Summary
Fare beyin ve hücre kültür çözünür ve çözünmez mutant huntingtin türlerinin ayırma için bir yöntemi açıklanmıştır. Açıklanan yöntemi karakterizasyonu ve miktar huntingtin protein akı ve protein homeostazı hastalık patogenezinde ve tedirginlikler huzurunda analiz AIDS için yararlıdır
Abstract
Misfolded proteinleri birikimi patoloji Huntington hastalığı (HD) ve diğer birçok nörodejeneratif hastalıklar için merkezi bir noktada bulunuyor. Özellikle, bir ana patolojik HD yüksek molekül ağırlıklı kompleksleri içine mutant HTT (mHTT) protein birikimine anormal özelliğidir ve hücre içi dahil ceset parçaları ve diğer proteinler oluşur. Ölçmek ve mHTT içeren toplamları çeşitli formları katkılarıyla Floresans mikroskobu, western blot analizi ve filtre dahil anlamak için geleneksel yöntemler deneyleri tuzak.
Ancak, bu yöntemlerin çoğu belirli biçimi vardır ve bu nedenle mHTT protein akı toplama çözünürlük ve çözünürlük karmaşık yapısı nedeniyle tam durumunu çözmeyebilir.
Toplanan mHTT ve çeşitli değiştirilmiş form ve kompleksleri kimlik için ayırma ve solubilization hücresel toplamları ve parçaları zorunlu değildir. Burada biz yalıtmak ve görselleştirmek çözünür mHTT, monomerleri, reaksiyonlar, parçaları için bir yöntem tanımlamak ve çözünmez yüksek molekül ağırlıklı (HMW) mHTT türler birikmiş. HMW mHTT izler hastalık ilerlemesi ile fare davranışı çıktıları ile karşılık gelir ve beneficially belirli tedavi müdahaleler1tarafından modüle. Bu yaklaşım fare beyni, periferik doku ve hücre kültürü ile kullanılabilir ancak diğer sistemleri modellemek bağlamı olarak da bilinen hastalık için adapte edilebilir.
Introduction
Uygun katlama sağlamak protein kalite kontrol ağları bozulma ve yıkımı proteinlerin patoloji Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD) için büyük olasılıkla orta ve protein diğer "misfolding" olduğunu 2,3bozuklukları. Proteostasis ağ bileşenleri ve onların katkıları patoloji için detaylı bir anlayış bu nedenle geliştirilmiş tedavi müdahaleler geliştirmek için çok önemli. HD bir CAG tekrar polyglutamines (polyQ) huntingtin (HTT) protein4genişletilmiş bir streç sonuçlanan HD gen içinde anormal genişlemesi nedeniyle oluşur. Bir tutarlı patolojik HD Patogenez elde edilen misfolding, birikimi ve çeşitli şekillerde normal hücre homeostazı ve işlev girişimine gösterilen HTT beyin bölgelerinde ve periferik dokularda agregasyon özelliğidir 5 , 6. iken HTT ubiquitously ifade, striatum orta dikenli nöronların Ayrıca HD patogenezi ile ilgili dikkate değer kortikal Atrofi ile seçmeli olarak savunmasız ve en açıktan etkilenen vardır.
HTT HD hasta ve hayvan modelleri beyinde agrega oluşumu genellikle hastalık ilerleme ve baskın negatif kazanç mHTT7için işlevinin bir proxy marker olarak hizmet vermiştir. Hangi protein tarafından misfolding ve toplama mHTT kaynaklı toksisite için katkıda bulunabilir kesin mekanizmaları belirsiz kalır rağmen beyindeki bu kapanımlar HD hasta ve çeşitli hayvan modelleri oluşumu bir sabit ve kaçınılmaz özelliğidir. N-terminal içeren büyük ölçüde birikmiş HTT parçaları oluşan için o proteolizis belirten polyQ, genişletilmiş ve tam uzunlukta HTT yanı sıra alternatif Uçbirleştirme8,işleme9 oynayabilir kapanımlar görünür bir HD. N-terminal HTT parçaları patogenezinde önemli rol hızla toplamak, nucleate ve hızlandırmak veya toplama işlemi10yaymak HTT patolojik bir tür teşkil edebilir.
