Summary
يصف لنا هنا طريقة لعزل وتنقية الخلايا الجذعية من الأقسام التشريحية المختلفة في المسالك التناسلية الأنثى البشرية لتقييم خصائصها الشكلية والوظيفية. هذا الأسلوب يمكن تكييفها لعزل الخلايا الجذعية من الأنسجة المخاطية الأخرى أو الخلايا المناعية الأخرى.
Abstract
وصف الإنسان الخلايا الجذعية (DCs) المقيم في الأنسجة المخاطية صعبة نظراً لصعوبة الحصول على عينات، وانخفاض عدد وحدات تحكم المجال Dc يقدم كل الأنسجة. حتى الآن، كما يتم تعديل النمط الظاهري والوظيفة لوحدات تحكم المجال Dc بالبيئة الأنسجة، من الضروري لتحليل الأنسجة، السكان المقيمين على العاصمة، حيث الدم اشتقاق وحدات تحكم المجال Dc غير كامل تعكس التعقيدات من وحدات تحكم المجال Dc في الأنسجة. نقدم هنا بروتوكولا لعزل وحدات تحكم المجال Dc من البشرية الإناث المسالك التناسلية (معاهدة سجل الأفلام) باستخدام عينات من استئصال الرحم تسمح التحليلات الشكلية والفنية على حد سواء. البروتوكول يتكون من هضم الأنسجة لإنشاء خلية واحدة مختلطة تعليق خلية، متبوعاً بالتحديد حبة المغناطيسية إيجابية. تنشق بروتوكولنا الهضم الأنسجة لا علامات السطح، مما يسمح للتحليل الشكلية والوظيفية لوحدات تحكم المجال Dc في حالة مستقرة، دون تنشيط خلية أو الحضانة بين عشية وضحاها. هذا البروتوكول يمكن تكييفها للعزلة لأنواع أخرى من الخلايا المناعية أو عزلة من وحدات تحكم المجال Dc من الأنسجة الأخرى.
Introduction
معاهدة سجل الأفلام له وظيفة مزدوجة لحمايتها ضد العوامل الممرضة بينما يسمح لغرس والحمل1. لإنجاز هذا، هو معاهدة سجل الأفلام مجزأة، مع كل منطقة التشريحية عرض الخصائص الفريدة في غذائها والمناعية، والوظيفي1.
وحدات تحكم المجال Dc في الأسطح المخاطية إجراء اتصالات مع الميكروبات في الرئة والأمعاء، والتناسلي، وتوفير المراقبة المناعية ل مسببات الأمراض المحتملة2. وحدات تحكم المجال Dc بقدرة فريدة على رئيس الوزراء السذاجة خلايا تي وتؤدي إلى الاستجابات المناعية التكيفية3. وحدات تحكم المجال Dc في معاهدة سجل الأفلام أيضا متخصصة أن تتسامح مع المستضدات الخارجية، مثل تلك التي وجدت في الحيوانات المنوية والجنين النامي، للسماح للحمل ناجحة4. ولذلك، اعتماداً على الموقع، DC النمط الظاهري ووظيفة ستكون متميزة. ومن المعروف أن وحدات تحكم المجال Dc تتأثر بشدة بالبيئة الأنسجة، حيث أن عددهم، والنمط الظاهري، ووظائف يتم تعديلها بواسطة أنسجة البيئة التي يقيمون فيها3. لذلك، لفهم الدور الذي تؤديه "معاهدة سجل الأفلام وحدات تحكم المجال Dc" في الأمراض المعدية، والحمل، والسرطان في معاهدة سجل الأفلام، المقيم وحدات تحكم المجال Dc تحتاج إلى دراسة، منذ الدم المشتق DC نماذج غير كافية لمعالجة التعقيدات التنظيمية الموجودة في أنسجة معاهدة سجل الأفلام.
