Summary
एक विधि माउस मस्तिष्क और कोशिका संस्कृति से अघुलनशील और घुलनशील उत्परिवर्ती huntingtin प्रजातियों के अंश के लिए वर्णित है । वर्णित विधि लक्षण वर्णन और huntingtin प्रोटीन प्रवाह और एड्स रोग रोगजनन में प्रोटीन homeostasis का विश्लेषण करने में और perturbations की उपस्थिति में ठहराव के लिए उपयोगी है
Abstract
Huntington के रोग (एचडी) और कई अन्य neurodegenerative विकारों में विकृति के लिए केंद्रीय प्रोटीन के संचय का केंद्र है । विशेष रूप से, HD के एक प्रमुख रोग सुविधा उच्च आणविक भार परिसरों में उत्परिवर्ती HTT (mHTT) प्रोटीन का ंयायपालिका संचय और टुकड़े और अन्य प्रोटीन से बना intracellular समावेश निकायों है । पारंपरिक तरीकों को मापने के लिए और mHTT-युक्त समुच्चय के विभिंन रूपों के योगदान को समझने प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, पश्चिमी दाग विश्लेषण, और फिल्टर जाल परख शामिल हैं ।
हालांकि, इन तरीकों की सबसे विशिष्ट अनुरूप हैं, और इसलिए समग्र घुलनशीलता और संकल्प के जटिल प्रकृति के कारण mHTT प्रोटीन प्रवाह का पूरा राज्य हल नहीं हो सकता है ।
एकत्रित mHTT और विभिन्न संशोधित रूपों और परिसरों की पहचान के लिए, सेलुलर समुच्चय और टुकड़ों के पृथक्करण और solubilization अनिवार्य है । यहां हम एक विधि का वर्णन करने के लिए अलग और घुलनशील mHTT, मोनोमर, oligomers, टुकड़े कल्पना, और एक अघुलनशील उच्च आणविक वजन (HMW) संचित mHTT प्रजातियों । HMW mHTT रोग प्रगति के साथ पटरियों, माउस व्यवहार readouts के साथ मेल खाती है, और लाभप्रद रूप से कुछ चिकित्सीय हस्तक्षेप द्वारा संग्राहक किया गया है1। इस दृष्टिकोण माउस मस्तिष्क, परिधीय ऊतकों, और कोशिका संस्कृति के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन अंय मॉडल प्रणालियों या रोग संदर्भों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण नेटवर्क है कि उचित तह और सेलुलर प्रोटीन की गिरावट सुनिश्चित करने के व्यवधान अल्जाइमर रोग (विज्ञापन), पार्किंसंस रोग (पीडी), Huntington के रोग (एच. डी.), और अंय "प्रोटीन का खुलासा में विकृति के लिए केंद्रीय संभावना है" विकारों2,3. proteostasis नेटवर्क घटकों की एक विस्तृत समझ और विकृति के लिए उनके योगदान इसलिए सुधार चिकित्सकीय हस्तक्षेप विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । hd जीन के भीतर एक सीएजी दोहराने की असामांय विस्तार के कारण होता है polyglutamines (polyQ) huntingtin (HTT) प्रोटीन4में एक विस्तारित खिंचाव के परिणामस्वरूप । HD रोगजनन की एक सुसंगत रोग सुविधा जिसके परिणामस्वरूप, संचय, और मस्तिष्क के क्षेत्रों में और परिधीय ऊतकों में HTT के एकत्रीकरण, जो सामान्य कोशिका homeostasis और समारोह के साथ कई मायनों में हस्तक्षेप करने के लिए दिखाया गया है 5 , 6. जबकि HTT बैरे व्यक्त की है, striatum में मध्यम कंटीला ंयूरॉंस चुनिंदा कमजोर कर रहे है और सबसे खुलकर उल्लेखनीय cortical भी HD रोगजनन के साथ जुड़े शोष के साथ प्रभावित ।
