Summary
Для фракционирования растворимых и нерастворимых мутант гентингтина видов от мыши мозга и клетки культуры описан метод. Метод, описанный полезен для характеристик и количественной оценки потока белок гентингтин и СПИДа в анализе белка гомеостаза в патогенезе заболевания и при наличии возмущений
Abstract
Накопление смятых протеинов имеет центральное значение для патологии в болезни Гентингтона (HD) и многих других нейродегенеративных расстройств. В частности ключевой особенностью патологических HD это ненормальное накопление Мутантный белок HTT (mHTT) в высокой молекулярной массой комплексов и внутриклеточные включения органы, состоящие из фрагментов и других белков. Традиционные методы измерения и понять, что вклад различных форм mHTT содержащих агрегаты включают микроскопии флуоресцирования, Западный анализ помаркой и фильтра улавливания анализов.
Однако большинство из этих методов являются конформации конкретным и поэтому не может разрешить полное состояние потока белка mHTT из-за сложного характера агрегатные растворимость и резолюции.
Для определения совокупных mHTT и различных модифицированных форм и комплексов разделения и солюбилизация клеточных агрегатов и фрагменты является обязательным. Здесь мы описываем метод, чтобы изолировать и визуализировать растворимых mHTT, мономеры, олигомеры, фрагменты, и нерастворимые высокомолекулярные (HMW) накопленных mHTT видов. HMW mHTT треки с прогрессирования заболевания, соответствует мыши поведения отсчетов и было выгодно модулированные некоторых терапевтических вмешательств1. Этот подход может использоваться с мыши мозга, периферических тканях и культуру клеток, но могут быть адаптированы к другие модели систем или болезни контекстах.
Introduction
Разрушение белка контроля качества сетей, которые обеспечивают надлежащего складные и деградации клеточных белков — вероятно, центральное место в патологии в болезни Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Гентингтона (HD) и другие «сворачиванию белков» расстройства,2,3. Глубокое понимание proteostasis сетевые компоненты и их вклад в патологии Поэтому решающее значение для разработки более терапевтических вмешательств. HD это вызвано ненормальное расширение CAG повторять в течение HD гена, что приводит к расширенный участок polyglutamines (polyQ) в белок гентингтин (НТТ)4. Последовательное патологических особенностью патогенеза HD является полученный сворачиванию, накопление и агрегирования HTT в регионах мозга и периферических тканях, который был показан несколькими способами мешать нормальной клетки гомеостаза и функции 5 , 6. Хотя HTT повсеместно выражается, средний колючий нейронов в стриатума выборочно уязвимых и наиболее открыто пострадавших с заметных корковой атрофии, также связанные с HD патогенеза.
Формирование агрегатов HTT в мозге животных моделей и HD пациентов обычно служил прокси маркера для прогрессирования заболевания и Доминант отрицательный прирост функции для mHTT7. Хотя конкретные механизмы, которые белка сворачиванию и агрегирование может способствовать mHTT индуцированной токсичности остаются неясными, инвариантная и неизбежной особенностью является формирование этих включений в мозге пациентов HD и различных животных моделей. Включений появляются состоять главным образом из накопленных HTT фрагменты, содержащие N-терминальный расширил polyQ, указывающее, что Протеолиз и обработку полноразмерных HTT, а также альтернативного сплайсинга8,9 может играть важную роль в патогенезе HD. N-терминальный HTT фрагментов могут представлять собой патологические формы HTT, который может быстро объединять, nucleate и ускорить или распространять процесс агрегации10.
Однако присутствие этих включений не обязательно коррелирует с НТТ индуцированной токсичности или клеток смерть11. HTT было предложено пройти процесс агрегации из растворимых мономера через растворимых олигомерных видов и β-лист фибриллами нерастворимых агрегатов и включений12. Урегулирование этих различных видов белков через стандартный биохимических анализов был вызов в области из-за их стабильность, низкая-моющее средство литического буфера и сложности в визуализации с помощью стандартных биохимических анализов. Таким образом методологические соображения имеют решающее значение в выявлении степени и шаблон накопленные и агрегированных mHTT.
