Summary
En metode er beskrevet fraksjoneres uløselig og løselig mutant huntingtin arter fra musen hjernen og celle kultur. Metoden beskrevet er nyttig for karakterisering og måling av huntingtin protein flux og hjelpemidler i å analysere protein homeostase i patogenesen ved sykdom og i nærvær av forstyrrelser
Abstract
Oppsamling av misfolded proteiner er sentralt for patologi i Huntingtons sykdom (HD) og mange andre nevrodegenerative lidelser. Spesielt en patologisk nøkkelfunksjon i HD er avvikende opphopning av mutant HTT (mHTT) protein i høy molekylvekt komplekser og intracellulær inkludering organer består av fragmenter og andre proteiner. Konvensjonelle metoder for å måle og forstå bidrag av ulike former for mHTT inneholder aggregater inkluderer fluorescens mikroskopi, western blot analyse og filter felle analyser.
Men de fleste av disse metodene er konformasjon bestemt, og derfor kan ikke løse hele delstaten mHTT protein forandring på grunn av den komplekse naturen samlet løselighet og oppløsning.
For identifisering av oppsamlet mHTT og ulike endret former og komplekser er separasjon og solubilization av mobilnettet aggregater og fragmenter obligatorisk. Vi beskriver her en metode for å isolere og visualisere løselig mHTT, monomerer, oligomers, fragmenter, og en uløselig høy molekylvekt (HMW) akkumulert mHTT arter. HMW mHTT spor med sykdomsprogresjon, samsvarer med mus atferd readouts, og har vært beneficially modulert av visse terapeutisk intervensjon1. Denne tilnærmingen kan brukes med musen hjernen, perifere vev og cellekultur, men kan tilpasses andre modellsystemer eller sykdom sammenhenger.
Introduction
Avbrudd i protein kvalitetskontroll nettverk som sikrer riktig folding og nedbrytning av mobilnettet proteiner er sannsynlig sentralt patologi i Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom (HD), og andre "protein misfolding" lidelser2,3. En detaljert forståelse av proteostasis nettverkskomponentene og deres bidrag til patologi er derfor avgjørende å utvikler forbedret terapeutisk intervensjon. HD skyldes unormal utvidelse av en CAG gjentakelse i HD genet som resulterer i en utvidet strekning av polyglutamines (polyQ) i huntingtin (HTT) protein4. En konsekvent patologisk funksjon i HD patogenesen er den resulterende misfolding, akkumulering og samling av HTT i områder av hjernen og i perifere vev, som har blitt vist å påvirke på måter normal celle homeostase og funksjon 5 , 6. mens HTT uttrykkes overalt, middels spiny nerveceller i striatum er selektivt sårbare og mest åpenlyst berørte med kjente kortikale atrofi også forbundet med HD patogenesen.
Dannelsen av aggregater av HTT i hjernen av HD pasienter og dyremodeller har vanligvis servert som en proxy markør for sykdomsprogresjon og dominerende-negative gevinst for funksjon for mHTT7. Selv om nøyaktige mekanismer som protein misfolding og aggregering kan bidra til mHTT-indusert toksisitet forblir uklart, er dannelsen av slike Inneslutninger i hjernen av HD pasienter og ulike dyr modeller en konstant og uunngåelig funksjon. Inneslutninger vises skal består hovedsakelig av akkumulert HTT fragmenter som inneholder N-terminalen utvidet polyQ, som indikerer at proteolyse og behandling av full lengde HTT samt alternativ skjøting8,9 kan spille en viktig rolle i patogenesen av HD. N-terminal HTT kan utgjøre en patologisk form for HTT som kan raskt, nucleate, og akselerere overføre samling prosessen10.