Ancak, bu eklemeler varlığı mutlaka HTT kaynaklı toksisite ya da hücre ölüm11ile ilişkilendirmek değil. HTT çözünür bir monomer çözünür oligomeric türler ve β-yapraklık liflerinde bir toplama işleminden çözünmez toplamları ve kapanımlar12geçmesi teklif edildi. Bu protein türleri standart biyokimyasal deneyleri ile çözme onların istikrar içinde düşük-deterjan lizis tampon ve standart biyokimyasal testleri kullanarak görselleştirme zorluk nedeniyle alandaki bir mücadele vardı. Böylece, metodolojik konusu derecesi ve birikmiş ve toplanan mHTT desen saptamada kritik önem taşır.
Burada sunulan Protokolü HTT, özellikle HD Patogenez ve hastalık ilerleme1,13 ile yakından izlemek için görünür bir çözünmez HMW HTT türlerin oluşumu, birkaç ara ürün görselleştirmek için bir yöntem sağlar ,14. Gidermek ve mHTT birden çok tür takip edememek araştırmacılar hastalığın patogenezinde çalışma ve modülasyon ve hastalık patogenezinde üzerindeki etkisi ile potansiyel terapötik müdahaleler değerlendirmek biyokimyasal bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan etik beyanı - deneyler yürütülen Kılavuzu ile sıkı uygun bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık enstitüleri ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi () tarafından onaylanmış hayvan araştırma protokolü IACUC) University of California, Irvine, bir AAALAC akredite kurum. Tüm çabaları hayvan acı en aza indirmek için yapılmıştır.
1. lizis arabellekleri hazırlanması
- "Çözünür" lizis arabellek hazırlamak (10 mM Tris pH 7.4, % 1 Triton-X 100, 150 mM NaCl, % 10 gliserol) ve 0,22 µm filtresi ile steril filtre.
- Çalışma "Çözünür" lizis için bir tampon, N-Ethylmaleimide (NEM) ölçmek ve iyice 100 mM phenylmethysulfonyl flor (PMSF) % 100 çözünmüş olarak dağıtılması alkol.
Not: Lizis arabellek inhibitörleri: (i) 20 mM N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0.2 mM PMSF; (iii) 1 mM sodyum orthovanadate (Na3VO4); (iv) 1 µg/mL leupeptin; (v) 1 µg/mL aprotinin; (vi) 20 mM sodyum florür (kaf).
Dikkat: bir yüz maskesi NEM boyunca protokolünün çalışırken giyiyorum. Lizis arabellek çalışma aktif inhibitörleri sağlamak için taze yapılmalıdır. - Proteaz inhibitörleri ile çözünür lizis tampon için inhibitörleri aşağıdaki sırayla ekleyin: sodyum florür (kaf), soğuk lizis arabellek, sodyum orthovanadate (Na3VO4), Aprotinin ve Leupeptin bir birim kadar.
- Çalışma "Çözünür" lizis için bir tampon, N-Ethylmaleimide (NEM) ölçmek ve iyice 100 mM phenylmethysulfonyl flor (PMSF) % 100 çözünmüş olarak dağıtılması alkol.
- "Çözünmez" lizis arabellek için % 4 SDS "Soluble" lizis arabellek için 2 mL % 20 SDS 500 µL ekleyerek ek. Oda sıcaklığında bırakın.
Not: 4 ° C'de tutulur dışarı SDS çökelti; Bu oda sıcaklığında tutmak. Son lizis arabellek oluşturma: 10 mM Tris (pH 7,4); % 1 Triton X-100; 150 mM NaCl; % 10 gliserol; %4 SDS (sadece çözünmez).
2. çözünür/çözünmez ayırma iletişim kuralı
Not: Bkz. şekil 1 bir şematik için.
- Tüpler her örnek için iki farklı etiket: "Soluble" ve "Çözünmez."
- X-µL buz gibi çalışma çözünür lizis arabelleği proteaz inhibitörleri (bkz: 1.1.1) doku ile takıma ekleyin.
Not: X = birim değişir doku miktarı bağlı olarak; Bkz. Tablo 1. - (Yani, striatum) fare beyin doku için dounce cam 1 mL douncer ve damlalıklı "Çözünmez" içine yavaş yavaş 30 kere tüp (buz üzerinde tutun) etiketli.
Not: bubbles formu olacak ve eksik homojenizasyon verim gibi douncing, başlattıktan sonra sıvı yüzeyinin kırmamaya dikkat et. - (Yani, HeLa, HEK293T) hücreler için hücreleri bir kez soğuk, 1 x PBS ile yıkayın. PBS kaldırmak ve asgari miktar lizis arabelleği hücrelere uygulayın ve hücre sıyırıcı kaldırın.