وصف الأنسجة البشرية تتحدى DCs المقيمين نظراً لانخفاض عدد الخلايا الموجودة في الأنسجة المخاطية وصعوبة الحصول على عينات الأنسجة البشرية. وقد درست وحدات تحكم المجال Dc في معاهدة سجل الأفلام إيمونوهيستوتشيميستري5،6، الذي يبلغ عن موقع الخلية داخل الأنسجة، ولكن يحول دون الدراسات الفنية، ومحدودة في العدد من تحديد علامات الخلية التي يمكن تحليلها باستخدام في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، كانت خلية مفردة العزلة البروتوكولات لتحليل تدفق سيتوميتريك المتقدمة7،،من89. بعض من هذه البروتوكولات الاستفادة من القدرات المهاجرة من وحدات تحكم المجال Dc لعزل تلك الخلايا التي تهاجر. عادة ما تكون هذه الأساليب تتطلب إينكوبيشنز بين عشية وضحاها، والتحديد لتنشيط وحدات تحكم المجال Dc، ولكن لا تسمح بدراسة وحدات تحكم المجال Dc في حالة مستقرة.
هنا، باستخدام عينات من استئصال الرحم، ونحن الأمثل بروتوكولا لعزل وحدات تحكم المجال Dc من مختلف المواقع التشريحية في معاهدة سجل الأفلام، بطانة الرحم (م)، اندوسيرفيكس (CX)، واكتوسيرفيكس (ECX)، التي تمكن من التحليلات الشكلية والفنية على حد سواء. استخدام بروتوكول غير proteolytic هضم الأنزيمي، يمكن أن نشرع فورا بعد الهضم الأنسجة لتوصيف سيتوميتريك العزلة وتدفق الخلية دون تنشيط الخلية. استخدام قياس التدفق متعدد الألوان والتكيف مع الدراسات الفنية لانخفاض عدد الخلايا، ونحن يمكن تحديد وتوصيف المجموعات النادرة من وحدات تحكم المجال Dc في مواقع مختلفة FRT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت الدراسات التي تنطوي على البشر وفقا للمبادئ الواردة في "إعلان هلسنكي". وافق دراسات كلية دارتموث المؤسسية استعراض المجلس واللجنة لحماية المواد البشرية (كفس). تم الحصول على الموافقة الخطية قبل الجراحة من فيروس نقص المناعة البشرية المرأة تمر هيستيريكتوميس في المركز الطبي دارتموث هيتشكوك (لبنان، نيو هامبشاير). الأطباء المدربين اختيار عينات الأنسجة من م و CX ECX، خالية من الآفات المرضية وبعيدة عن مواقع علم الأمراض. وتم الحصول على عينات دم من المانحين صحية المتطوعين المعينين في دارتموث هيتشكوك المركز الطبي. وكانت الجهات المانحة الدم المجهول. الأنسجة م و CX ECX طازجة معزولة من غرفة العمليات نقلت إلى علم الأمراض للعزل والتصنيف السابقة لنقل إلى مختبرنا في أنابيب البولي بروبلين منفصلة، وعقيمة.
1-الانزيمية هضم الأنسجة
ملاحظة: استخدام مواد معقمة والعمل في مجال سلامة بيولوجية مجلس الوزراء.
- إعداد متوازن الملح الحل (حبس هانك معدلة ل) باستخدام 1 x HBSS مع الفينول الحمراء و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين، 0.35 غرام/لتر ناكو3و 20 مم حبيس.
- إعداد كوكتيل الانزيمية (تعديل deoxyribonuclease 0.01 ٪ [wt/المجلد] حبس، U/mL 450 كولاجيناز الرابع، الأول، و 2 ملغ/مل د-الجلوكوز). تمرير الحل من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر عقيمة. وبشكل مثالي، إعداد إنزيم الهضم اليوم من استخدام، ولكن أنها يمكن أن تجمد في-20 درجة مئوية للتخزين. تجنب تجميد والغاء دورات متكررة.
- شطف الأنسجة مع تعديل هبس ومكان في طبق بتري2 100 × 15 ملم. ضبط حجم صحن بيتري استناداً إلى كمية الأنسجة المتاحة وحجم إنزيم الكوكتيل المستخدمة (راجع الخطوة 1-4-2 أدناه).
