Summary
On décrit une méthode pour le fractionnement de la huntingtine mutante solubles et insolubles espèces de souris cérébrale et la culture cellulaire. La méthode décrite est utile pour la caractérisation et la quantification des flux de protéine huntingtine et sida en analysant l’homéostasie des protéines dans la pathogenèse de la maladie et en présence de perturbations
Abstract
L’accumulation de protéines mal repliées est au cœur de la pathologie de la maladie de Huntington (MH) et de nombreuses autres maladies neurodégénératives. Plus précisément, une caractéristique pathologique de la HD est l’accumulation aberrante de la protéine mutante de HTT (mHTT) dans des complexes de poids moléculaire élevé et inclusions intracellulaires composé de fragments et d’autres protéines. Les méthodes conventionnelles pour mesurer et comprendre que les contributions des diverses formes de mHTT contenant des agrégats incluent la microscopie en fluorescence, analyse par western blot et filtre piègent essais.
Cependant, la plupart de ces méthodes est la conformation spécifique et donc ne peut pas résoudre l’état complet du flux protéine mHTT en raison de la nature complexe de la solubilité globale et la résolution.
Pour l’identification des mHTT agrégée et les diverses formes modifiées et complexes, la séparation et la solubilisation des agrégats cellulaires et des fragments est obligatoire. Nous décrivons ici une méthode pour isoler et visualiser mHTT soluble, monomères, oligomères, fragments, et un haut poids moléculaire insoluble (HMW) accumulé mHTT espèces. HMW mHTT des pistes avec la progression de la maladie, correspond avec lectures de comportement de la souris et a été bénéficiaire modulée par certaines interventions thérapeutiques1. Cette approche peut être utilisée avec le cerveau de souris, les tissus périphériques et culture cellulaire, mais peut être adaptée à d’autres systèmes modèles ou les contextes de la maladie.
Introduction
La perturbation des réseaux de contrôle de la qualité de protéines qui assurent le repliement adéquat et la dégradation des protéines cellulaires sont probablement centrale au département de pathologie de la maladie d’Alzheimer (ma), maladie de Parkinson (MP), maladie de Huntington (MH) et autres « repliement » troubles de2,3. Une compréhension détaillée des composants réseau protéostasie et de leurs contributions à la pathologie sont donc cruciaux pour développer des interventions thérapeutiques améliorées. HD est causée par la dilatation anormale d’une répétition CAG dans le gène HD résultant dans un tronçon élargi de polyglutamines (polyQ) dans les protéines de la huntingtine (HTT)4. Une caractéristique constante pathologique de la pathogenèse de la HD est la résultante mauvais repliement, l’accumulation et l’agrégation de HTT dans certaines régions du cerveau et dans les tissus périphériques, qui s’est avéré interférer de plusieurs manières avec la fonction et l’homéostasie cellulaire normale 5 , 6. HTT tandis que s’exprime de façon ubiquitaire, moyennes neurones épineux dans le striatum sont sélectivement vulnérables et plus ouvertement touchés avec atrophie corticale notable, également associée à la pathogenèse de la HD.
Un marqueur de proxy pour la progression de la maladie et dominant négatif gain de fonction pour mHTT7a été généralement la formation d’agrégats de HTT dans le cerveau des patients de la HD et des modèles animaux. Bien que les mécanismes précis par quelles protéines mauvais repliement et agrégation peuvent contribuer à la toxicité induite par le mHTT demeurent obscures, la formation de ces inclusions dans le cerveau de patients HD et divers modèles animaux est une caractéristique invariante et inévitable. Inclusions semblent se composent en grande partie d’accumulé HTT fragments contenant du N-terminal élargi polyQ, indiquant que la protéolyse et traitement de pleine longueur HTT ainsi que8,d’épissage alternatif9 peut jouer un un rôle important dans la pathogenèse des fragments HTT HD. N-terminal peut constituer une forme pathologique de HTT pouvant regrouper rapidement, noyaux et accélérer ou propager l’agrégation processus10.