Men samsvarer tilstedeværelsen av slike Inneslutninger ikke nødvendigvis med HTT-indusert toksisitet eller celle død11. HTT har blitt foreslått å gjennomgå en samling prosessen fra en løselig monomer gjennom løselig oligomeric arter og β arks fibrils til uløselig aggregater og Inneslutninger12. Løse disse ulike protein arter via standard biokjemiske analyser har vært en utfordring innen deres stabilitet i lav-rengjøringsmiddel lyseringsbuffer og vanskeligheter med å visualisere bruker standard biokjemiske analyser. Dermed er metodologiske avgjørende i å oppdage den grad og mønster av akkumulert og samlet mHTT.
Protokollen presenteres her gir en metode for å visualisere flere intermediates av HTT, spesielt dannelsen av en uløselig HMW HTT Art til nøye spore med HD patogenesen og sykdom progresjon1,13 ,14. Å løse og spore flere arter av mHTT gir forskere et biokjemiske verktøy å studere sykdom patogenesen og vurdere potensielle terapeutiske tiltak gjennom modulering og innvirkning på sykdom patogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr etikk Statement - eksperimenter ble utført i strengt samsvar med Guide og bruk av forsøksdyr National Institutes of Health og et godkjent Forsøksdyrutvalget protokollen av de institusjonelle Animal Care og bruk Committee ( IACUC) ved University of California, Irvine, en AAALAC akkreditert institusjon. Alle forsøk ble gjort for å minimere dyrenes lidelse.
1. utarbeidelse av Lysis buffere
- Forberede "Løselig" lyseringsbuffer (10 mM Tris pH 7.4, 1% Triton-X 100 150 mM NaCl, 10% glyserol) og sterile gjennom 0.22 µm.
- For en arbeider "Løselig" lyseringsbuffer, måle N-Ethylmaleimide (NEM) og grundig løses i 100 mM phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) oppløst i 100% EtOH.
Merk: Lysis Buffer hemmere: (i) 20 mM N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0.2 mM PMSF; (iii) 1 mM natrium orthovanadate (Na3VO4); (iv) 1 µg/mL leupeptin; (v) 1 µg/mL aprotinin; (vi) 20 mM natriumfluorid (NaF).
FORSIKTIG: Bruk en ansiktsmaske når du arbeider med NEM gjennom protokollen. Arbeider lyseringsbuffer må gjøres frisk å sikre aktive hemmere. - Løselig lyseringsbuffer med proteasehemmere, legge til hemmere i følgende rekkefølge: natrium fluor (NaF), til volumet med kaldt lyseringsbuffer, natrium orthovanadate (Na3VO4), Aprotinin og Leupeptin.
- For en arbeider "Løselig" lyseringsbuffer, måle N-Ethylmaleimide (NEM) og grundig løses i 100 mM phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) oppløst i 100% EtOH.
- For "Uløselig" lyseringsbuffer, supplement til 4% SDS ved å legge 500 µL av 20% SDS 2 mL "Løselige" lyseringsbuffer. La ved romtemperatur.
Merk: SDS vil føre ut når holdt på 4 ° C; Husk dette ved romtemperatur. Siste lyseringsbuffer sammensetning: 10 mM Tris (pH 7.4); 1% Triton X-100; 150 mM NaCl; 10% glyserol; 4% SDS (uløselig bare).
2. løselig/uløselig fraksjoneres protokollen
Merk: Se figur-1 for en skjematisk.
- Gi to sett av rør for hver prøve: "Løselige" og "Uløselig."
- Legg til X-µL av iskalde arbeider løselig lyseringsbuffer supplert med proteasehemmere (se 1.1.1) til vev.
Merk: X = volumet varierer avhengig av vev; Se tabell 1. - For musen hjernevev (dvs., striatum), dounce sakte 30 ganger i glass 1 mL douncer og Pipetter i "Uløselig" merket tube (holde på is).
Merk: Pass på ikke å bryte overflaten av væske etter douncing, bobler vil form og kan gi ufullstendig homogenisering. - For celler (dvs., jakten, HEK293T), skyll celler når med kaldt, 1 x PBS. Fjern PBS og minimal mengde lyseringsbuffer gjelder celler og løft med cellen skraper.