ملاحظة: الأنسجة تختلف في الحجم تبعاً للعينة الجراحية التي تم الحصول عليها من علم الأمراض، تتراوح بين 1-10 غ. - المعالجة المادية مع المتاح دون مشرط وملقط:
- إضافة حوالي 3 مل إنزيم الهضم كوكتيل للأنسجة لمنع تجفيف أثناء القطع.
- استخدام الملقط لتثبيت الأنسجة وفرم مع مشرط لزيادة المساحة السطحية للأنسجة المعرضة لأنزيم الهضم كوكتيل. قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة (< 2 ملم في جانب). إضافة كوكتيل إنزيم الهضم كافية لتغطية جميع قطع الأنسجة (5 مل/غرام أنسجة). ضع الغطاء على طبق بيتري.
- احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 في دوار حوالي 80 لفة في الدقيقة ل 45 دقيقة تكفل أن سرعة المدورة يمزج دقيق كوكتيل إنزيم الهضم دون إراقة أو تنتج فقاعات.
- تصور إعداد الأنسجة مجهر مقلوب خفيفة مع 4 X وأهداف X 10.
ملاحظة: بعد الهضم، شظايا صغيرة من الأنسجة وتعليق خلايا مختلطة بما في ذلك الغدد الظهارية مرئية يجب أن تكون موجودة (انظر الشكل 1A).
2-الفصل المادي للخلايا المفردة
- في بيئة معقمة، ضع مشدود 250 ميكرون مع حامل في طبق بتري2 150 × 15 ملم. تأكد من أن الشبكة حوالي 0.5 سم فوق سطح طبق بيتري.
- الرطب الشبكة مع 2 مل هبس المعدلة ونقل الأنسجة هضمها على الشبكة.
- استخدام سطح مستو من المكبس حقنه 10 مل، بلطف ولكن بحزم، طحن الأنسجة مفروم هضمها من خلال الشبكة.
تنبيه: طحن جداً قوة سوف تلحق الضرر الشبكة وزيادة الوفيات الخلية. هذه الخطوة سوف فصل الخلايا الظهارية والخﻻيا اللحمية (بما في ذلك الخلايا المناعية) من النسيج الضام والمخاط. - مرة واحدة قد تم تفريق أجزاء الأنسجة دقة، رفع مستوى الشبكة والحامل 2-3 سم فوق طبق بيتري والشطف مع 3 مل من تعديل حبس لاسترداد خلايا إضافية.
- جمع تعليق خلية. ضع 20 ميكرون مع حامل في طبق بتري والرطب مع 2 مل حبس معدلة. من أجل تعليق خلية عن طريق الشبكة القابضة الشبكة 2-3 سم فوق طبق بيتري، وشطف مع 6 مل حبس معدلة.
ملاحظة: هذه الخطوة سيتم فصل الأوراق الظهارية، التي يتم الاحتفاظ بها في الجزء العلوي من الخلايا المفردة التي تمر عبر الشبكة. -التدفق عبر هو تعليق خلايا مختلطة، التي تتضمن الخلايا المناعية والخلايا الليفية السدويه المعدية المعوية. - جمع تعليق خلية مختلطة وأجهزة الطرد المركزي في ز 500 x لأدنى 10 أسبيراتي السائل وريسوسبيند بيليه في 4 مل حبس معدلة للكثافة المتدرجة الطرد المركزي.
- طبقة الخلايا المختلطة تعليق أكثر من 3 مل من حل بوليسوكروسي والطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في 500 x ز مع لا الفرامل. جمع الفرقة بيضاء من الجزء العلوي من الحل بوليسوكروسي وتغسل مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: هذا جزء من تعليق التخصيب الخلايا المختلطة، التي هي غنية بالخلايا المناعية، وتحتوي على بعض الخلايا الليفية اللحمية.
3. إزالة الخلية الميت
ملاحظة: إذا كانت نسبة كبيرة من الخلايا الميتة (> 20%) موجودة في تعليق التخصيب الخلايا المختلطة بعد الكثافة المتدرجة الطرد المركزي، ينصح إزالة خلية ميتة مع الخرز المغناطيسية. الخلايا الميتة بحاجة إلى إزالة نظراً لأنها قد تتداخل مع عملية اختيار حبة المغناطيسية إيجابية.
- عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير في مجهر خفيفة بهدف X 10. زيادة ونقصان لأسفل كافة الخلايا في تعليق التخصيب الخلايا المختلطة (500 × ز، 10 دقيقة، 4 درجة مئوية). تماما نضح وتجاهل المادة طافية. إضافة 100 ميليلتر من حبات إزالة خلية ميتة الواحدة 1 × 107 مجموع الخلايا (الحية والميتة)، ووفقا لإرشادات الشركة المصنعة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- وضع عامل تصفية 30 ميكرومتر في العمود المغناطيسية وتطبيق تعليق خلية والسماح بتدخل من خلال العمود المغناطيسي الخلايا المسماة حبة.
- شطف العمود مع المخزن المؤقت لإزالة خلية الميت الموصى بها (3 مل). جمع-التدفق عبر تحتوي على خلايا حية. ويرد في الشكل 1Bنطاق الخلية الانتعاش بعد إزالة خلية ميتة.
ملاحظة: يمكن استخدام هذه الخلايا لأداء التدفق الخلوي تلطيخ للدراسات الشكلية (القسم 5) أو مواصلة عزل العاصمة (القسم 4).
4-DC تنقية بالتحديد حبة المغناطيسي الإيجابية
- بعد إزالة الخلايا الميت (الخطوة 3، 2)، تدور الخلايا إلى الأسفل وإزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في المخزن المؤقت للتحديد المغناطيسي ميليلتر 80 الواحدة 1 × 107 خلايا (PBS، 0.5% معطل الحرارة البشرية AB المصل (النظام المنسق)، 2 مم يدتا).
- للتحديد الإيجابي لسكان العاصمة، إضافة الخرز المغناطيسي CD1a أو CD14 وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (20 ميليلتر المغناطيسي الخرز الواحدة 1 × 107 الخلايا). احتضان لمدة 15 دقيقة على 4درجة مئوية.
- تغسل الخلايا مع المخزن المؤقت التحديد المغناطيسي وتدور إلى أسفل، وإزالة المخزن المؤقت بشكل كامل. ريسوسبيند الخلايا في حد أدنى من 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للتحديد المغناطيسي.
- إرفاق العمود بالمغناطيس وإضافة عامل تصفية 30 ميكرومتر على رأس العمود إلى الاحتفاظ بأي كتل الخلايا المتبقية. شطف بالتصفية والعمود مع المخزن المؤقت للتحديد المغناطيسي كما أوصى.
- تطبيق تعليق خلية العمود. شطف 3 مرات بالتحديد المغناطيسي المخزن المؤقت.
- نقل العمود إلى أنبوب 15 مل وإضافة 5 مل من المخزن المؤقت للتحديد المغناطيسي وتطبيق المكبس للإفراج عن الخلايا المحددة من العمود.
- لزيادة النقاء، كرر الخطوات 4، 4-4.6 مع الخلايا تم استردادها باستخدام عمود جديد. نطاق الخلية الانتعاش بعد التحديد المغناطيسي حبة يرد في الشكل 1.
5-تقييم نقاء الخلية: التدفق الخلوي والفحص المجهري
- جسم تلطيخ للتدفق الخلوي:
- ريسوسبيند تصل إلى 1 × 106 خلايا في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 20% الحرارة-إبطال النظام المنسق لمنع مستقبلات Fc، واحتضان لمدة 10 دقائق على الجليد.
- إضافة المطلوب المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة والكاشف لتحديد الخلايا الميتة (على سبيل مثال انظر الفرع 6-5). تعيين fluorescence ناقص واحد عناصر التحكم (FMO) إنشاء البوابات، واستخدام الخرز التعويض لإعداد عناصر تحكم مفردة وصمة عار للتعويض. أمثلة للأجسام المضادة المستخدمة في الجدول 1. احتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء.