HD रोगियों और जानवरों के मॉडलों के मस्तिष्क में HTT के समुच्चय के गठन आम तौर पर रोग प्रगति और mHTT के लिए समारोह के प्रमुख नकारात्मक लाभ के लिए एक प्रॉक्सी मार्कर के रूप में सेवा की है7. हालांकि सटीक तंत्र है जिसके द्वारा प्रोटीन का खुलासा और एकत्रीकरण mHTT-प्रेरित विषाक्तता में योगदान कर सकते हैं स्पष्ट नहीं रह, HD रोगियों और विभिन्न पशु मॉडलों के मस्तिष्क में इन समावेशियों के गठन एक अपरिवर्तनीय और अपरिहार्य विशेषता है. शामिल किए जाने के लिए मोटे तौर पर जमा HTT टुकड़े के शामिल एन टर्मिनल विस्तारित polyQ, संकेत है कि प्रोटियोलिसिस और पूर्ण लंबाई HTT के प्रसंस्करण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वैकल्पिक ब्याह8,9 खेल सकते हैं । HD. N-टर्मिनल HTT अंशों के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका HTT का एक रोग रूप का गठन कर सकती है जो एकत्रीकरण प्रक्रिया को तेजी से, nucleate, और तेज या प्रचारित कर सकते हैं10।
हालांकि, इन समावेशी की उपस्थिति जरूरी HTT-प्रेरित विषाक्तता या कोशिका मृत्यु11के साथ सहसंबंधी बनाना नहीं है । HTT घुलनशील oligomeric प्रजातियों और β-पत्रक तंतुओं के माध्यम से घुलनशील मोनोमर से एक एकत्रीकरण प्रक्रिया से गुजरना अघुलनशील समुच्चय और शामिल करने के लिए प्रस्तावित किया गया है12. मानक जैव रासायनिक परख के माध्यम से इन विभिंन प्रोटीन प्रजातियों को हल कम-डिटर्जेंट lysis बफर और मानक जैव रासायनिक परख का उपयोग visualizing में कठिनाई में उनके स्थायित्व के कारण क्षेत्र में एक चुनौती रही है । इस प्रकार, methodological विचार और संचित और एकत्रित mHTT की डिग्री और पैटर्न का पता लगाने में महत्वपूर्ण हैं ।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल HTT के कई मध्यवर्ती कल्पना करने के लिए एक विधि प्रदान करता है, विशेष रूप से HD रोगजनन और रोग प्रगति के साथ बारीकी से ट्रैक करने के लिए प्रकट होता है कि एक अघुलनशील HMW HTT प्रजातियों के गठन1,13 ,14. को हल करने और mHTT के कई प्रजातियों को ट्रैक करने में सक्षम होने के नाते एक जैव रासायनिक उपकरण रोग रोगजनन अध्ययन और रोग रोगजनन पर उनके मॉडुलन और प्रभाव के माध्यम से संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप का मूल्यांकन करने के लिए प्रदान करता है.
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Protocol
पशु नैतिकता विवरण-प्रयोगों की देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों और एक अनुमोदित पशु अनुसंधान प्रोटोकॉल के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के साथ सख्त अनुसार में किए गए थे ( IACUC) कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन, एक AAALAC मांयता प्राप्त संस्थान में । सभी प्रयास पशु दुख को कम करने के लिए किए गए ।
1. Lysis बफ़र्स की तैयारी
- तैयार "घुलनशील" lysis बफर (10 मिमी Tris पीएच ७.४, 1% ट्राइटन-X १००, १५० मिमी NaCl, 10% ग्लिसरॉल) और बाँझ फिल्टर के माध्यम से ०.२२ µm फिल्टर.
- एक काम "घुलनशील" lysis बफर के लिए, उपाय N-Ethylmaleimide (NEM) और अच्छी तरह से भंग में १०० mM phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) १००% ेतोः में भंग ।
नोट: Lysis बफर अवरोधकों: (i) 20 मिमी N-ethylmaleimide (NEM); (ii) ०.२ mM PMSF; (iii) 1 मिमी सोडियम orthovanadate (Na3VO4); (iv) 1 µ g/मब leupeptin; (v) 1 µ g/मब aprotinin; (vi) 20 मिमी सोडियम फ्लोराइड (NaF).