Merk: For over linjer, celler var belagt på 5 x 105 celler per 6 godt plate og vokst til nær confluency. En sammenlignes godt volumer brukes for musen striatum. - Overføre homogenate eller celle lysate i merket, "Uløselig" rør og lyse på is 1t (Start klokke etter siste tube er behandlet).
Merk: For celle lysates, triturate flere ganger for å bryte opp cellen klumper før du starter inkubasjon. Unngå dannelse av bobler. Kort vortex puls hver prøve for 1 s halvveis lysing. - Sentrifuge samples ved 4 ° C på 15.000 x g for 20 min.
- Gjenopprette nedbryting som "Løselige" brøken.
- Fjerne med Pipetter, vær forsiktig ikke å forstyrre pellet/skyet lag som dette vil forurense brøken. Pipetter løselig brøk i "Løselige" merket rør. Hold på is.
- Vask pellets med 500 µL lyseringsbuffer (x2) og sentrifuger på 4 ° C på 15.000 x g i 5 min etter hver vask; Det er greit hvis noen av de skyet laget er pipetted av.
- Etter siste vask, fjerne alle resterende vaskebuffer forlate bare vev pellets.
Merk: Fra dette punktet, uløselig prøver bør nå holdes i romtemperatur. - Resuspend pellets med X-µL lyseringsbuffer supplert med 4% SDS (lydstyrken kan justeres avhengig av størrelsen på pellet, se tabell 1).
- Sonicate hvert utvalg for 30 s ved romtemperatur med en sonde sonicator (125 watt, 20 kHz, puls, Amplitude 40%, se Tabellen for materiale).
- Kok prøver (rullende koke) i 30 min; Sentrifuge kort (15 s) på 6000 x g å ikke miste noen eksempler.
- Utføre DC (vaskemiddel kompatibel) protein analysen (se Tabell for materiale) eller Lowry protein analysen måle protein konsentrasjon (anbefalt startet fortynninger av 1/5 av eksemplet på respektive lyseringsbuffer for cellekultur og 1/10 for vev lysates).
Merk: Protein konsentrasjoner må leses med en DC eller Lowry analysen på grunn av høy vaskemiddel konsentrasjon. - Aliquot prøver i 50 µL Bunker å unngå fryse-Tin problemer.
Merk: Protokollen kan pauses her før videre biokjemiske analyse ved å lagre både fraksjoner på 20 ° C.
3. Western Blot og måling
- Utføre vestlige blots som rapportert andre steder1,13 ved utvannende 30 µg av prøve 1:1 i lasting buffer (1.6 x lasting fargestoff, 1 x redusere).
Merk: 30 µg protein per brøkdel er tilstrekkelig, men kan justeres for optimal oppløsning. 3 - 8% Tris-Acetate poly-akrylamid gels skal brukes for uløselig brøken. 4 - 12% bis-Tris gels anbefales for løselig brøken. - Kok prøver (bølgende koke) i 5 min. sentrifuge kort (15 s) på 6000 x g å samle prøven.
- Analysere fraksjoner av SDS side og western blot, ifølge produsenten protokoll for redusert eksemplene.
Merk: Uløselig brøkdel løser best overført til 0,45 µM nitrocellulose membran. 0,45 eller 0,2 µM nitrocellulose kan brukes for løselig brøkdel, avhengig av protein av interesse. Noen optimalisering kan kreves for beste overføring av HMW materialer. - Stain membran med hele protein flekker (f.eksMEMcode, se Tabellen for materiale) å visualisere protein lasting effektivitet.