- تغسل الخلايا مع 2 مل من المخزن المؤقت للتحديد المغناطيسي.
ملاحظة: وجود يدتا مهم لتجنب تشكيل خلية التثاقل لتحليل تدفق سيتوميتريك. زيادة ونقصان لأسفل وتجاهل المادة طافية. - إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 100 ميليلتر من محلول بارافورمالدهيد 2% كل أنبوب.
- تحليل العينات في10،سيتوميتير تدفق11.
- وتدور العمود (مثلاً، سيتوسبين) استخدام Giemsa تلطيخ لتحليل التشكل:
- ريسوسبيند الخلايا في 200 ميليلتر من المخزن المؤقت للتحديد المغناطيسي.
- تحميل في العمود تدور وتدور لمدة 5 دقائق. واسمحوا الشريحة جاف تماما.
- إصلاح الشريحة بالانغماس في الميثانول 100% للحد الأدنى 2 شطف الشريحة مع المياه والسماح للهواء الجاف.
- تؤدي تلطيخ Wrights Giemsa القياسية. تغطية الخلايا مع ويوزين واحتضان لمدة 10 دقائق والشطف بماء منزوع وأتركها تجف. تغطية الخلايا مع جيمسا Wrights وصمة عار واحتضان لمدة 1 دقيقة، الشطف بماء منزوع والهواء الجاف.
- النظر في الأعمال التحضيرية مع مجهر مقلوب (الشكل 2A، 40 س الهدف).
6-متمكنة التحفيز المقايسة لتقييم الدالة Cell DC
- ذوبان الجليد خلايا الدم المحيطية المجمدة وحيدات النوى (ببمكس)
- الحارة وسائل الإعلام ثقافة الخلية مع 10% HS إلى 37 درجة مئوية.
- ذوبان الجليد في ببمكس بوضع في كريوتوبي في حمام مائي 37 درجة مئوية، حتى تبقى كمية صغيرة من الخلايا المجمدة وسائل الإعلام في كريوتوبي. في بيئة معقمة، نقل محتويات كريوتوبي إلى 10 مل وسائط الثقافة الخلية المعالجون مسبقاً مع 10% HS في أنبوب 15 مل.
- الطرد المركزي في ~ 500 غرام x للحد الأدنى 7 قم بإزالة الوسائط، تفريق بيليه، ريسوسبيند ببمكس في 10 مل من خلية ثقافة الإعلام مع 10% HS، وأجهزة الطرد المركزي الخلايا.
- كرر الخطوة يغسل مرة ثالثة. عد الخلايا.
- تحديد السذاجة تي-الخلية:
- استخدام أدوات تحديد خلية جسم مغناطيسي انتقاء سلبي لعزل ساذج خلايا تي وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- بعد العزلة، تحقق الطهارة استخدام الأجسام المضادة CD45RA و CCR7.
ملاحظة: هو نقاء نموذجية > 99% من السذاجة خلايا تي.
- ساذجة تي خلية انتشار صبغ التلوين:
- إعداد ميليلتر 600 2 x الحل لصبغ انتشار الخليوي، حماية الصبغ من التعرض للضوء.
- أغسل السذاجة خلايا تي 2 x مع برنامج تلفزيوني. ريسوسبيند الخلايا في 500 ميليلتر PBS.
- بينما فورتيكسينج بلطف إضافة الخلايا في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، 500 ميليلتر لصبغ انتشار السذاجة خلايا تي.
- احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق في 37درجة مئوية.
- وقف وسم الخلية بإضافة 5 مل من خلية ثقافة الإعلام مع 10% HS للخلايا. تبني على الجليد لمدة 5 دقائق، محمية من الضوء.
- الطرد المركزي الخلايا في ~ 500 غ س لمدة 7 دقائق، نضح وسائط الإعلام، وريسوسبيند الخلايا في 4 درجات مئوية من خلية ثقافة الإعلام مع 10% HS. كرر مرتين أخريين ليصبح مجموع يغسل 3. تأخذ قاسمة للخلايا لعد قبل الطرد المركزي الأخير.