Протокол, представленные здесь предоставляет метод для визуализации несколько промежуточных HTT, специально образование нерастворимых HMW HTT видов, который появляется внимательно отслеживать с HD патогенеза и болезнь прогрессии1,13 ,14. Будучи в состоянии решить и отслеживать несколько видов mHTT обеспечивает исследователей биохимических инструмент для изучения патогенеза заболевания и оценки потенциальных терапевтических вмешательств через их модуляции и влияние на патогенез болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
-Животных этики заявление эксперименты проводились в строгом соответствии с руководством для ухода и использования лабораторных животных протокола институциональный уход животных и использование Комитета (утвержденных исследований на животных и национальных институтов здравоохранения IACUC) Калифорнийского университета в Ирвине, АААЛЖ аккредитованные учреждения. Были предприняты все усилия для сведения к минимуму страдания животных.
1. Подготовка буфера Lysis
- Подготовка «Растворяется» буфера lysis (10 мм трис рН 7,4, 1% тритон-X 100, 150 мм NaCl, 10% глицерина) и стерильного фильтра через 0,22 мкм фильтром.
- Для работы «Растворяется» литического буфера, измерить N-Ethylmaleimide (NEM) и тщательно растворяют в 100 мм phenylmethysulfonyl фтора (PMSF) растворяют в 100% EtOH.
Примечание: Ингибиторы буфера Lysis: (i) 20 мм N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0,2 мм PMSF; (iii) 1 мм Ортованадат натрия (Na3VO4); (iv) 1 мкг/мл leupeptin; (v) 1 мкг/мл Апротинин; (vi) 20 мм фторид натрия (NaF).
Предупреждение: Носите маски, при работе с NEM во всем протокол. Рабочая литического буфера должны быть сделаны свежие для обеспечения активных ингибиторов. - Для растворимых литического буфера с ингибиторами протеаз, добавить ингибиторы в следующем порядке: фторид натрия (NaF), до объема с холодной литического буфера, Ортованадат натрия (Na3VO4), Апротинин и Leupeptin.
- Для работы «Растворяется» литического буфера, измерить N-Ethylmaleimide (NEM) и тщательно растворяют в 100 мм phenylmethysulfonyl фтора (PMSF) растворяют в 100% EtOH.
- Для «Нерастворимых» буфера lysis дополнение к 4% SDS, добавив 500 мкл 20% SDS 2 мл буфера lysis «Жидкого». Оставьте при комнатной температуре.
Примечание: SDS будет выпадать в осадок при хранении при температуре 4 ° C; Учитывайте это при комнатной температуре. Окончательный состав литического буфера: 10 мм трис (рН 7,4); 1% тритон X-100; 150 мм NaCl; 10% глицерина; 4% SDS (только нерастворимые).
2. растворимые/нерастворимый фракционирование протокол
Примечание: Рис. 1 приведена схема.
- Ярлык два комплекта трубок для каждого образца: «Жидкого» и «Нерастворимых.»
- Мкл X-ледяной рабочей растворимых литического буфера дополняют ингибиторы протеазы (см. 1.1.1) ткани.
Примечание: X = объем варьируется в зависимости от количества ткани; Приведены в таблице 1. - Для мыши мозговой ткани (то есть, Полосатое тело) dounce медленно 30 раз в 1 мл douncer стекла и пипетки в «Нерастворимые» помечены трубка (держать на льду).
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не сломать поверхности жидкости после запуска douncing, как пузыри будут формы и может привести к неполной гомогенизации. - Для клеток (т.е., HeLa, HEK293T) промойте клетки один раз с холодной, ПБС. Удалить PBS и применяются минимальный объем буфера lysis клетки и снять с ячейки скребок.
