ruolo importante nella patogenesi della HTT HD. N-terminale frammenti può costituire una forma patologica di HTT che può aggregare rapidamente, nucleazione e accelerare o propagare il processo di aggregazione10.
Tuttavia, la presenza di queste inclusioni non è necessariamente correlata con la tossicità indotta da HTT o cellule morte11. HTT è stato proposto di sottoporsi a un processo di aggregazione da un monomero solubile attraverso specie oligomeriche solubile e β-foglio fibrille di aggregati insolubili e inclusioni12. Risoluzione di queste varie specie di proteina tramite saggi biochimici standard è stata una sfida nel campo grazie alla loro stabilità nel buffer di lisi di basso-detergente e difficoltà nel visualizzare utilizzando saggi biochimici standard. Così, considerazioni metodologiche sono fondamentali nel rilevare il grado e il modello di mHTT accumulati e aggregati.
Il protocollo qui presentato fornisce un metodo per visualizzare diversi intermedi di HTT, in particolare la formazione di una specie di HMW HTT insolubile che sembra tenere sotto controllo con HD patogenesi e malattia progressione1,13 ,14. Essere in grado di risolvere e tenere traccia di più specie di mHTT fornisce ai ricercatori uno strumento biochimico per studiare la patogenesi della malattia e per valutare potenziali interventi terapeutici attraverso la modulazione e l'impatto sulla patogenesi della malattia.
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Protocol
Dichiarazione etica animale - esperimenti sono stati effettuati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health e un protocollo di ricerca animale approvato dalla (uso Comitato e istituzionali Animal Care IACUC) presso la University of California, Irvine, un AAALAC accreditata istituzione. Tutti gli sforzi sono stati fatti per minimizzare la sofferenza animale.
1. preparazione del buffer di lisi
- Preparare "Solubile" buffer di lisi (Tris 10 mM pH 7.4, 1% Triton X 100, 150 mM NaCl, 10% glicerolo) e filtro sterile attraverso il filtro di 0,22 µm.
- Per un buffer di lisi lavoro "Solubile", misura N-Ethylmaleimide (NEM) e accuratamente sciogliere in 100 mM phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) disciolti in 100% EtOH.
Nota: Lysis Buffer inibitori: (i) 20mm N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0,2 mM PMSF; (iii) 1mm orthovanadate del sodio (Na3VO4); (iv) 1 µ g/mL leupeptina; (v) 1 µ g/mL aprotinina; (vi) 20mm fluoruro di sodio (NaF).
Attenzione: Indossare una maschera quando si lavora con NEM in tutto il protocollo. Buffer di lisi di lavoro deve essere effettuato fresco per garantire inibitori attivi. - Per il buffer di lisi solubile con inibitori della proteasi, aggiungere inibitori nel seguente ordine: fluoruro di sodio (NaF), fino a volume con tampone di lisi freddo, orthovanadate del sodio (Na3VO4), aprotinina e leupeptina.
- Per un buffer di lisi lavoro "Solubile", misura N-Ethylmaleimide (NEM) e accuratamente sciogliere in 100 mM phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) disciolti in 100% EtOH.
- Per "Insolubile" buffer di Lisi, supplemento al 4% SDS aggiungendo 500 µ l di 20% SDS a 2 mL di tampone di Lisi "Solubile". Lasciare a temperatura ambiente.
Nota: SDS precipita fuori, conservato a 4 ° C; tenerlo a temperatura ambiente. Composizione di tampone di lisi finale: 10 mM Tris (pH 7,4); 1% Triton X-100; 150 mM NaCl; glicerolo al 10%; 4% SDS (solo insolubile).
2. solubili/insolubili frazionamento protocollo
Nota: Vedere la Figura 1 per una schematica.
- Due set di tubi per ciascun campione di etichetta: "Solubile" e "Insolubile".
- Aggiungi X-µ l di buffer di lisi solubile di lavoro ghiacciata completati con inibitori della proteasi (Vedi 1.1.1) al tessuto.
Nota: X = Volume varia a seconda della quantità di tessuto; Vedere tabella 1. - Per tessuto di cervello di topo (cioè, corpo striato), lisata lentamente 30 volte in vetro da 1 mL douncer e dispensare "Insolubile" etichettati tubo (tenere il ghiaccio).