चेतावनी: एक चेहरा मुखौटा पहनते है जब प्रोटोकॉल भर में NEM के साथ काम कर रहे । सक्रिय अवरोधकों सुनिश्चित करने के लिए कार्य lysis बफ़र ताज़ा किया जाना चाहिए । - को छेड़ने वाले अवरोधकों के साथ घुलनशील lysis बफर के लिए, निम्नलिखित क्रम में अवरोधकों जोड़: सोडियम फ्लोराइड (NaF), कोल्ड lysis बफर के साथ मात्रा तक, सोडियम orthovanadate (Na3VO4), Aprotinin, और Leupeptin.
- एक काम "घुलनशील" lysis बफर के लिए, उपाय N-Ethylmaleimide (NEM) और अच्छी तरह से भंग में १०० mM phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) १००% ेतोः में भंग ।
- "अघुलनशील" lysis बफ़र के लिए, ५०० µ l को जोड़कर 4% एसडीएस के लिए पूरक "घुलनशील" lysis बफ़र की 2 मिलीलीटर के लिए 20% एसडीएस. कमरे के तापमान पर छोड़ दें ।
नोट: एसडीएस जब 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा बाहर हाला जाएगा; इस कमरे में अस्थाई रखें । अंतिम Lysis बफर रचना: 10 मिमी Tris (पीएच ७.४); 1% ट्राइटन X-१००; १५० मिमी NaCl; 10% ग्लिसरॉल; 4% एसडीएस (केवल अघुलनशील) ।
2. घुलनशील/अघुलनशील भिन्नीकरण प्रोटोकॉल
नोट: किसी योजनाबद्ध के लिए चित्र 1 देखें ।
- लेबल प्रत्येक नमूने के लिए ट्यूबों के दो सेट: "घुलनशील" और "अघुलनशील."
- जोड़ें X-बर्फ के µ एल ठंडा काम घुलनशील lysis बफर के साथ पूरक है चिढ़ाने के लिए (1.1.1 देखें) ऊतक के लिए ।
नोट: एक्स = मात्रा ऊतक राशि के आधार पर बदलता है; तालिका 1देखें । - माउस मस्तिष्क ऊतक (यानी, striatum) के लिए, dounce धीरे ग्लास 1 मिलीलीटर douncer में 30 बार और प्लास्टिक में "अघुलनशील" लेबल ट्यूब (बर्फ पर रखें) ।
नोट: douncing शुरू करने के बाद तरल की सतह को तोड़ने के लिए नहीं सावधान रहना, के रूप में बुलबुले फार्म और अधूरा homogenization उपज हो सकता है । - कोशिकाओं के लिए (यानी, हेला, HEK293T), ठंड, 1x पंजाबियों के साथ एक बार कुल्ला कोशिकाओं । पंजाबियों को हटाने और कोशिकाओं को lysis बफर की न्यूनतम मात्रा लागू करते हैं और सेल खुरचनी के साथ उठा ।
नोट: सेल लाइनों के ऊपर के लिए, कोशिकाओं पर चढ़ाया गया 5 x 105 कोशिकाओं के अनुसार 6 अच्छी तरह से थाली और पास करने के लिए विकसित करने के लिए । एक अच्छी तरह से माउस striatum के लिए इस्तेमाल किया संस्करणों के तुलनीय है । - स्थानांतरण homogenate या कक्ष lysate में लेबल, "अघुलनशील" ट्यूबों और बर्फ 1 ज पर लाइसे (अंतिम ट्यूब के बाद शुरू घड़ी संसाधित है) ।
नोट: सेल lysates के लिए, कई बार triturate को मशीन शुरू करने से पहले सेल के झुरमुट को तोड़ने के लिए । बुलबुले के गठन से बचें । संक्षेप भंवर पल्स 1 के लिए प्रत्येक नमूने आधे रास्ते lysing के माध्यम से । - 20 मिनट के लिए १५,००० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने केंद्रापसारक ।
- "घुलनशील" अंश के रूप में supernatant पुनर्प्राप्त करें ।
- प्लास्टिक के साथ निकालें, सावधान करने के लिए गोली/बादल परत परेशान नहीं के रूप में इस अंश दूषित होगा । प्लास्टिक घुलनशील अंश में "घुलनशील" लेबल ट्यूब. बर्फ पर रखो ।
- lysis बफर (x2) के ५०० µ एल के साथ धो गोली और प्रत्येक धोने के बाद 5 मिनट के लिए १५,००० x g पर 4 ° c पर केंद्रापसारक; यह ठीक है अगर बादलों की परत के कुछ pipetted बंद है ।
- अंतिम धोने के बाद, केवल ऊतक गोली छोड़ने सभी शेष धोने बफर निकालें.