Merk: Vestlige blots kan analyseres av mener pixel intensitet. Løselig fraksjoner kan normaliseres en rengjøring protein best egnet for eksperimentell systemet. Uløselig brøk som relative protein overflod ble bekreftet av reversibel protein flekker eller Histone 3 normalisering på separate blot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oppløsningen av løselig og uløselig celle lysates etter fraksjoneres kan oppdages ved hjelp av vestlige analyse og filter retardasjon analyser (figur 2). Som et eksempel, HEK293T celler var transfekterte bruker transfection reagens (f.eks, lipofectamine 2000) med HTT ekson 1 koding cDNA som inneholder 97 glutamin gjentar15 etterfulgt av poly proline rike regionen og disse cellene kunne Express for 44 h. celler ble behandlet med enten 5 µM MG132 blokkere proteasome eller DMSO som en 18 h før innhøsting og lysed som beskrevet ovenfor. Etter fraksjoneres-protokollen løser mutant HTT ekson 1 som en løselig monomer rundt 45 kDa på 4-12% Bis-Tris siden gels og som HMW uløselig akkumulert art på 3-8% Tris-Acetate siden gels (figur 2A). Løselig monomer kan kvantifisert og normalisert en rengjøring protein (vist her som GAPDH). HMW, uløselig mHTT er kvantifisert som relative protein overflod av mener pixel intensitet. Når behandlet med inhibitor MG132, er det en merkbar nedgang i løselig monomer av mHTT sammen med en tilsvarende økning i HMW, uløselig mHTT.
Uløselig fraksjoner kan analyseres av flere teknikker som et Filter retardasjon analysen løse uløselig, fibrillar mHTT16 (figur 2B). HeLa celler ble tilsvarende transfekterte som ovenfor 97Q-HTT ekson 1, og hans-SUMO-1 eller hans-SUMO-2. Cellene ble behandlet med DMSO eller MG132 for 18 h før fraksjoneres og analysert ved hjelp av western blot og filteret retardasjon analyser. Dataene viser at tilstedeværelsen av overexpressed SUMO isoformen øker både HMW og fibrillary uløselig mHTT. Tillegg av MG132 forverrer økningen i uløselig mHTT arter. HWM mHTT arter kan også være modulert av overuttrykte eller reduksjon av HD sykdom målet, PIAS1 i begge HeLa celler13 og mus striata1 (figur 2C-D). Knockdown av PIAS1 i raskt utvikle musemodell av HD, R6/2, bruke viral levering av en siRNA mot PIAS1, minsker samling av HMW uløselig mHTT. Viral overuttrykte PIAS1 i R6/2 mus fører til en betydelig økning i HMW uløselig mHTT (figur 2D)1. Endringen i løselighet mellom fraksjoner er kvantifiserbare, og angir at denne protokollen kan spore modulering av sykdomsfremkallende mutert protein arter, noe som gjør dette til en passende teknikk for pre-klinisk biokjemiske vurderinger av sykdom intervensjon. Endringer i uløselig, fibrillar arter av mHTT også fange flux mellom protein arter som modulert av behandling med MG132 eller regulering av potensielle terapeutiske mål, for eksempel PIAS11.