Nota: Fare attenzione a non rompere la superficie del liquido dopo a partire douncing, come bolle si forma e possono produrre omogeneizzazione incompleta. - Per le cellule (cioè, HeLa, HEK293T), sciacquare le cellule una volta con il freddo, 1x PBS. Rimuovere PBS e applicare il minimo volume di tampone di lisi delle cellule e sollevare con raschietto di cella.
Nota: Per sopra linee cellulari, cellule erano placcate a 5 x 105 celle per ben 6 piastra e cresciute vicino a confluenza. Uno è ben paragonabile ai volumi utilizzati per striatum del mouse. - Trasferimento omogeneato o lysate delle provette, "Insolubile" e lisare il ghiaccio 1 h (orologio di partenza dopo l'elaborazione del filmato finale).
Nota: Per lisati cellulari, triturare diverse volte per spezzare ciuffi di cella prima di iniziare l'incubazione. Evitare la formazione di bolle. Brevemente di vortice impulso ogni campione per 1 s a metà lisi. - Centrifugare i campioni a 4 ° C a 15.000 x g per 20 min.
- Recuperare il surnatante più la frazione "Solubile".
- Rimuovere con pipetta, fare attenzione a non disturbare il pellet/nuvoloso strato come questo, contamina la frazione. Frazione solubile di dispensare in "Solubile" etichettato tubo. Tenere il ghiaccio.
- Lavare la pallina con 500 µ l di tampone di lisi (x2) e centrifugare a 4 ° C a 15.000 x g per 5 min dopo ogni lavaggio; va bene se alcuni dello strato nuvoloso è dispensato fuori.
- Dopo il lavaggio finale, rimuovere tutti i restanti tampone di lavaggio, lasciando solo il precipitato di tessuto.
Nota: Da questo punto, insolubili campioni ora devono essere tenuti a temperatura ambiente. - Risospendere il pellet con X-µ l di tampone di lisi completati con 4% SDS (Volume può essere regolato a seconda del formato della pallina; cfr. tabella 1).
- Sottoporre ad ultrasuoni ogni campione per 30 s a temperatura ambiente con un sonicatore sonda (125 watt, 20kHz, impulso, ampiezza 40%, Vedi Tabella materiali).
- Far bollire i campioni (ebollizione di rotolamento) per 30 min; Centrifugare brevemente (15 s) a 6.000 x g per non perdere alcun campione.
- Eseguire analisi della proteina di DC (detergente compatibile) (Vedi Tabella materiali) o analisi della proteina di Lowry per misurare la concentrazione di proteina (consigliata iniziate diluizioni di 1/5 del campione in tampone di lisi rispettivi per colture cellulari e 1/10 per tessuto lisati).
Nota: Le concentrazioni di proteina dovrà essere letto usando un'analisi DC o Lowry grazie alla elevata concentrazione di detersivo. - Aliquotare campioni in batch in 50 µ l per evitare problemi di congelamento-scongelamento.
Nota: Protocollo può essere sospesa qui prima dell'ulteriore analisi biochimica memorizzando sia frazioni a-20 ° C.
3. quantificazione e Western Blot
- Eseguire le macchie occidentali come segnalato altrove1,13 da diluire 30 µ g di campione 1:1 nel caricamento buffer (1,6 x tintura, 1 x riduzione di carico).
Nota: 30 µ g di proteina per ogni frazione è sufficiente, ma può essere regolata per risoluzione ottimale. 3 - gel di poliacrilammide Tris-acetato di 8% da utilizzarsi per la frazione insolubile. 4 - 12% bis-Tris gel sono raccomandati per la frazione solubile. - Bollire brevemente campioni (ebollizione) per 5 min, centrifuga (15 s) a 6.000 x g per raccogliere il campione.
- Analizzare le frazioni mediante SDS-PAGE e western blot, secondo il protocollo del produttore per campioni ridotti.
Nota: Frazione insolubile risolve meglio quando trasferite su membrana di nitrocellulosa 0,45 µM. nitrocellulosa µM 0,45 o 0,2 può essere utilizzato per la frazione solubile, a seconda delle dimensioni della proteina di interesse. Alcune ottimizzazione può essere richiesto per il migliore trasferimento di materiali HMW. - Macchia della membrana con la macchia di intera proteina (ad es., MEMcode, vedere la Tabella materiali) per visualizzare la proteina efficienza di carico.