नोट: इस बिंदु से, अघुलनशील नमूनों को अब कमरे के तापमान पर रखा जाना चाहिए । - एक्स के साथ गोली reसस्पेंड-µ एल lysis बफर 4% एसडीएस के साथ पूरक (मात्रा गोली के आकार के आधार पर समायोजित किया जा सकता है; तालिका 1देखें) ।
- एक जांच sonicator (१२५ वाट, 20 kHz, पल्स, आयाम ४०% के साथ कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए प्रत्येक नमूने Sonicate, सामग्री की तालिकादेखें).
- फोड़ा नमूने (रोलिंग फोड़) 30 मिनट के लिए; ६,००० एक्स जी पर संक्षेप में (15 एस) के रूप में किसी भी नमूना खोना नहीं है ।
- प्रदर्शन डीसी (डिटर्जेंट संगत) प्रोटीन परख ( सामग्री की तालिकादेखें) या Lowry प्रोटीन परख प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए (सिफारिश की कमजोर पड़ने की शुरुआत की 1/5 नमूना के लिए संबंधित lysis बफर में सेल संस्कृति और 1/10 ऊतक lysates के लिए) ।
नोट: प्रोटीन सांद्रता के लिए एक डीसी या Lowry उच्च डिटर्जेंट एकाग्रता के कारण परख का उपयोग कर पढ़ा होगा । - फ्रीज-गल मुद्दों से बचने के लिए ५० µ एल बैचों में नमूने Aliquot ।
नोट: प्रोटोकॉल-20 डिग्री सेल्सियस पर दोनों भागों भंडारण द्वारा आगे जैव रासायनिक विश्लेषण करने से पहले यहां रुका जा सकता है ।
3. वेस्टर्न ब्लाटर और ठहराव
- कहीं सूचना के रूप में पश्चिमी दाग प्रदर्शन1,13 कमजोर द्वारा 30 लोड हो रहा है बफर में नमूना 1:1 के µ जी (1.6 x लोड हो रहा है डाई, 1x को कम करने) ।
नोट: अंश प्रति प्रोटीन की 30 µ जी पर्याप्त है, लेकिन इष्टतम संकल्प के लिए समायोजित किया जा सकता है । अघुलनशील अंश के लिए 3-8% Tris-एसीटेट पाली-acrylamide जैल का प्रयोग करना चाहिए । 4-12% बीआईएस-Tris जैल घुलनशील अंश के लिए सिफारिश कर रहे हैं । - नमूने को इकट्ठा करने के लिए (15 एस) ६,००० x g पर 5 min. केंद्रापसारक के लिए नमूनों (रोलिंग उबाल) उबाल लें ।
- एसडीएस द्वारा अंशों का विश्लेषण-पृष्ठ और पश्चिमी दाग, कम नमूनों के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ।
नोट: अघुलनशील अंश का निराकरण सबसे अच्छा जब ०.४५ µ m nitrocellulose झिल्ली पर स्थानांतरित । ०.४५ या ०.२ µ मीटर nitrocellulose घुलनशील अंश के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ब्याज के प्रोटीन के आकार पर निर्भर करता है । कुछ अनुकूलन HMW सामग्री का सबसे अच्छा हस्तांतरण के लिए आवश्यक हो सकता है । - पूरे प्रोटीन के साथ दाग झिल्ली दाग (जैसे, MEMcode, सामग्री की तालिकादेखें) को प्रोटीन लदान दक्षता कल्पना ।
नोट: पश्चिमी दाग मतलब पिक्सेल तीव्रता से विश्लेषण किया जा सकता है । घुलनशील अंश एक घर रखने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है प्रोटीन सबसे प्रयोगात्मक प्रणाली के लिए उपयुक्त । सापेक्ष प्रोटीन बहुतायत के रूप में अघुलनशील अंश प्रतिवर्ती प्रोटीन धुंधला या अलग दाग पर हिस्टोन 3 सामांय द्वारा सत्यापित किया गया था ।
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Representative Results