Not: İçin yukarıdaki hücre satır, hücre 6 iyi plaka başına 5 x 105 hücre, kaplama ve confluency yakın büyüdü. Bir tane de fare striatum için kullanılan birimleri karşılaştırılabilir. - Homogenate veya hücre içine lysate etiketli, "Çözünmez" tüpler aktarmak ve buz 1 h (son tüp işlendikten sonra başlangıç saat) koşullar.
Not: cep lysates için kuluçka başlamadan önce hücre kümeleri bölmek için birkaç kez triturate. Kabarcıklar oluşumunu önlemek. Kısaca girdap darbe her örnek için 1 s lysing aracılığıyla yarı yolda. - 15.000 x g 20 dk için de 4 ° C'de örnekler santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant "Soluble" kesir olarak kurtarmak.
- Damlalıklı ile kaldırmak için bu kesir kontamine gibi Pelet/bulutlu katman bozmamaya dikkat. Damlalıklı çözünür kesir "Soluble" içine tüp etiketli. Buz üstünde tutun.
- Her yıkadıktan sonra Pelet 500 µL lizis arabellek (x2) ve santrifüj ile 15.000 x g 5 min için de 4 ° C'de yıkama; Bulutlu katman bazıları kapalı pipetted sorun değil.
- Son yıkama sonra kalan tüm yıkama arabellek yalnızca doku Pelet bırakarak kaldırın.
Not: Bu noktadan sonra çözünmez örnekleri şimdi oda sıcaklığında tutulmalıdır. - Resuspend Pelet X-µL lizis arabellek % 4 SDS ile takviye ile (birim Pelet boyutuna bağlı olarak ayarlanabilir; bkz. Tablo 1).
- Her örnek için 30 solüsyon içeren temizleyicide s bir sonda sonicator ile oda sıcaklığında (125 Watt, 20 kHz, nabız, genlik % 40, bkz: Malzemeler tablo).
- (Haddeleme kaynatın) örnekleri için 30 dk kaynatın; Kısaca santrifüj kapasitesi (15 s) 6.000 x g herhangi bir örnek kaybetmemek için de.
- DC (deterjan uyumlu) protein tahlil gerçekleştirmek ( Tablo malzemelerigörmek) veya Lowry protein tahlil protein konsantrasyonu (1/5 ilgili lizis arabelleği hücre kültürü için örnek ve 1/10 için doku lysates başlamış dilutions önerilen) ölçmek için.
Not: Protein konsantrasyonları yüksek deterjan konsantrasyon nedeniyle DC veya Lowry tahlil kullanarak okunması gerekir. - Donma-çözülme sorunları önlemek için 50 µL toplu işleme aliquot örnekleri.
Not: İletişim kuralı burada daha fazla biyokimyasal analiz önce her iki kesirler-20 ° C'de depolayarak duraklatılmış
3. Western Blot ve miktar
- Batı açıkları olarak bildirilen başka bir yerde1,13 30 µg sulandrarak Örnek 1:1 arabellek (boya, 1 azaltmak x yükleme x 1.6) yük içinde yerine getirilir.
Not: protein fraksiyonu başına 30 µg yeterlidir, ancak en iyi çözünürlük için ayarlanabilir. 3 - %8 Tris-asetat Poli-Akrilamid jelleri çözünmez kesir için kullanılmalıdır. 4 - %12 bis-Tris jelleri çözünür kesir için tavsiye edilir. - Kısaca 5 dk. santrifüj örnekleri (haddeleme kaynatın) kaynatın (15 s) örnek toplamak için 6.000 x g de.
- Kesirler SDS-sayfa ve western blot, azaltılmış örnekleri için üreticinin protokolüne göre analiz.
Not: Çözünmez kesir en iyi 0,45 µM nitroselüloz membran Transfer edildiğinde giderir. 0,45 veya 0.2 µM nitroselüloz faiz protein büyüklüğüne bağlı olarak çözünür kesir için kullanılabilir. Bazı optimizasyon HMW malzemeleri en iyi transferi için gerekli olabilir. - Membran protein verimlilik yükleme görselleştirmek için tüm protein leke ile (örneğin, MEMcode, bkz: Malzemeler tablo) leke.