Nota: Western blot può essere analizzato dall'intensità media pixel. Frazioni solubili possono essere normalizzate in una casa-armonia proteina migliore adatta per il sistema sperimentale. Frazione insolubile come abbondanza relativa della proteina è stata verificata dalla macchiatura della proteina reversibile o normalizzazione dell'istone 3 sulla macchia separata.
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Representative Results
Risoluzione di lisati solubili e insolubili, seguito di frazionamento può essere rilevato tramite occidentale saggi di ritardo analisi e filtro (Figura 2). Ad esempio, cellule HEK293T transfected utilizzando il reagente di transfezione (ad es., lipofectamine 2000), con l'esone HTT 1 codifica cDNA contenenti glutammina 97 ripete15 seguita dalla regione ricca di prolina di poli e queste cellule sono state permesse espresso per 44 h. cellule sono state trattate con entrambi 5 µM MG132 per bloccare il proteasoma o DMSO come controllo per 18 h prima del raccolto e lisate come descritto sopra. Seguendo il protocollo di frazionamento, mutante essone HTT 1 risolve come monomero solubile kDa circa 45% di 4-12 Bis-Tris pagina gel e come specie insolubile HMW accumulata sui gel di Tris-acetato pagina 3-8% (Figura 2A). Monomero solubile può essere quantificato e normalizzato ad una proteina di mantenimento della casa (mostrato qui come GAPDH). HMW, mHTT insolubile è quantificata come abbondanza relativa proteina di intensità media pixel. Quando trattati con l'inibitore MG132, c'è una diminuzione notevole nel monomero solubile di mHTT insieme a un corrispondente aumento di HMW, mHTT insolubile.
Le frazioni insolubili possono essere analizzate mediante tecniche aggiuntive, ad esempio, un saggio filtro ritardo per risolvere mHTT insolubile, fibrillare16 (Figura 2B). Cellule HeLa transfected allo stesso modo come sopra con esone 97Q-HTT 1 e suo-SUMO-1 o sua-SUMO-2. Le cellule sono state trattate con DMSO o MG132 per 18 h prima del frazionamento e analizzati mediante western blot e analisi di ritardo del filtro. Dati mostrano che la presenza di iperespresso SUMO isoforma aumenta sia HMW e fibrillare insolubile mHTT. Aggiunta di MG132 esacerba l'aumento delle specie mHTT insolubile. Specie di mHTT HWM può anche essere modulata da sovraespressione o riduzione della destinazione di malattia dell'HD, PIAS1 in entrambi HeLa cellule13 e mouse striata1 (Figura 2-D). Atterramento di PIAS1 nel modello del topo velocemente di progressione di HD, la R6/2, utilizzando il recapito virale di un siRNA contro PIAS1, riduce l'accumulazione di HMW mHTT insolubile. Iperespressione virale di PIAS1 in topi R6/2 porta ad un aumento notevole in HMW mHTT insolubile (Figura 2D)1. Il cambiamento di solubilità tra frazioni è quantificabile e indica che questo protocollo può tenere traccia di modulazione delle specie patogene proteina mutante, rendendo questo una tecnica adatta per le valutazioni biochimiche pre-cliniche di intervento di malattia. Modifiche in insolubile, fibrillare specie di mHTT capture anche flusso tra specie di proteina che è modulata da trattamento con MG132 o regolamento di potenziali bersagli terapeutici, come PIAS11.