Toutefois, la présence de ces inclusions n’est pas nécessairement proportionnelle avec la toxicité induite par HTT ou cellule mort11. HTT a été proposé de subir un processus d’agrégation d’un monomère soluble par espèce oligomérique soluble et feuillet β fibrilles insolubles des agrégats et des inclusions12. Résoudre ces espèces de protéines différentes via des épreuves biochimiques standards a été un défi dans le domaine en raison de leur stabilité dans le tampon de lyse de la basse-détergent et difficulté à visualiser à l’aide des épreuves biochimiques standards. Ainsi, considérations méthodologiques sont essentielles pour détecter le degré et le mode de mHTT accumulé et agrégée.
Le protocole présenté ici permet de visualiser plusieurs intermédiaires de HTT, spécifiquement la formation d’une espèce de HMW HTT insoluble qui semble suivre de près avec HD pathogenèse et maladie progression1,13 ,14. Être capable de résoudre et de suivre les multiples espèces de mHTT fournit aux chercheurs un outil biochimique pour étudier la pathogenèse de la maladie et évaluer des interventions thérapeutiques potentielles par le biais de leur modulation et leur impact sur la pathogenèse de la maladie.
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Protocol
Énoncé d’éthique animale - expériences ont été réalisées en stricte conformité avec le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes of Health et un protocole de recherche animale approuvés par l’animalier institutionnel et Comité d’urbanisme ( IACUC) à l’Université de Californie, Irvine, un AAALAC accrédités par institution. Tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum les souffrances animales.
1. préparation des mémoires tampons de Lysis
- Préparer « Solubles » tampon de lyse (10 mM Tris pH 7,4, 1 % Triton X 100, 150 mM NaCl, 10 % de glycérol) et filtrer sur filtre à 0,22 µm stérile.
- Pour un tampon de lyse « Solubles » travail, mesurer le N-éthylmaléimide (NEM) et soigneusement dissoudre dans 100 mM phenylmethysulfonyl fluor (PMSF) dissous dans 100 % EtOH.
Remarque : Inhibiteurs de tampon lyse : (i) 20 mM N-éthylmaléimide (NEM) ; (ii) 0,2 mM PMSF ; (iii) 1 mM orthovanadate de Sodium (Na3VO4) ; (iv) 1 µg/mL leupeptine ; (v) 1 µg/mL aprotinine ; (vi) 20 mM le fluorure de Sodium (NaF).
ATTENTION : Porter un masque lorsque vous travaillez avec NEM dans tout le protocole. Tampon de lyse de travail doit être faite frais afin d’assurer des inhibiteurs actifs. - Pour le tampon de lyse soluble avec des inhibiteurs de protéase, ajouter inhibiteurs dans l’ordre suivant : fluorure de Sodium (NaF), au volume avec de tampon de lyse froid, orthovanadate de Sodium (Na3VO +4), aprotinine et leupeptine.
- Pour un tampon de lyse « Solubles » travail, mesurer le N-éthylmaléimide (NEM) et soigneusement dissoudre dans 100 mM phenylmethysulfonyl fluor (PMSF) dissous dans 100 % EtOH.
- Pour « Insoluble » tampon de lyse, complément à 4 % SDS en ajoutant 500 µL de 20 % SDS à 2 mL de tampon de lyse « Soluble ». Laisser à température ambiante.
NOTE : SDS se précipiter lorsqu’ils sont conservés à 4 ° C ; Gardez ceci à température ambiante. Composition de tampon de lyse finale : 10 mM Tris (pH 7,4) ; X-100 de 1 % de Triton ; 150 mM NaCl ; 10 % de glycérol ; 4 % SDS (Insoluble uniquement).
2. solubles/insolubles fractionnement protocole
Remarque : Voir la Figure 1 pour une représentation schématique.
- Deux séries de tubes pour chaque échantillon de l’étiquette : « Soluble » et « Insolubles ».
- Ajouter X-µL glacée travail soluble de tampon de lyse additionné d’inhibiteurs de la protéase (voir point 1.1.1) au tissu.
Remarque : X = Volume varie en fonction des tissus ; Voir le tableau 1. - Pour le tissu de cerveau de souris (c.-à-d., striatum), dounce lentement 30 fois en verre 1 mL douncer et pipette dans « Insoluble » étiqueté tube (restez sur la glace).