घुलनशील और अघुलनशील कोशिका lysates के समाधान निम्न अंश पश्चिमी विश्लेषण और फ़िल्टर मंदता परख (चित्र 2) का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है । उदाहरण के रूप में, HEK293T कक्ष अभिकर्मक रिएजेंट (उदा., lipofectamine २०००) का उपयोग करते हुए transfected थे, जिसमें HTT एक्सॉन 1 एंकोडिंग सीडीएनए है जिसमें ९७ glutamine दोहराता है15 पाली की रेखा संपंन क्षेत्र के बाद, और इन कोशिकाओं को अनुमति दी गई ४४ एच कोशिकाओं के लिए एक्सप्रेस या तो 5 µ एम MG132 के साथ इलाज किया गया proteasome या DMSO के लिए एक नियंत्रण के रूप में 18 एच के लिए पहले फसल और ऊपर वर्णित के रूप में लीजड ड ब्लॉक । निंनलिखित आंशिकीकरण प्रोटोकॉल, उत्परिवर्ती HTT एक्सॉन 1 4-12% बीआईएस पर ४५ केडीए के आसपास एक घुलनशील मोनोमर के रूप में हल करता है-Tris पेज जैल और 3-8% HMW-Trisपेज जैल(चित्रा 2a) पर एक एसीटेट अघुलनशील संचित प्रजातियों के रूप में. घुलनशील मोनोमर एक घर में प्रोटीन रखने के लिए quantified और सामान्यीकृत किया जा सकता है (GAPDH के रूप में यहां दिखाया गया है) । HMW, अघुलनशील mHTT मतलब पिक्सेल तीव्रता से रिश्तेदार प्रोटीन बहुतायत के रूप में quantified है । जब अवरोधक MG132 के साथ इलाज किया, वहां HMW में एक इसी वृद्धि, अघुलनशील mHTT के साथ साथ mHTT के घुलनशील मोनोमर में एक नजर कमी है ।
अघुलनशील भिंन एक फिल्टर मंदता परख के रूप में अतिरिक्त तकनीक द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है अघुलनशील को हल करने के लिए, fibrillar mHTT 16 (चित्रा बी3 ) । हेला कोशिकाएं इसी तरह transfected 97Q-HTT एक्सॉन 1 के साथ ऊपर के रूप में थीं और या तो उनकी-सूमो-1 या उनकी-सूमो-2 । कोशिकाओं को या तो DMSO या MG132 के साथ 18 एच के लिए आंशिक रूप से पहले इलाज किया गया और पश्चिमी दाग और फिल्टर मंदता परख का उपयोग विश्लेषण । डेटा से पता चलता है कि एक्सप्रेस सूमो isoform की उपस्थिति दोनों HMW और fibrillary अघुलनशील mHTT बढ़ जाती है । MG132 के अलावा अघुलनशील mHTT प्रजातियों में वृद्धि बढ़ जाती है । HWM mHTT प्रजातियों को भी व्यक्त या HD रोग लक्ष्य की कमी, दोनों हेला कोशिकाओं में13 और माउस striata1 (चित्रा 2c-डी) में PIAS1 द्वारा संग्राहक जा सकता है । HD के तेजी से प्रगति माउस मॉडल में PIAS1 के पछाड़ना, R6 के खिलाफ एक सिरना के वायरल वितरण का उपयोग कर, PIAS1 अघुलनशील HMW का संचय कम कर देता है । R6/2 चूहों में PIAS1 के वायरल एक्सप्रेस HMW अघुलनशील mHTT (चित्र 2d)1में एक उल्लेखनीय वृद्धि की ओर जाता है । अंशों के बीच घुलनशीलता में परिवर्तन quantifiable है और इंगित करता है कि इस प्रोटोकॉल रोगजनक उत्परिवर्ती प्रोटीन प्रजातियों के मॉडुलन ट्रैक कर सकते हैं, इस रोग के हस्तक्षेप के पूर्व नैदानिक जैव रासायनिक आकलन के लिए एक उपयुक्त तकनीक बना रही है । mHTT की अघुलनशील, fibrillar प्रजातियों में परिवर्तन भी प्रोटीन प्रजातियों के बीच प्रवाह पर कब्जा है कि MG132 या संभावित चिकित्सीय लक्ष्य के विनियमन के साथ उपचार द्वारा संग्राहक है, जैसे कि PIAS11के रूप में ।