Figura 1: risoluzione di protocollo e della proteina di frazionamento solubili/insolubili. (A) Visual pipeline per protocollo di frazionamento. Il protocollo descritto qui può essere applicato a campioni di coltura di tessuti o cellule del mouse ma è adatto per l'adattamento ad altri tipi di campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: rappresentante risultati per analisi e solubile e insolubile fractionations. (A) solubile e insolubile frazioni da lisati di HEK293T risolto su un 4-12% Bis-Tris e gel di Tris-acetato pagina 3-8%, rispettosamente. Frazione solubile normalizzato di GAPDH caricamento controllo Mostra fluttuazione del monomero solubile di mHTT esone 1 basata sull'esposizione a MG132. Frazione insolubile dimostra che il specie accumulato HMW di mHTT è anche modulato da MG132 trattamento. (B) analisi delle frazioni solubili e insolubili da HeLa lisati mediante analisi ritardo occidentali della macchia e filtro: cellule HeLa sono state trasfettate con suo-SUMO-1 o SUMO-2 e/o 97Q-HTT esone 1 e trattate con 5 µM MG132 per 18 hr.* (C) Solubile e insolubili frazionamento da cellule HeLa che overexpressing 97Q-HTT esone 1 e sia iperespresso PIAS1 o trattati con un siRNA contro PIAS1 Visualizza regolamento di accumulazione di mHTT HMW dopo modulando un potenziale terapeutico target.* (D) Frazioni insolubili da striata del mouse trattati con microRNA contro PIAS1 e risolto su 3-8% pagina Tris-acetato gel Visualizza modulazione di HWM insolubile mHTT * *. Pannelli (B-C) sono stati modificati con autorizzazione13. Pannello (D) è stato modificato con autorizzazione1. * Ristampato da O'Rourke et al. 13 con autorizzazione. * * ristampato da Ochaba et al. 1 con il permesso di Elsevier. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tessuto (per emisfero) | Peso approssimativo (mg) | Volume solubile (µ l) | Insolubile in volume (µ l) |
| topo striato | 30 | 250 | 150 |
| mouse corteccia | 100 | 500 | 250 |
| mouse ippocampo | 30 | 250 | 150 |
| Cervelletto di topo | 40 | 250 | 150 |
| mouse del muscolo scheletrico * | 100 | 300 | 150 |
| mouse fegato (Lobo) | 100 | 400 | 200 |
| * tessuto connettivo forma interfaccia latteo; rimuovere per evitare la contaminazione | |||
Tabella 1: suggerito volumi (X) per il frazionamento di tessuto-specifici per entrambi i buffer di lisi solubili ed insolubili. Volume di tampone di lisi insolubile basato sull'avvio di quantità di materiale, che può essere regolato a base di conseguenza il formato della pallina insolubile.
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Discussion
Alcune precauzioni sono necessarie per i protocolli di cui sopra garantire risultati coerenti e quantitativi. In primo luogo, mHTT in entrambe le frazioni formeranno spontaneamente aggregati nel tempo su cicli ripetuti di congelamento scongelamento, specialmente quando ci si trova in alta concentrazione. È dunque fondamentale per congelare le aliquote di preps la proteina e scongelare solo il volume necessario prima di eseguire il test come descritto nel protocollo di cui sopra. Ulteriormente, se la frazione insolubile produce precipitante bianco dopo lo scongelamento, ricostituzione può essere necessaria un ulteriore impulso di sonicazione s 5, bollire 5 min e ri-quantizzazione prima dell'analisi tramite analisi biochimiche.
Risoluzione quantitativa per questo test è realizzabile normalizzando pixel media intensità della frazione solubile a quella di un controllo di carico o la casa-armonia gene all'interno di ciascun campione. Come mostrato qui, GAPDH è stato usato come un gene house-keeping per la frazione solubile come localizza principalmente nel citosol (Figura 1). Altre proteine di mantenimento della casa comunemente usati sono l'actina, α-tubulina ed Erk 1/2. Tuttavia, proteine di normalizzazione adatto dovrebbero essere ottimizzati per il sistema essendo studiato per assicurare allo stato stazionario espressione per accurate e uninfluenced normalizzazione. Mentre la frazione insolubile serve come una frazione nucleare grezza, come si vede dalla presenza dell'istone 3 e mancanza di GAPDH1, risoluzione 3-8% pagina gel limiti di rilevabilità per comunemente utilizzati marcatori nucleari. Di conseguenza, la frazione insolubile è adatta per quantificazione utilizzando il valore di intensità di segnale grezzo come una rappresentazione relativa abbondanza di proteine. Tuttavia, indicatori di intera proteina, quali macchie proteina reversibile, sono utilizzati per controllo per variazioni nella proteina di caricamento e possono essere adattati come un fattore di normalizzazione per frazione insolubile.