Примечание: Для выше линии клетки, клетки были покрытием на 5 x 105 клеток на 6 хорошо пластины и вырос почти до confluency. Один хорошо сравнима с томов, используемых для мыши стриатума. - Передача огневки или в lysate клетки помечены, «Нерастворимых» трубы и лизируют на льду 1 h (начало часов после обработки окончательный трубки).
Примечание: Для lysates клетки, нарезанных несколько раз, чтобы разрушить скопления клеток до начала инкубации. Избегайте образования пузырьков. Кратко вихря пульс каждый образец для 1 s на полпути через лизировать. - Центрифугуйте образцы на 4 ° C на 15 000 g x 20 мин.
- Восстановите супернатанта как фракция «Жидкого».
- Удалить с пипетки, будьте осторожны, чтобы не нарушить Пелле/облачный слой, как это будет загрязнять дроби. Накапайте растворимая фракция в «Жидкого» помечены трубы. Держите на льду.
- Помыть лепешка с 500 мкл буфера lysis (x2) и центрифуги на 4 ° C на 15 000 x g 5 минут после каждого мытья; Это нормально, если некоторые из облачный слой накапаны выкл.
- После окончательного вымыть удалите все оставшиеся мыть буфера, оставив только ткани Пелле.
Примечание: С этой точки, нерастворимый образцы теперь должны храниться при комнатной температуре. - Ресуспензируйте лепешка с X-мкл буфера lysis дополнена 4% SDS (объем может корректироваться в зависимости от размера гранул; см. таблицу 1).
- Sonicate каждый образец для 30 s при комнатной температуре с sonicator зонд (125 Вт, 20 кГц, пульс, амплитуда 40%, смотрите Таблицу материалы).
- Образцы (Роллинг кипения) Варите 30 мин; Центрифуга кратко (15 s) на 6000 x g а не теряют любой образец.
- Выполнять assay протеина DC (детергент совместимый) (см. Таблицу материалов) или assay протеина Lowry для измерения концентрации протеина (рекомендуется начал разведениях 1/5 образца соответствующих литического буфера для культуры клеток и 1/10 для лизатов ткани).
Примечание: Концентрации белка придется читать с помощью DC или Лоури пробирного благодаря высокой концентрации моющего средства. - Аликвота образцов на 50 мкл пакеты, чтобы избежать проблем замораживания оттаивания.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь до дальнейшего биохимический анализ путем сохранения обеих фракций при-20 ° C.
3. Западная помарка и количественная оценка
- Выполните западных помарках как сообщалось других1,13 , разбавления 30 мкг образца 1:1 в загрузке буфера (1.6 x загрузки краска, 1 x сокращения).
Примечание: 30 мкг белка на фракции достаточно, но может быть скорректирована для оптимального разрешения. 3 - 8% трис-ацетат Полимерность гелей должен использоваться для нерастворимых дроби. 4 - 12% бис-трис гели рекомендуются для растворимых фракций. - Варить 5 мин центрифуги образцы (кипения) кратко (15 s) на 6000 x g для сбора образцов.
- Анализируйте фракций SDS-PAGE и Западная помарка, по словам производителя протокол для сокращенных проб.
Примечание: Не растворимой фракции устраняет лучше всего, когда переносится на 0,45 мкм нитроцеллюлозную мембрану. 0,45 или 0,2 мкм нитроцеллюлозы могут использоваться для растворимых фракций, в зависимости от размера протеина интереса. За лучший перевод HMW материалов могут потребоваться некоторые оптимизации. - Пятно мембраны с пятна (например, MEMcode, см. Таблицу материалы) общий белок визуализировать загрузки эффективности белка.