चित्र 1: घुलनशील/अघुलनशील अंश प्रोटोकॉल और प्रोटीन रिज़ॉल्यूशन । (A) भिंन प्रोटोकॉल के लिए दृश्य पाइपलाइन । प्रोटोकॉल यहां वर्णित माउस ऊतक या कोशिका संस्कृति के नमूनों पर लागू किया जा सकता है, लेकिन अंय नमूना प्रकार के अनुकूलन के लिए उपयुक्त है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: घुलनशील और अघुलनशील भिन्नताओं और विश्लेषणों के लिए प्रतिनिधि परिणाम. (क) HEK293T कोशिका lysates से घुलनशील और अघुलनशील भिन्नताओं को 4-12% बीआईएस-Tris और 3-8% Tris-एसीटेट पेज जैल, सम्मान पर हल किया गया. घुलनशील अंश GAPDH लोड हो रहा है नियंत्रण करने के लिए सामान्यीकृत mHTT एक्सॉन के उतार-चढ़ाव से पता चलता है 1 घुलनशील मोनोमर MG132 के लिए जोखिम के आधार पर. अघुलनशील अंश से पता चलता है कि mHTT की HMW संचित प्रजाति भी MG132 उपचार द्वारा संग्राहक है । (ख) पश्चिमी दाग और फिल्टर मंदता विश्लेषण का उपयोग करते हुए हेला कोशिका lysates से घुलनशील और अघुलनशील अंशों का विश्लेषण: हेला कोशिकाएं transfected के साथ उनकी-सूमो-1 या सूमो-2 और/या 97Q-HTT एक्सॉन 1 और इलाज के साथ 5 µ m MG132 के लिए 18 hr. * (C) हेला कोशिकाओं से घुलनशील और अघुलनशील अंश 97Q-HTT एक्सॉन 1 और या तो व्यक्त PIAS1 या सिरना PIAS1 संचय के HMW शो विनियमन के खिलाफ एक mHTT के साथ एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य संग्राहक के बाद इलाज किया । * (D) PIAS1 के खिलाफ microRNA के साथ इलाज माउस striata से अघुलनशील अंश और एसीटेट अघुलनशील HWM * * के 3-8% Tris-mHTT पृष्ठ जैल शो मॉडुलन पर हल किया । पैनलों (बी-सी) की अनुमति13के साथ संशोधित किया गया है । कक्ष (D) को अनुमति1के साथ संशोधित किया गया है । * ट्विटर एट अलसे पुनर्मुद्रित । 13 अनुमति के साथ । * * Ochaba एट अल से पुनर्मुद्रित । 1 Elsevier से अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| ऊतक (प्रति गोलार्द्ध) | अनुमानित वजन (mg) | मात्रा में घुलनशील (µ एल) | मात्रा अघुलनशील (µ l) |
| माउस Striatum | 30 | २५० | १५० |
| माउस प्रांतस्था | १०० | ५०० | २५० |
| माउस हिप्पोकैम्पस | 30 | २५० | १५० |
| माउस सेरिबैलम | ४० | २५० | १५० |
| माउस कंकाल की मांसपेशी * | १०० | ३०० | १५० |
| माउस जिगर (पालि) | १०० | ४०० | २०० |
| * संयोजी ऊतक रूपों मिल्की इंटरफेस; दूषण से बचने के लिए निकालें | |||
तालिका 1: घुलनशील और अघुलनशील lysis बफ़र्स दोनों के लिए ऊतक-विशिष्ट भिन्नीकरण के लिए सुझाए गए खंड (X) । अघुलनशील lysis बफर मात्रा सामग्री है, जो तदनुसार अघुलनशील गोली आकार के आधार पर समायोजित किया जा सकता है की राशि शुरू करने के आधार पर ।
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Discussion