Remarque : Veillez à ne pas à briser la surface de liquide après le démarrage de douncing, comme bulles seront forme et peuvent produire une homogénéisation incomplète. - Pour les cellules (c.-à-d., HeLa, HEK293T), rincer les cellules une fois avec le froid, 1 x PBS. Enlever des PBS et appliquer un volume minimal de tampon de lyse aux cellules et soulever avec grattoir de cellules.
Remarque : Pour au-dessus des lignées de cellules, cellules ont été plaqués à 5 x 105 cellules / plaque bien 6 et atteint près de confluence. L’un est bien comparable aux volumes utilisés pour souris striatum. - Transfert de homogénat ou cellule lysat en intitulée, « Insolubles » tubes et lyse sur glace 1 h (horloge après transformée de tube final).
Remarque : Pour les lysats cellulaires, triturer plusieurs fois pour briser les mottes de la cellule avant de commencer l’incubation. Eviter la formation de bulles. Vortex d’impulsion brièvement chaque échantillon pour 1 s au milieu de la lyse. - Centrifuger les échantillons à 4 ° C à 15 000 x g pendant 20 min.
- Récupérer le surnageant comme la fraction « Soluble ».
- Enlever avec la pipette, veillez à ne pas déranger la couche de granulés/nuageux que cela finira par contaminer la fraction. Fraction soluble pipette dans « Soluble » étiqueté tube. Rester sur la glace.
- Laver le culot avec 500 µL de tampon de lyse (x2) et centrifuger à 4 ° C à 15 000 x g pendant 5 min après chaque lavage ; C’est OK si certains de la couche nuageuse est reversé au large.
- Après le lavage final, supprimer tous les tampon de lavage restant, laissant seulement la pastille de tissu.
NOTE : De ce point, insoluble échantillon devra maintenant être conservé à température ambiante. - Granule de remettre avec X-µL de tampon de lyse additionné de 4 % SDS (Volume peut être ajusté selon la taille de granule ; voir tableau 1).
- Soniquer chaque échantillon pendant 30 s à température ambiante avec un sonicateur sonde (125 Watts, 20kHz, impulsion, Amplitude 40 %, voir Table des matières).
- Faire bouillir les échantillons (de roulement ébullition) pendant 30 min ; Centrifuger brièvement (15 s) à 6 000 x g quant à ne pas perdre n’importe quel échantillon.
- Effectuer l’analyse de protéine de DC (détergent compatible) (voir la Table des matières) ou dosage protéique Lowry pour mesurer la concentration de protéines (recommandée a commencé des dilutions de 1/5 de l’échantillon dans un tampon de lyse respectifs pour la culture cellulaire et 1/10 pour lysats de tissu).
Remarque : Les concentrations de protéines devront être lus en utilisant un dosage DC ou Lowry en raison de la forte concentration de détergent. - Échantillons aliquotes en 50 lots µL pour éviter les problèmes de gel-dégel.
NOTE : Protocole peut être suspendue ici avant plus loin l’analyse biochimique en stockant les deux fractions à-20 ° C.
3. quantification et Western Blot
- Effectuer des transferts western comme il est indiqué ailleurs1,13 par dilution de 30 µg d’échantillon 1:1 en chargement tampon (1.6 x colorant, 1 x réduction de chargement).
Remarque : 30 µg de protéines par fraction est suffisante, mais peut être ajustée pour une résolution optimale. 3 - 8 % Tris-acétate poly-acrylamide gels doivent être utilisés pour la fraction insoluble. 4 à gels de bis-Tris de 12 % sont recommandés pour la fraction soluble. - Faire bouillir les échantillons (ébullition) pendant 5 min. Centrifuger brièvement (15 s) à 6 000 x g pour recueillir l’échantillon.
- Analyser les fractions par SDS-PAGE et tache occidentale, selon le protocole du fabricant pour les échantillons réduits.
Remarque : La fraction Insoluble résout mieux lorsqu’il est transféré sur une membrane de nitrocellulose 0,45 µM. 0,45 ou 0,2 nitrocellulose µM peut être utilisé pour la fraction soluble, selon la taille de la protéine d’intérêt. Certaine optimisation peut être exigée pour le meilleur transfert de matériaux HMW. - Souillez membrane avec taches de protéines entières (p. ex., MEMcode, voir la Table des matières) pour visualiser les protéines efficacité de chargement.