Not: Batı lekesi ortalama piksel yoğunluğu tarafından çözümlenebilir. Çözünür kesirler en iyi deneysel sistemi için uygun bir ev tutma protein için normalleştirilmiş. Çözünmez kesir olarak göreli protein bereket tersinir protein boyama veya ayrı leke üzerinde Histon 3 normalleştirme tarafından doğrulandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kararlılık-in ayırma takip çözünür ve çözünmez hücre lysates Batı analizi ve filtre retardasyon deneyleri (Şekil 2) kullanarak tespit edilebilir. Örnek olarak, HEK293T hücre transfection reaktifi (örneğin, lipofectamine 2000) kullanarak transfected, ile HTT exon 1 kodlama cDNA 97 glutamin içeren Poli prolin zengin bölgeye göre takip15 tekrarlar ve bu hücreler için izin verildi 44 h. hücreleri tedavi edildi için hızlı ya 5 mikron ile proteasome engellemek için MG132 veya DMSO 18 s hasat öncesinde ve olarak lysed için bir denetim olarak yukarıda açıklanan. Ayırma Protokolü mutant HTT exon 1 civarında 45 kDa 4-%12 Bis-Tris sayfa jelleri ve 3-%8 Tris-asetat sayfa jelleri (şekil 2A) üzerinde HMW çözünmez birikmiş tür olarak çözünür bir monomer giderir. Sayısal ve bir ev tutma protein için normalleştirilmiş çözünür monomer (gösterilen burada GAPDH olarak). HMW, çözünmez mHTT ortalama piksel yoğunluğu tarafından göreli protein bereket sayılabilir. İnhibitörü MG132 ile tedavi, mHTT HMW, çözünmez mHTT buna karşılık gelen bir artış ile birlikte, çözünür monomer belirgin bir azalma olur.
Çözünmez kesirler çözünmez, fibriler mHTT16 (şekil 2B) gidermek için bir filtre retardasyon tahlil gibi ek teknikleri tarafından çözümlenebilir. HeLa hücreleri benzer şekilde yukarıdaki gibi 97Q-HTT exon 1 ve O'nun-SUMO-1 veya O'nun-SUMO-2 ile transfected. Hücreleri ayırma önce 18 h için DMSO ya da MG132 ile tedavi edildi ve western blot ve filtre retardasyon deneyleri kullanılarak analiz. Veri overexpressed SUMO izoformu varlığı HMW ve fibrillary çözünmez mHTT arttığını gösterir. MG132 ilavesi çözünmez mHTT türler artış exacerbates. HWM mHTT türler de overexpression veya azaltma HD hastalığı hedefinin PIAS1 her iki HeLa hücreleri13 ve fare striata1 (şekil 2C-D) modülasyonlu. PIAS1 nakavt, HD, R6/2, PIAS1 karşı bir siRNA viral teslim kullanarak hızla devam eden fare modeli HMW çözünmez mHTT birikimi azaltır. PIAS1 viral overexpression R6/2 farelerde HMW çözünmez mHTT (şekil 2B)1dikkate değer bir artış yol açar. Çözünürlük kesirler arasındaki değişikliği ölçülebilir ve bu iletişim kuralı modülasyonu bu hastalık müdahalenin önceden klinik Biyokimya değerlendirmeler için uygun tekniği yapım patojenik mutant protein türlerin izleyebilirsiniz gösterir. Çözünmez değişimler, fibriler mHTT türlerin akı MG132 ile tedavi veya düzenleme PIAS11gibi potansiyel tedavi hedefleri, modülasyonlu protein türler arasında da esir alma.