Inoltre, mentre frazionamento fornisce un mezzo per risolvere specie mHTT solubili e insolubili, mHTT subisce numerosi cambiamenti conformazionali in patogenesi di malattia, alcuni dei quali non saranno distinguibili nella frazione insolubile. Inoltre, alcune conformazioni possono contribuire favorevolmente verso risultato di malattia e agire come mediatori di liquidazione stabile. È pertanto importante identificare altri conformeri mHTT che correlano con i risultati per patogenesi. Alcune ottimizzazione potrebbe essere necessario visualizzare altri intermedi di mHTT. Per risolvere questo problema, SDS percentuale può essere aumentata al 20% se l'aggregato è resistente alle concentrazioni più basse.
Questo protocollo dimostra condizioni frazionamento proteine e saggi risultante che rilevano le varie conformazioni e frammenti di mHTT accumulo e aggregazione in coltura cellulare sia un modello di topo transgenico di HD. Questo tipo di isolamento di biochimica della proteina è previsto per la valutazione della progressione della malattia in altri modelli HD e può contribuire alla comprensione crescente di mHTT dinamiche all'interno della cella e il loro impatto sulla patologia della malattia.
Dopo il frazionamento, i campioni possono essere elaborati in numerosi modi. SDS-PAGE seguita da analisi western blot risolverà mHTT solubili e insolubili specie per fornire una valutazione relativa ai livelli di mHTT specie1. È anche possibile valutare le frazioni in ulteriori saggi biochimici per valutare ulteriormente mHTT specie. Per esempio, l'elettroforesi del gel dell'agarosi (età) può risolvere e rilevare mHTT solubile, oligomerici, mentre un dosaggio di ritardo (FR) del filtro è un potente strumento per rilevare mHTT insolubile, fibrillare specie16,17.
Un ulteriore vantaggio che presenta questa analisi è la valutazione del mislocalization proteina connessa con la patogenesi. Come abbiamo dimostrato in 18, questo protocollo di frazionamento permette la visualizzazione e il monitoraggio delle proteine quali Rangap1, che sembrano essere sequestrato dai grandi aggregati insolubili e potrebbe non risolvere su un gel di pagina standard. Inoltre, questo test serve anche come una separazione nucleare/citoplasmico grezza, uno può misurare anche mislocalization di proteine, per esempio, p65, in HD del mouse modelli1.
Una motivazione prominente per l'analisi di mHTT aggregazione e accumulo è lo sviluppo di nuovi HD diagnostica e terapeutica. Composti che inibiscono o invertire mHTT aggregazione sono stati identificati da schermi di alto-rendimento e test mirati1,12,19,20,21. Tuttavia, data la difficoltà nel risolvere molte delle forme di mHTT, valutazione della modulazione di aggregazione non è sempre stato fattibile. Metodi tradizionali Lisi possono disporre del pellettato detriti cellulari che potenzialmente contengono proteina aggregata insolubile, o buffer di lisi non può contenere abbastanza detersivo per solubilizzazione. Il metodo qui descritto fornisce una piattaforma per isolare e rilevare forma aggregata di mHTT che può essere utilizzato come un indicatore biochimico in cella basata o le valutazioni pre-clinici in vivo .
I saggi qui descritti possono essere applicati ad altre proteine misfolded. A causa della caratteristica dinamica delle proteine misfolded, queste analisi possono essere efficacemente accoppiate con altre analisi di scoprire approfondite meccanismi di omeostasi della proteina e di aggregazione. Queste analisi includono la misura dei livelli allo stato stazionario di aggregati e le relative partizioni in frazioni differenti delle cellule (Figura 1) o l'analisi di proteine pieghevole/aggregazione tramite proteine ricombinanti purificate. Questi saggi aiuterà a distinguere effetti diretti o indiretti di modulazione genetica o farmacologica sulla degradazione proteica o di aggregazione. Basandosi sulla precedente in vitro frazionato a-synuclein aggregazione valutazioni22, abbiamo applicato da allora quest'opera di modelli murini di malattia del Parkinson per risolvere varie conformazioni al-synuclein23. Di conseguenza, protocolli descritti in questo lavoro possono essere applicati ad altri modelli di misfolding e aggregazione e possono contribuire alla scoperta e sviluppo di nuovi protocolli terapeutici aggregati proteici di targeting.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal NIH (RO1-NS090390). Vorremmo anche ringraziare il Dr. Joan Steffanfor assistenza tecnica e discussione durante lo sviluppo di questo test.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
References
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