Remarque : Les transferts Western peuvent être analysés par intensité moyenne pixel. Fractions solubles peuvent être normalisées à une protéine de ménager mieux adaptée pour le système expérimental. La fraction insoluble comme l’abondance relative de protéines a été vérifiée par coloration réversible des protéines ou Histone 3 normalisation sur la tache distincte.
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Representative Results
Résolution de lysats cellulaires solubles et insolubles après fractionnement peut être détectée à l’aide de tests Ouest analyse et filtre de retard (Figure 2). À titre d’exemple, cellules HEK293T ont été transfectées utilisant le réactif de transfection (p. ex., lipofectamine 2000), avec exon HTT 1 cDNA codant contenant 97 glutamine répète15 suivie de la région riche en proline poly et ces cellules ont été autorisés à Express pour 44 h. cellules ont été traitées avec soit 5 µM MG132 pour bloquer le protéasome ou le DMSO comme un contrôle pour 18 h avant récolte et lysées comme décrit ci-dessus. La suite de protocole de fractionnement, mutant exon HTT 1 résout comme monomère soluble kDa environ 45 % de 4 à 12 Bis-Tris PAGE gélifie et comme une espèce d’accumulé HMW insoluble sur les gels de Tris-acétate PAGE 3 à 8 % (Figure 2 a). Monomère soluble peut être quantifié et normalisé à une protéine de ménager (montré ici comme GAPDH). HMW, mHTT insoluble est quantifié l’abondance relative de protéine par l’intensité moyenne de pixel. Lorsque les traités avec l’inhibiteur MG132, il y a une diminution importante de monomère soluble de mHTT avec une augmentation correspondante de HMW, mHTT insoluble.
Les fractions insolubles peuvent être analysées par des techniques complémentaires tels qu’un essai de filtre un retard pour résoudre l’insoluble, fibrillaire mHTT16 (Figure 2 b). Les cellules HeLa ont été transfectées de même que ci-dessus avec exon 1, de la 97Q-HTT et His-SUMO-1 ou son-SUMO-2. Cellules ont été traités par du DMSO ou MG132 pendant 18 heures avant fractionnement et analysés par la tache occidentale et filtre un retard dosages. Les données montrent que la présence de l’isoforme SUMO surexprimée augmente HMW et fibrillaire insoluble mHTT. Ajout de MG132 exacerbe l’augmentation des espèces mHTT insoluble. Espèces de mHTT HWM peuvent aussi être modulées par une surexpression ou une réduction de la cible de la maladie de HD, PIAS1 dans les deux HeLa cellules13 et souris striata1 (Figure 2-D). Précipitation de PIAS1 dans le modèle murin progresse rapidement de la HD, la R6/2, à l’aide de livraison viral d’un siARN contre PIAS1, réduit l’accumulation de HMW mHTT insoluble. Surexpression virale de PIAS1 chez les souris R6/2 conduit à un augmentation notable du nombre HMW mHTT insoluble (Figure 2D)1. Le changement de solubilité entre fractions est quantifiable et indique que ce protocole permet de suivre la modulation des espèces pathogènes protéines mutantes, ce qui en fait une technique appropriée pour les évaluations précliniques biochimiques de l’intervention de la maladie. Changements dans insoluble, espèce fibrillaire de mHTT également capture flux entre espèces de protéines qui sont modulées par un traitement avec MG132 ou règlement de cibles thérapeutiques potentielles, telles que PIAS11.