Şekil 1: çözünür/çözünmez Ayırma Protokolü ve protein çözüm. (A)görsel boru hattı için Ayırma Protokolü. Burada açıklanan protokol fare doku veya hücre kültür örnekleri için uygulanabilir ancak Ayarlamardan başka örnek türleri için uygundur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: temsilcisi sonuçlar Soluble ve çözünmez fractionations ve analizler için. (A)Soluble ve çözünmez kesirler bir 4-%12 Bis-Tris ve 3-%8 Tris-asetat sayfa jelleri, saygıyla çözüldü HEK293T hücre lysates üzerinden. Denetim yükleniyor GAPDH için normalleştirilmiş çözünür kesir mHTT exon 1 çözünür monomer MG132 maruz göre dalgalanma gösterir. Çözünmez kesir HMW birikmiş mHTT tür MG132 tedavi ile aynı zamanda modülasyonlu gösterir. Batı leke ve filtre retardasyon analizleri kullanarak HeLa hücre lysates dan çözünür ve çözünmez kesirler (B) Analizi: HeLa hücreleri O'nun-SUMO-1 veya SUMO-2 ve/veya 97Q-HTT exon 1 ile transfected ve 5 mikron ile tedavi MG132 18 hr.* (C) için Çözünür ve çözünmez ayırma HeLa hücreleri 97Q-HTT exon 1 ve ya overexpressing overexpressed PIAS1 veya PIAS1 gösteri düzenleme potansiyel terapötik target.* (D) modülasyonlu sonra HMW mHTT birikimi, karşı bir siRNA ile tedavi Fare striata üzerinden çözünmez kesirler mikroRNA karşı PIAS1 ile tedavi ve 3-%8 Tris-asetat sayfa jelleri Haritayı modülasyon HWM çözünmez mHTT ** üzerinde çözüldü. Paneller (ABC) izni13ile değiştirildi. Paneli (D) izin1ile değiştirildi. * O'Rourke'ye gitti ve arkyayımlanmaktadır. 13 ile izni. ** Ochaba ve ark. yeniden basıldı 1 Elsevier izniyle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Doku (başına yarıküre) | Yaklaşık ağırlığı (mg) | Birim çözünür (µL) | Birim çözünmez (µL) |
| fare Striatum | 30 | 250 | 150 |
| fare korteks | 100 | 500 | 250 |
| farenin Hipokampus | 30 | 250 | 150 |
| fare beyincik | 40 | 250 | 150 |
| fare iskelet kas * | 100 | 300 | 150 |
| fare karaciğer (LOB) | 100 | 400 | 200 |
| * bağ dokusu sütlü arabirimi oluşturur; kirlenmesini önlemek için Kaldır | |||
Tablo 1: hem çözünür ve çözünmez lizis arabellekleri için doku özel ayırma birimleri (X) önerilir. Çözünmez lizis arabellek hacmi ayarlanabilir malzeme miktarını başlatılırken göre buna göre çözünmez Pelet boyutuna göre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bazı önlemler tutarlı ve kantitatif sonuç sağlamak yukarıdaki iletişim kuralları için ihtiyaç vardır. İlk olarak, mHTT her iki kesirler kendiliğinden toplamları üzerine birden çok donma çözülme çevrimleri, zamanla oluşturacak özellikle ne zaman yüksek bir konsantrasyon içinde. Böylece protein preps aliquots dondurma ve yalnızca gerekli birim Protokolü yukarıda açıklandığı gibi tahlil çalıştırmadan önce çözülme çok önemlidir. Ayrıca, çözünmez kesir çözdürme üzerine beyaz precipitant belirtiyorsa, sulandırma bir ek 5 s sonication darbe, 5 dk kaynatın ve biyokimyasal deneyleri ile analiz önce yeniden Nefelometri tarafından gerekli olabilir.
Bu tahlil için nicel çözümleme çözünür kesir bir yükleme denetim veya ev tutma gen her örnek içinde olan için ortalama piksel yoğunluğu normalleştirme tarafından ulaşılabilir. Ağırlıklı olarak sitozol (şekil 1) yerelleştirir gibi burada gösterildiği gibi GAPDH için çözünür kesir bir ev tutma gen kullanıldı. Yaygın olarak kullanılan diğer ev tutma proteinlerin aktin, α-tübülin ve Erk 1/2 vardır. Ancak, uygun normalleştirme proteinler kararlı duruma ifade doğru ve etkilenmemiş normalleştirme için emin olmak için eğitim sistemi için optimize edilmelidir. Çözünmez kesir GAPDH1eksikliği ve Histon 3 varlığı tarafından görüldüğü gibi ham nükleer kesir olarak hizmet vermektedir, % 3-8 sayfa sınırları tespit için yaygın olarak jelleri çözünürlüğüne nükleer işaretleri kullanmışlardır. Bu nedenle, çözünmez kesir protein bereket göreli bir temsili ham sinyal yoğunluk değeri kullanarak miktar için uygundur. Ancak, tersinir protein lekeleri gibi tüm protein işaretleri denetimine yükleme protein değişimler için kullanılır ve çözünmez kesir normalleştirme faktörü olarak adapte.
Ayrıca, ayırma çözünür ve çözünmez mHTT türler çözme yolu sağlarken, mHTT hastalık patogenezinde, bazıları çözünmez kesir ayırt olmayacaktır boyunca çok sayıda konformasyon değişiklikleri uğrar. Ayrıca, bazı biçimler beneficially hastalık sonucu doğru katkıda bulunmak ve istikrarlı Gümrükleme ara ürün hareket. Bu nedenle Escherichia türleri için sonuçları ile ilişkili diğer mHTT conformers belirlemek önemlidir. Bazı optimizasyon diğer mHTT ara ürün görselleştirmek gerekli olabilir. Toplam konsantrasyonları düşürmek için dayanıklıdır bu sorunu çözmek için SDS yüzdesi % 20'si artırılabilir.