Figur 1: løselig/uløselig fraksjoneres protokollen og protein oppløsning. (A) Visual rørledning for fraksjoneres protokollen. Protokollen beskrevet her kan brukes til mus vev eller celle kultur eksempler, men er egnet for tilpasning til andre eksempel typer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant resultater for løselige og uløselig fractionations og analyser. (A) løselige og uløselig fraksjoner HEK293T celle lysates løst på en 4-12% Bis-Tris og 3-8% Tris-Acetate siden gels, ærbødig. Løselig brøkdel normalisert til GAPDH laster inn kontroll viser svingninger i mHTT ekson 1 løselig monomer basert på eksponering for MG132. Uløselig brøkdel viser at HMW akkumulert arter av mHTT også modulert av MG132 behandling. (B) analyse av løselig og uløselig fraksjoner HeLa celle lysates med western blot og filteret retardasjon analyser: HeLa celler transfekterte med hans-SUMO-1 eller SUMO-2 og/eller 97Q-HTT ekson 1 og behandlet med 5 µM MG132 for 18 hr.* (C) Løselig og uløselig fraksjoneres fra HeLa celler overexpressing 97Q-HTT ekson 1 og enten overexpressed PIAS1 eller behandlet med en siRNA mot PIAS1 Vis regulering av HMW mHTT akkumulering etter modulerende en potensielle terapeutiske target.* (D) Uløselig fraksjoner musen striata behandlet med microRNA mot PIAS1 og løst på 3-8% Tris-Acetate siden gels Vis modulering av HWM uløselig mHTT **. Paneler (ABC) er endret med tillatelse13. Panelet (D) er blitt endret med tillatelse1. * Gjengitt fra O'Rourke et al. 13 med tillatelse. ** gjengitt fra Ochaba et al. 1 med tillatelse fra Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Vev (per halvkule) | Omtrentlig vekt (mg) | Volum løselig (µL) | Volum uløselig (µL) |
| musen Striatum | 30 | 250 | 150 |
| musen Cortex | 100 | 500 | 250 |
| musen Hippocampus | 30 | 250 | 150 |
| musen lillehjernen | 40 | 250 | 150 |
| musen skjelettlidelser muskel * | 100 | 300 | 150 |
| musen leveren (lobe) | 100 | 400 | 200 |
| * bindevev skjemaer melkeaktig grensesnitt; fjerne for å unngå forurensning | |||
Tabell 1: foreslo volumer (X) vev-spesifikke fraksjoneres for både løselig og uløselig lysis buffere. Uløselig lysis buffer volum basert på starter mengde materiale, som kan justeres tilsvarende basert på uløselig pellet størrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forholdsregler er nødvendig for over-protokoller for å sikre konsekvent og kvantitative resultater. Først mHTT i både fraksjoner vil spontant danne aggregater over tid ved flere fryse tine sykluser, spesielt når du er i en høy konsentrasjon. Det er dermed viktig fryse dele protein forutbetalt, og tine bare nødvendig volumet før du kjører analysen som beskrevet i protokollen ovenfor. Videre, hvis uløselig brøkdel gir hvit precipitant ved tining, rekonstituering kan være nødvendig ved et ytterligere 5 s sonication puls, 5 min koke og re kvantifisering før analyse via biokjemiske analyser.
Kvantitativ oppløsning for denne analysen er oppnåelig ved å normalisere mener pixel intensiteten av løselig brøkdel som en lasting kontroll eller rengjøring genet innenfor hvert utvalg. Som vist her, ble GAPDH brukt som en vaktmester genet for løselig brøken som det overveiende regionaliserer til stoffer (figur 1). Andre brukte rengjøring proteiner er begrepsordbok, α-tubulin og Erk 1/2. Imidlertid skal egnet normalisering proteiner være optimalisert for systemet blir undersøkt for å sikre stabil tilstand uttrykk for nøyaktig og upåvirket normalisering. Mens uløselig brøken fungerer som en grov, kjernefysisk brøkdel sett av tilstedeværelsen av histone 3 og GAPDH1, brukte oppløsning på 3-8% siden gels grenser detectability til ofte kjernefysiske markører. Derfor er uløselig brøkdel egnet for kvantifisering ved hjelp av rå signal intensitetsverdien som en relativ representasjon av protein overflod. Men hele protein markører, som reversibel protein flekker, brukes til å kontrollere for variasjoner i protein lasting og kan tilpasses som en normalisering faktor for uløselig brøkdel.
I tillegg, mens fraksjoneres lar deg løse uløselig og løselig mHTT arter, gjennomgår mHTT mange conformational endringer gjennom sykdom patogenesen, hvorav noen ikke kan skilles i uløselig fraksjonen. Videre kan noen konformasjonen bidra fordel mot sykdom utfallet og fungere som stabil klaring intermediater. Det er derfor viktig å identifisere andre mHTT conformers som samsvarer med resultatene for patogenesen. Noen optimalisering kan være nødvendig å visualisere andre mHTT intermediater. For å løse dette, kan SDS prosent økes til 20% Hvis samlet er motstandsdyktig mot lavere konsentrasjoner.