Figure 1 : solubles/insolubles fractionnement protocole et protéine résolution. (A) le pipeline Visual pour protocole de fractionnement. Le protocole décrit ici peut être appliqué à des échantillons de culture tissulaire ou cellulaire souris mais convient pour adaptation à d’autres types d’échantillon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : représentant les résultats d’analyses et de fractionnements Soluble et Insoluble. Fractions (A) Soluble et Insoluble de lysats de cellules HEK293T résolus sur un 4-12 % Bis-Tris et gels de Tris-acétate PAGE 3 à 8 %, respectueusement. Fraction soluble normalisée à GAPDH chargement contrôle montre fluctuation du monomère soluble de mHTT exon 1 basé sur l’exposition aux MG132. La fraction insoluble montre qu’espèce accumulé HMW de mHTT est également modulée par MG132 traitement. (B) analyse des fractions solubles et insolubles de lysats de cellules HeLa, à l’aide d’analyses de retard western blot et filtre : les cellules HeLa ont été transfectées avec His-SUMO-1 ou SUMO-2 et/ou 97Q-HTT exon 1 et traitées avec 5 µM MG132 pour 18 hr.* (C) Soluble et insoluble fractionnement de cellules HeLa surexprimant 97Q-HTT exon 1 et soit surexprimée PIAS1 ou traités avec un siARN contre PIAS1 Voir la réglementation de l’accumulation mHTT HMW après modulant un target.* potentiel thérapeutique (D) Les fractions insolubles de souris striata traitement avec microARN contre PIAS1 et résolus sur 3 à 8 % Tris-acétate PAGE gels Voir la modulation de la HWM insoluble mHTT **. Panneaux (B-C) ont été modifiés avec permission13. Panneau (D) a été modifiée avec autorisation1. * Tiré à O'Rourke et al. 13 avec permission. ** tiré à Ochaba et al. 1 avec la permission de Elsevier. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Tissu (par hémisphère) | Poids approximatif (mg) | Soluble de volume (µL) | Insoluble volume (µL) |
| souris Striatum | 30 | 250 | 150 |
| souris de Cortex | 100 | 500 | 250 |
| souris hippocampe | 30 | 250 | 150 |
| Cervelet de souris | 40 | 250 | 150 |
| souris le muscle squelettique * | 100 | 300 | 150 |
| souris du foie (lobe) | 100 | 400 | 200 |
| * tissu conjonctif forme interface laiteux ; supprimer pour éviter toute contamination | |||
Tableau 1 : propose des volumes (X) pour le fractionnement de tissu-spécifique pour les deux tampons de lyse solubles et insolubles. Volume de tampon de lyse insoluble issu à partir de quantité de matière, qui peut être ajusté en conséquence selon la taille de granule insolubles.
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Discussion
Quelques précautions sont nécessaires pour les protocoles ci-dessus garantir des résultats cohérents et quantitatives. Tout d’abord, mHTT dans les deux fractions sera spontanément forment des agrégats au fil du temps sur plusieurs cycles de gel dégel, notamment lorsque, dans une concentration élevée. Il est donc essentiel pour geler les aliquotes des protéine preps et décongeler uniquement le volume nécessaire avant d’exécuter l’essai tel que décrit dans le protocole ci-dessus. En outre, si la fraction insoluble donne blanc précipitant après décongélation, reconstitution peut être nécessaire par un supplémentaire 5 s sonication pulse, faire bouillir 5 min et re-quantification avant l’analyse par l’intermédiaire des épreuves biochimiques.
Résolution quantitative avec ce test est réalisable en normalisant l’intensité moyenne de pixel de la fraction soluble à celle d’un contrôle de chargement ou de la gène de ménager au sein de chaque échantillon. Comme indiqué ici, GAPDH a été utilisé comme un gène de ménager pour la fraction soluble comme elle se localise principalement dans le cytosol (Figure 1). Autres protéines ménager couramment utilisés sont l’actine, α-tubuline et Erk 1/2. Cependant, les protéines de normalisation appropriés doivent être optimisés pour le système à l’étude afin d’assurer l’expression état d’équilibre pour la normalisation précise et sans influence. Tandis que la fraction insoluble sert une fraction nucléaire brute comme en témoigne la présence de l’histone 3 et absence de GAPDH1, résolution sur 3 à 8 % PAGE gélifie limites détectabilité à couramment utilisé des marqueurs nucléaires. Par conséquent, la fraction insoluble est adaptée pour la quantification en utilisant la valeur d’intensité de signal brut comme une représentation relative de l’abondance de la protéine. Toutefois, des marqueurs de protéines entières, telles que les taches de protéines réversible, servent au contrôle des variations de protéine de chargement et peuvent être adaptés comme un facteur de normalisation pour la fraction insoluble.