Примечание: Западных помарках могут быть проанализированы по интенсивности среднее пикселей. Растворимых фракций могут быть нормированы домоустройства белка лучший подходит для экспериментальной системы. Нерастворимые дроби как относительная белка изобилие проверялось реверсивные белка окраски или нормализации гистона 3 на отдельных помаркой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Резолюция растворимых и нерастворимых lysates клетки после фракционирование могут быть обнаружены с помощью западных анализа и фильтрации отсталости анализов (рис. 2). Например, HEK293T клетки были transfected с помощью трансфекции реагента (например, lipofectamine 2000), с HTT экзона 1 кодирования cDNA, содержащие 97 глютамина повторяет15 следуют поли пролина богатый регион, и эти клетки было разрешено Экспресс для 44 h. клетки были обработаны с либо 5 мкм MG132 блокировать протеасомы или ДМСО как элемент управления для 18 h до сбора урожая и лизированных как описано выше. После фракционирование протокол мутант HTT экзона 1 разрешает как растворяется мономером около 45 кДа на 4-12%, что гели бис-трис страницы и как HMW нерастворимых накопленных видов на гелях трис-ацетат PAGE 3-8% (рис. 2A). Растворимые мономера могут быть количественно и нормированы домоустройства белка (показано здесь как GAPDH). HMW, нерастворимый mHTT количественно как относительная белка изобилие средней пиксель интенсивностью. Когда лечили ингибитором MG132, существует заметное снижение растворяется мономером mHTT наряду с соответствующим увеличением HMW, нерастворимый mHTT.
Нерастворимые фракций могут быть проанализированы дополнительные методы, такие как фильтр отсталости пробирного решить нерастворимые, фибриллярного mHTT16 (рис. 2B). НеЬа клетки были аналогичным образом transfected выше с 97Q-HTT экзона 1 и его-сумо-1 или его-сумо-2. Клетки были относиться с ДМСО или MG132 для 18 h до фракционирования и проанализированы с использованием иммуноблоттинга и фильтр отсталости анализов. Данные показывают, что наличие гиперэкспрессия сумо изоформы увеличивает HMW и фибриллово нерастворимый mHTT. Добавление MG132 усугубляет увеличение нерастворимые mHTT видов. HWM mHTT видов можно модулировать также гиперэкспрессия или сокращения целевого HD болезнь, PIAS1 в обоих НеЬа клетки13 и мыши горлица1 (рис. 2 c-D). Нокдаун PIAS1 быстро прогрессирующей мыши модели HD, R6/2, с помощью вирусного доставки интерферирующей РНК против PIAS1, уменьшает накопление HMW нерастворимые mHTT. Вирусная Сверхэкспрессия PIAS1 R6/2 мышей приводит к заметным увеличением HMW нерастворимые mHTT (Рисунок 2D)1. Изменение растворимости между фракциями количественному и указывает, что этот протокол может отслеживать модуляции видов патогенных Мутантный белок, делая это подходящий метод для доклинических биохимические оценки вмешательства болезней. Изменения в нерастворимые, фибриллярного видов mHTT также захватить потока между видами белок, который модулируется лечение с MG132 или регулирования потенциальных терапевтических целей, таких как PIAS11.