Denne protokollen demonstrerer protein fraksjoneres forhold og resulterende analyser oppdage ulike konformasjonen og fragmenter av mHTT akkumulering og aggregering både cellekultur og en transgene musemodell HD. Denne typen biokjemiske protein isolasjon er seg for vurdering av sykdomsprogresjon i andre HD-modeller og kan bidra til den økende forståelsen av mHTT dynamikken i cellen og deres innvirkning på sykdom patologi.
Etter fraksjoneres, kan prøver behandles på flere måter. SDS side etterfulgt av western blot analyse løser løselig og uløselig mHTT arter å gi en relativ vurdering på nivåer av mHTT Art1. Det er også mulig å vurdere brøker i flere biokjemiske analyser å vurdere videre mHTT arter. Agarose gel geleelektroforese (år) kan for eksempel løse og oppdage løselig, oligomeric mHTT, mens en filter retardasjon (FR) analysen er et kraftig verktøy for å oppdage uløselig, fibrillary mHTT arter16,17.
En ekstra fordel denne analysen presenterer er vurdering av protein mislocalization tilknyttet patogenesen. Som vi viste i 18, kan denne fraksjoneres protokollen visualisering og sporing av proteiner som Rangap1, som synes å være sequestered av store uløselige aggregater og kan ikke løses på en standard side gel. I tillegg som denne analysen fungerer også som en grov kjernefysiske/cytoplasmatiske separasjon, kan man også måle mislocalization proteiner, f.eks, p65, i HD musen modeller1.
En fremtredende motivasjon for analyse av mHTT aggregering og akkumulering er utviklingen av romanen HD diagnostikk og therapeutics. Forbindelser som hemmer eller reversere mHTT aggregering har identifisert fra høy gjennomstrømming skjermer og målrettede tester,1,,12,,19,,20,,21. Imidlertid har gitt vanskeligheten med å løse mange av formene for mHTT, evaluering av aggregering modulering ikke alltid vært mulig. Tradisjonelle lysis metoder kan avhende pelleted mobilnettet rusk som inneholde uløselig samlet protein eller lysis buffere kan ikke inneholde nok vaskemiddel for solubilization. Metoden beskrevet her gir en plattform for å isolere og oppdage en aggregert form for mHTT som kan brukes som en biokjemiske markør i celle basert eller pre-klinisk i vivo vurderinger.
Analyser beskrevet her kan brukes på andre misfolded proteiner. På grunn av funksjonen dynamisk misfolded proteiner, kan disse analyser effektivt kombineres med andre analyser å avdekke grundig mekanismer av protein homeostase og aggregering. Disse analysene er måle steady state nivåene av aggregater og deres partisjoner i ulike celle brøker (figur 1) eller analyse av protein folding/aggregering bruke renset rekombinante proteiner. Disse analyser vil hjelpe skille direkte eller indirekte effekter av genetiske eller pharmacologic modulering på protein fornedrelse eller samling. Bygge på tidligere i vitro en synuclein fraksjonert aggregering vurderinger22, har vi siden brukt dette arbeidet til Parkinsons sykdom musen modeller å løse ulike konformasjonen av en synuclein23. Derfor protokoller beskrevet i dette arbeidet kan brukes på andre modeller av protein misfolding og aggregering og kan bidra til oppdagelsen og utvikling av nye therapeutics målretting aggregert proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH (RO1-NS090390). Vi vil også gjerne takke Dr. Joan Steffanfor teknisk assistanse og diskusjon under utviklingen av denne analysen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
References
- Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
- La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
- Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
- Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
- Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
- Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
- Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
- Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
- Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
- Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
- O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
- Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
- Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
- Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
- Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
- Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
- Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).