En outre, fractionnement fournit un moyen de résoudre les espèces mHTT solubles et insolubles, mHTT subit de nombreux changements conformationnels tout au long de la pathogenèse de la maladie, dont certains ne seront pas reconnaissables dans la fraction insoluble. En outre, certaines conformations peuvent contribuer avantageusement issue de la maladie et agir comme intermédiaires de dégagement stable. Il est donc important d’identifier les autres conformères mHTT qui sont en corrélation avec les résultats de la pathogenèse. Certaine optimisation peut être nécessaire pour visualiser les autres intermédiaires mHTT. Pour y remédier, pourcentage de SDS peut être augmentée à 20 % si l’agrégat est résistant à des concentrations plus faibles.
Ce protocole montre les conditions de fractionnement des protéines et des essais qui en résulte qui détectent les différentes conformations et fragments de mHTT accumulation et agrégation en culture cellulaire et un modèle de souris transgénique de HD. Ce type d’isolement de la protéine biochimique est envisagé pour l’évaluation de la progression de la maladie dans d’autres modèles de HD et peut contribuer à la compréhension croissante de mHTT dynamique au sein de la cellule et leur impact sur la maladie.
Après fractionnement, les échantillons peuvent être traitées de plusieurs façons. SDS-PAGE, suivie par l’analyse par western blot résoudra espèces mHTT solubles et insolubles pour fournir une évaluation relative sur les niveaux de mHTT espèce1. Il est également possible d’évaluer des fractions dans des épreuves biochimiques supplémentaires afin d’évaluer davantage les espèces mHTT. Par exemple, électrophorèse sur gel d’agarose (AGE) peut résoudre et détecter mHTT soluble, oligomère, alors qu’un essai de retard (FR) du filtre est un outil puissant pour détecter mHTT insoluble, fibrillaire espèces16,17.
Un autre avantage que présente ce dosage est l’évaluation du niveau de protéine associée de pathogenèse. Comme nous avons démontré dans le 18, ce protocole de fractionnement permet la visualisation et le suivi des protéines telles que Rangap1, qui semblent être séquestré par les grands agrégats insolubles et ne peuvent pas résoudre sur un gel de PAGE standard. En outre, comme cet essai sert également une séparation nucléaire/cytoplasmique brute, un peut aussi jauge niveau de protéines, par exemple, p65, en HD souris modèles1.
Une motivation importante pour l’analyse d’agrégation mHTT et accumulation est le développement de nouveaux diagnostics de HD et de thérapeutique. Composés qui inhibent ou inverser mHTT agrégation ont été identifiés dans les écrans de haut débit et des tests ciblés1,12,19,20,21. Toutefois, compte tenu de la difficulté à résoudre beaucoup de formes de mHTT, évaluation de la modulation de l’agrégation n'a pas toujours été possible. Les méthodes traditionnelles de lyse peuvent disposer de granulés débris cellulaires qui contiennent potentiellement insoluble agrégation protéique, ou mémoires tampons de lysis ne peuvent pas contenir assez de détergent de solubilisation. La méthode décrite ici fournit une plate-forme pour isoler et détecter une forme agrégée de mHTT qui peut être utilisé comme un marqueur biochimique en cellule en fonction d’ou des évaluations précliniques in vivo .
Les tests décrits ici peuvent être appliqués à d’autres protéines mal repliées. En raison de la fonction dynamique des protéines mal repliées, ces tests peuvent être efficacement couplés avec d’autres analyses afin de découvrir les mécanismes approfondies de l’homéostasie de la protéine et l’agrégation. Ces analyses comprennent mesurant les niveaux de l’état stationnaire des agrégats et leurs partitions dans les fractions cellulaires différentes (Figure 1) ou l’analyse des protéines pliage/agrégation à l’aide de protéines recombinantes purifiées. Ces tests vont aidera à distinguer les effets directs ou indirects de modulation génétique ou pharmacologique sur la dégradation des protéines ou de l’agrégation. S’appuyant sur des précédents in vitro a-synucléine fractionné agrégation évaluations22, nous appliquons depuis ce travail de modèles murins de la maladie de Parkinson pour résoudre les différentes conformations d’a-synucléine23. Par conséquent, protocoles décrits dans cet ouvrage peuvent être appliquées à d’autres modèles de repliement et d’agrégation et peuvent contribuer à la découverte et le développement de nouvelles thérapeutiques ciblant les protéines agrégées.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les NIH (RO1-NS090390). Nous tenons également à remercier le Dr Joan Steffanfor assistance technique et la discussion lors de l’élaboration de ce test.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
References
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