उपर्युक्त प्रोटोकॉल के लिए कुछ सावधानियों की जरूरत के लिए संगत और मात्रात्मक परिणाम सुनिश्चित कर रहे हैं । सबसे पहले, दोनों भागों में mHTT अनायास कई फ्रीज गल चक्र पर समय के साथ समुच्चय फार्म होगा, विशेष रूप से जब एक उच्च एकाग्रता में । यह इस प्रकार के लिए प्रोटीन की तैयारी के aliquots फ्रीज महत्वपूर्ण है, और गल केवल जरूरत मात्रा के ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में परख चलाने से पहले । इसके अलावा, अगर अघुलनशील अंश पैदावार सफेद precipitant गल पर, पुनर्गठन एक अतिरिक्त 5 एस sonication पल्स, 5 मिनट उबाल, और पुनः quantitation से पहले जैव रासायनिक परख के माध्यम से विश्लेषण करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
इस परख के लिए मात्रात्मक संकल्प घुलनशील अंश का मतलब पिक्सेल तीव्रता को सामान्य करने से प्राप्त होता है कि एक लोडिंग नियंत्रण या घर के प्रत्येक नमूने के भीतर जीन रखने. के रूप में यहां दिखाया गया है, GAPDH घुलनशील अंश के लिए एक घर रखने जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था के रूप में यह मुख्य रूप से cytosol को स्थानीयकरण (चित्रा 1) । अन्य आमतौर पर इस्तेमाल किया घर रखने वाले प्रोटीन actin, α-tubulin, और Erk 1/2 हैं । हालांकि, उपयुक्त सामांयीकरण प्रोटीन प्रणाली के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए के लिए सटीक और प्रभावित सामांय के लिए स्थिर राज्य अभिव्यक्ति सुनिश्चित अध्ययन किया जा रहा है । जबकि अघुलनशील अंश हिस्टोन 3 की उपस्थिति और GAPDH1, 3-8% पृष्ठ जैल पर संकल्प की कमी के रूप में एक कच्चे परमाणु अंश के रूप में कार्य करता है आमतौर पर इस्तेमाल किया परमाणु मार्करों के लिए पता लगाने की सीमा । इसलिए, अघुलनशील अंश प्रोटीन बहुतायत के सापेक्ष प्रतिनिधित्व के रूप में कच्चे संकेत तीव्रता मूल्य का उपयोग करके ठहराव के लिए उपयुक्त है । हालांकि, ऐसे प्रतिवर्ती प्रोटीन दाग के रूप में पूरे प्रोटीन मार्करों, प्रोटीन लदान में बदलाव के लिए नियंत्रण के लिए उपयोग किया जाता है और अघुलनशील अंश के लिए एक सामांय कारक के रूप में अनुकूलित किया जा सकता है ।
इसके अतिरिक्त, जबकि भिन्नीकरण अघुलनशील और घुलनशील mHTT प्रजातियों को हल करने का एक साधन प्रदान करता है, mHTT रोग रोगजनन भर में कई गठन परिवर्तन, जिनमें से कुछ अघुलनशील अंश में भेद नहीं किया जाएगा । इसके अलावा, कुछ संरचनाओं रोग के परिणाम और स्थिर निकासी मध्यवर्ती के रूप में कार्य के प्रति लाभप्रद योगदान कर सकते हैं । इसलिए अंय mHTT अनुरूप है कि रोगजनन के लिए परिणामों के साथ सहसंबंधी की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है । कुछ अनुकूलन अंय mHTT मध्यवर्ती कल्पना करने के लिए आवश्यक हो सकता है । यह पता करने के लिए, एसडीएस प्रतिशत 20% तक बढ़ाया जा सकता है अगर कुल कम सांद्रता के लिए प्रतिरोधी है ।
यह प्रोटोकॉल प्रोटीन भिन्नीकरण शर्तों और परिणामस्वरूप परख दर्शाता है कि विभिन्न संरचनाओं और mHTT संचय और दोनों सेल संस्कृति और HD के एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में एकत्रीकरण के टुकड़े का पता लगाने । जैव रासायनिक प्रोटीन अलगाव के इस प्रकार के अन्य एचडी मॉडलों में रोग प्रगति के आकलन के लिए अनुरूप है और कोशिका के भीतर mHTT गतिशीलता की बढ़ती समझ और रोग विकृति पर उनके प्रभाव के लिए योगदान कर सकते हैं.