Bu iletişim kuralı protein ayırma koşulları ve çeşitli biçimler ve mHTT birikimi ve toplama parçaları hücre kültürü ve HD bir transgenik fare modeli tespit ortaya çıkan deneyleri gösterir. Bu tür bir biyokimyasal protein yalıtım diğer HD modellerinde hastalık progresyon değerlendirmesi için öngörülen ve mHTT dynamics hücre ve hastalık patoloji üzerindeki etkileri içinde büyüyen anlayış için katkıda bulunabilir.
Ayırma sonra sayısız şekillerde örnekleri işlenebilir. SDS-sayfa western blot analizi tarafından takip göreli bir değerlendirme mHTT türler1düzeyde sağlamak için çözünür ve çözünmez mHTT tür çözümler. Kesirler daha da mHTT türler değerlendirmek için ek biyokimyasal deneyleri içinde değerlendirmek mümkündür. Örneğin, özel Jel Elektroforez (yaş) gidermek ve filtre geriliği (FR) tahlil çözünmez, fibrillary mHTT tür16,17algılamak için güçlü bir araç iken çözünür, oligomeric mHTT, algılamak.
Ek bir avantaj bu tahlil sunar protein mislocalization patogenezi ile ilgili bir değerlendirme olduğunu. 18içinde gösterildiği bu Ayırma Protokolü görselleştirme ve göre büyük çözünmez toplamları münzevi gibi görünüyor ve bir standart sayfa jel çözmeyebilir proteinler gibi Rangap1, izlenmesini sağlar. Bu tahlil, aynı zamanda bir ham nükleer/sitoplazmik ayrılık hizmet gibi Ayrıca, bir de mislocalization proteinler, örneğin, p65, HD fare modelleri1ölçebiliyor.
Analiz için önemli bir motivasyon mHTT toplama ve birikimi roman HD teşhis ve tedavi gelişmedir. İnhibe veya mHTT toplama ters bileşikler yüksek üretilen iş ekranlar ve hedeflenen testleri1,12,19,20,21tespit edilmiştir. Ancak, birçok mHTT biçimlerinin çözümlenmesinde zorluk göz önüne alındığında, toplama modülasyon değerlendirilmesi her zaman mümkün olmamıştır. Geleneksel lizis yöntemleri potansiyel çözünmez toplam protein içeren pelleted hücresel enkaz kurtulmak veya lizis arabellekleri solubilization için yeterli deterjan içermeyebilir. Burada açıklanan yöntemi yalıtma ve hücre tabanlı veya önceden klinik in vivo Değerlendirmeler biyokimyasal bir işaretleyici olarak kullanılan mHTT toplanan bir şeklinde tespit için bir platform sağlar.
Burada açıklanan deneyleri için misfolded diğer proteinler uygulanabilir. Misfolded protein dinamik özelliği nedeniyle, bu deneyleri etkili protein homeostazı ve toplama derinlemesine mekanizmaları ortaya çıkarmak için diğer analizler ile birleştiğinde olabilir. Bu analizler ve kararlı duruma düzeyde toplamları ve onların bölümleri farklı hücre kesirler (şekil 1) ya da protein katlama/saflaştırılmış rekombinant proteinler kullanarak toplama analizini ölçme içerir. Bu deneyleri genetik veya farmakolojik modülasyon doğrudan veya dolaylı etkileri protein yıkımı veya toplama ayırmak için yardımcı olur. Önceki vitro synuclein bir şeker toplama Değerlendirmeler22üzerinde bina, biz beri bu iş için Parkinson hastalığı fare modelleri çeşitli biçimler synuclein bir23gidermek için başvurdum. Bu nedenle, bu çalışmada açıklanan protokoller protein misfolding ve toplama diğer modelleri için uygulanabilir ve bulma ve yeni tedavi toplanan proteinler hedefleme gelişimine katkıda bulunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser NIH (RO1-NS090390) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Dr. Joan Steffanfor teknik yardım ve tartışma bu tahlil geliştirilmesi sırasında teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
References
- Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
- La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
- Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
- Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
- Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
- Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
- Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
- Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
- Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
- Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
- O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
- Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
- Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
- Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
- Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
- Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
- Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).