Рисунок 1: растворимый/нерастворимый фракционирование протокол и белка резолюции. (A) Visual конвейер для фракционирования протокола. Протокол, описанные здесь может быть применен к образцы культуры ткани или клетки мыши, но подходит для адаптации к другим типам образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель результаты анализы и растворимые и нерастворимые fractionations. (A) растворимые и нерастворимые фракции от lysates клетки HEK293T решен на 4-12% бис-трис и гели трис-ацетат PAGE 3-8%, с уважением. Растворимая фракция нормированы GAPDH загрузки элемента управления показывает колебания mHTT растворяется мономером экзона 1 основанный на воздействии на MG132. Нерастворимые фракция показывает, что HMW накопленных видов mHTT также модулируется MG132 лечения. (B) анализ растворимых и нерастворимых фракций от HeLa lysates клетки с помощью западной помарки и фильтр отсталости анализы: клетки НеЬа были transfected с его-сумо-1 или сумо-2 и/или 97Q-HTT экзона 1 и относились с 5 мкм MG132 для 18 ч.* (C) Растворимых и нерастворимых фракционирование из клеток HeLa, экспрессирующих 97Q-HTT экзона 1 и либо оверэкспрессировали PIAS1 или лечение с малых интерферирующих РНК против PIAS1 шоу регулирования накопления mHTT HMW после модуляции потенциальных терапевтических target.* (D) Нерастворимые дроби от мыши горлица обрабатывают микроРНК против PIAS1 и решены на 3-8% трис-ацетат страницы гели шоу модуляции HWM нерастворимые mHTT **. С разрешения13были изменены панелей (B-C). Группа (D) был изменен с разрешением1. * Перепечатано из о ' Рурк и др. 13 с разрешение. ** перепечатано из Ochaba и др. 1 с разрешения Elsevier. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Ткани (за полушарие) | Приблизительный вес (мг) | Объем растворимые (мкл) | Объем нерастворимые (мкл) |
| мышь Полосатое тело | 30 | 250 | 150 |
| мышь коры | 100 | 500 | 250 |
| мышь гиппокампа | 30 | 250 | 150 |
| мышь мозжечка | 40 | 250 | 150 |
| мышь скелетных мышц * | 100 | 300 | 150 |
| мышь печени (доли) | 100 | 400 | 200 |
| * Соединительная ткань образует Млечный интерфейс; удалить, чтобы избежать загрязнения | |||
Таблица 1: предлагаемые томов (X) для ткани конкретных фракционирование для буферов как растворимые и нерастворимые лизис. Объем буфера нерастворимых лизис основе начиная количество материала, который может быть скорректирована соответствующим образом на основе нерастворимых Пелле размера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Некоторые меры предосторожности необходимы для вышеуказанных протоколов для обеспечения последовательного и количественных результатов. Во-первых, mHTT в обеих фракций спонтанно образуют агрегаты со временем на несколько циклов замораживания-оттаивания, особенно когда в высокой концентрации. Таким образом, имеет решающее значение для замораживания аликвоты парфюмерные белка и размораживать только необходимый объем до запуска assay, как описано в протоколе выше. Кроме того если нерастворимых фракция дает белый осадителя после оттаивания, воссоздание могут потребоваться дополнительные 5 s sonication импульса, кипятят 5 мин и повторного количественный до анализа через биохимические анализы.
Количественные резолюции для этот assay достижимо путем нормализации средняя пиксель интенсивности растворимая фракция контроль погрузки или уборка гена в пределах каждого образца. Как показано здесь, GAPDH использовался как ген домоустройства для растворимая фракция, как он локализуется преимущественно в цитозоле (рис. 1). Другие часто используемые домоустройства белки являются актина, α-тубулина и Эрк 1/2. Однако подходящей нормализация белки должны быть оптимизированы для системы изучаются для обеспечения устойчивого состояния выражение для точной и формулировки нормализации. В то время как нерастворимых дроби служит сырой ядерных фракции видели присутствие гистона 3 и отсутствием GAPDH1, резолюции о 3-8%, которую страница гели пределы обнаруживаемости для часто используется ядерных маркеров. Таким образом нерастворимый фракция подходит для количественной оценки, используя значение интенсивности необработанный сигнал как представление относительного изобилия белка. Однако общий белок маркеров, например реверсивные белковых пятен, используются для управления для вариаций в протеине загрузки и может быть адаптирована как фактор нормализации нерастворимых дроби.