आंशिकीकरण के बाद, नमूनों कई मायनों में संसाधित किया जा सकता है. एसडीएस-पश्चिमी ब्लाट विश्लेषण के बाद पृष्ठ घुलनशील और अघुलनशील mHTT प्रजातियों को हल करने के लिए mHTT प्रजातियों के स्तर पर एक रिश्तेदार का आकलन प्रदान करेगा1। यह भी अतिरिक्त जैव रासायनिक परख में अंशों का मूल्यांकन करने के लिए आगे mHTT प्रजातियों का आकलन संभव है । उदाहरण के लिए, agarose जेल ट्रो (आयु) को हल करने और घुलनशील, oligomeric mHTT का पता लगा सकते हैं, जबकि एक फिल्टर मंदता (FR) परख एक शक्तिशाली उपकरण के लिए अघुलनशील का पता लगाने, fibrillary mHTT प्रजातियों16,17है ।
एक अतिरिक्त लाभ इस परख प्रस्तुत प्रोटीन रोगजनन के साथ जुड़े स्थानीयकरण का आकलन है । जैसा कि हम 18में प्रदर्शन किया, इस अंश प्रोटोकॉल दृश्य और Rangap1, जो बड़े अघुलनशील समुच्चय द्वारा तनहा हो दिखाई देते है और एक मानक पृष्ठ जेल पर हल नहीं हो सकता है जैसे प्रोटीन की ट्रैकिंग की अनुमति देता है । इसके अतिरिक्त, के रूप में यह परख भी एक कच्चे परमाणु/cytoplasmic जुदाई के रूप में कार्य करता है, एक भी प्रोटीन के स्थानीयकरण गेज कर सकते हैं, जैसे, p65, HD माउस मॉडल में1।
mHTT एकत्रीकरण और संचय के विश्लेषण के लिए एक प्रमुख प्रेरणा उपंयास HD निदान और चिकित्सकीय के विकास है । यौगिकों कि बाधित या रिवर्स mHTT एकत्रीकरण उच्च प्रवाह स्क्रीन और लक्षित परीक्षणों से पहचान की गई है1,12,19,20,21। हालांकि, mHTT के कई रूपों को हल करने में कठिनाई को देखते हुए, एकत्रीकरण मॉडुलन का मूल्यांकन हमेशा संभव नहीं किया गया है । पारंपरिक lysis तरीके छर्रों सेलुलर मलबे के निपटान कि संभावित रूप से अघुलनशील समग्र प्रोटीन, या lysis बफ़र्स solubilization के लिए पर्याप्त डिटर्जेंट शामिल नहीं हो सकता है । यहां वर्णित विधि अलग और mHTT के एक एकीकृत रूप है कि सेल आधारित या पूर्व नैदानिक vivo में आकलन में एक जैव रासायनिक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता का पता लगाने के लिए एक मंच प्रदान करता है ।
यहां वर्णित परख अंय प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है । कारण प्रोटीन का पता चलता है की गतिशील सुविधा के लिए, इन परख प्रभावी रूप से अंय विश्लेषण के साथ युग्मित करने के लिए प्रोटीन homeostasis और एकत्रीकरण की गहराई में तंत्र को उजागर कर सकते हैं । इन विश्लेषणों में समुच्चय के स्थिर राज्य स्तरों को मापने और विभिन्न कोशिका अंशों में उनके विभाजनों (चित्र 1) या शुद्ध रिकॉमबिनेंट प्रोटीन का उपयोग करके प्रोटीन तह/ इन परख प्रोटीन क्षरण या एकत्रीकरण पर आनुवंशिक या औषधीय मॉडुलन के प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष प्रभाव भेद करने में मदद मिलेगी । पिछले इन विट्रो पर बिल्डिंग एक-synuclein fractionated एकत्रीकरण आकलन22, हम के बाद से पार्किंसंस रोग माउस मॉडल के लिए इस काम को लागू करने के लिए एक-synuclein23के विभिंन संरचनाओं को हल । इसलिए, इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल प्रोटीन का खुलासा और एकत्रीकरण के अंय मॉडलों के लिए लागू किया जा सकता है, और खोज और समग्र प्रोटीन लक्ष्यीकरण नए चिकित्सकीय के विकास में योगदान कर सकते हैं ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को NIH (RO1-NS090390) ने सपोर्ट किया था । हम भी डॉ Joan Steffanfor तकनीकी सहायता और इस परख के विकास के दौरान चर्चा का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
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