Кроме того в то время как фракционирования предоставляет средства урегулирования растворимых и нерастворимых mHTT видов, mHTT проходит многочисленные конформационные изменения в патогенезе заболеваний, некоторые из которых не будет distinguishable в нерастворимые фракции. Кроме того некоторые конформации могут благотворно способствовать исход болезни и выступать в качестве стабильной Распродажа интермедиатов. Поэтому важно определить другие mHTT конформеров, которые коррелируют с результатами для патогенеза. Некоторые оптимизации может быть необходимо визуализировать других промежуточных mHTT. Для решения этой проблемы, SDS процент может быть увеличена до 20%, если Агрегатная устойчив к снижению концентрации.
Этот протокол демонстрирует условия фракционирование белков и результате анализов, которые обнаружить различные конформации и фрагменты mHTT накопления и агрегации в культуре клеток и трансгенные мыши модель HD. Этот тип изоляции биохимических белка предполагается для оценки прогрессирования болезни в других моделях HD и может способствовать растущего понимания динамики mHTT в клетки и их воздействия на болезни патологии.
После фракционирования образцы могут быть обработаны различными способами. SDS-PAGE, а затем Западный анализ помаркой решит растворимых и нерастворимых mHTT видов для относительной оценки на уровнях mHTT видов1. Это также позволяет оценить фракций в дополнительных биохимических анализов для дальнейшей оценки видов mHTT. Например электрофорез геля агарозы (возраст) можно решить и обнаружить водорастворимые, олигомерных mHTT, в то время как пробирного отсталости (FR) фильтр представляет собой мощный инструмент для обнаружения нерастворимые, фибриллово mHTT видов16,17.
Дополнительным преимуществом, которое представляет этот assay является оценка белка mislocalization, связанные с патогенезом. Как мы показали в 18, этот протокол фракционирование позволяет визуализации и отслеживания белков, таких как Rangap1, которые появляются в быть изолированы от крупных нерастворимых агрегатов и не может решить на стандартной странице гель. Кроме того как этот assay также служит сырой ядерных/цитоплазматических разделения, один можно также измерить mislocalization белков, например, Р65, в HD мыши модели1.
Видные мотивация для анализа mHTT агрегации и накопления является разработка новых HD диагностики и терапии. Соединений, которые подавляют или обратить вспять mHTT агрегации были определены от экранов высокой пропускной способностью и целевые тесты1,12,19,,2021. Однако учитывая трудности в решении многих форм mHTT, оценки агрегации модуляции было не всегда возможно. Лизис традиционные методы могут распоряжаться гранулированных сотовой мусора, что потенциально содержат нерастворимых совокупных белка, или лизис буферов может не содержать достаточно моющее средство для солюбилизация. Метод, описанный здесь обеспечивает платформу для изоляции и обнаружения агрегированной форме mHTT, который может использоваться как биохимический маркер в ячейке основе или доклинические в vivo оценок.
Анализы, описанные здесь может применяться для других смятых протеинов. Благодаря динамической смятых протеинов эти анализы могут эффективно сочетании с другие анализы раскрыть углубленного механизмы гомеостаза белка и агрегации. Эти анализы включают в себя измерение уровней устойчивого состояния агрегатов и их разделов в долях различных клеток (рис. 1) или анализа белка складывания/агрегирования использование очищенной рекомбинантных белков. Эти анализы поможет различать прямые или косвенные последствия генетических или фармакологических модуляции на агрегации или деградации белка. Опираясь на предыдущий в vitro a-synuclein фракционированный агрегирования оценок22, мы с тех пор применяется эта работа для болезни Паркинсона мыши модели решить различные конформации-synuclein23. Таким образом протоколы, описанные в этой работе могут быть применены к другим моделям сворачиванию белков и агрегации и может способствовать открытие и разработка новых терапии ориентации агрегированных белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH (RO1-NS090390). Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Джоан Steffanfor технической помощи и обсуждения в ходе разработки этот assay.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
References
- Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
- La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
- Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
- Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
- Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
- Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
- Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
- Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
- Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
- Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
- O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
- Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
- Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
- Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
- Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
- Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
- Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).