ملاحظة: عادة، ساذجة النهائي أرقام تي خلية سوف تتراوح بين 5% و 15% من عدد الخلايا ببمك الأولى. - ريسوسبيند الخلايا مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية مع 10% HS في تركيز الخلايا المطلوب.
- ثقافة السذاجة DC متمكنة تي خلية المشارك:
- لوحة وحدات تحكم المجال Dc والسذاجة خلايا تي في صفيحة 96-جيدا، والمائدة المستديرة لأسفل، معزولة في 01:15 نسبة من وحدات تحكم المجال Dc لخلايا تي. التأكد من أن العدد الأمثل لوحدات تحكم المجال Dc يتراوح بين 3000 و 5,000 الخلايا/بئر.
- الطرد المركزي اللوحة في ~ ز 500 x لمدة 3 دقيقة لضمان تقع الخلايا في مركز البئر. خلية إلى خلية الاتصال مهم للإشارات الصحيحة تحدث.
- احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 6 أيام. رصد مجموعة الخلايا التي تظهر في الآبار كما يحدث الانتشار، مع الفحص المجهري (الشكل 3A).
- التدفق الخلوي تلطيخ لتقييم انتشار:
- بعد 6 أيام، يمكن فحص الخلايا بالتدفق الخلوي. وصمة عار ثقافة المشارك للتدفق الخلوي.
- تعد حلاً 2 x لصبغ الصفراء بقاء (الحد الأقصى من الانبعاثات 572 nm) في برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: استخدام برنامج تلفزيوني دون المصل مهم، كمصل بروتينات تتداخل مع الصبغ). - الطرد المركزي اللوحة مع الخلايا في ~ ز 500 x لمدة 5 دقائق.
- إزالة 100 ميليلتر من المادة طافية.
ملاحظة: عند هذه النقطة جمع وتخزين المادة طافية لتحليل منفصل من العوامل القابلة للذوبان. - تغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني: إضافة 150 ميليلتر/جيدا من برنامج تلفزيوني، والطرد المركزي في ~ ز x 500 لمدة 5 دقائق، إزالة 150 ميليلتر من المادة طافية مع ماصة. التأكد من أن هناك 50 ميليلتر من المادة طافية المتبقية في كل بئر.
- إضافة 50 ميليلتر من صبغة الجدوى x 2 لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة مدة 10 دقيقة، محمية من الضوء.
- أثناء الاحتضان، إعداد مزيج رئيسي من علامات جسم المطلوب. فعلى سبيل المثال: CD3 APC/Cy7، CD4 PE، CD8 فيتك، إلخ
- إضافة مزيج الأجسام المضادة لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة مدة 10 دقيقة، محمية من الضوء.
- تغسل الخلايا 2 x مع برنامج تلفزيوني + 2% HS: إضافة 150 ميليلتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني + 2% HS. الطرد المركزي في ~ ز 500 x لأدنى 5 إزالة 150 ميليلتر من المادة طافية مع ماصة.
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 100 ميليلتر/جيدا من الفقرة 2%-فورمالدهايد. إذا لزم الأمر: نقل الخلايا ووسائل الإعلام إلى أنابيب البولي بروبلين التدفق الخلوي. يمكن الإبقاء على 4 درجة مئوية أنابيب ومحمية من الضوء، وحتى تحليل تدفق سيتوميتريك.
- أنابيب القراءة في سيتوميتير تدفق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن ملاحظة التالي الأنسجة الهضم، الإفراج عن أوراق الظهارية والغدد، كما هو مبين في الشكل 1 (أ)؛ وهذا عنصر إيجابي يشير إلى نجاح عملية الهضم الأنزيمي. عدد مجموع الخلايا قادرة على البقاء ووحدات تحكم المجال Dc استرداد كل غرام من النسيج ترد أيضا في الشكل 1B و الشكل 1، على التوالي. وتمثل الخلايا المناعية بين 5-30% الخلايا اللحمية قبل كثافة استخدام الطرد المركزي12،13. ويبين الشكل 2 مورفولوجيا (الشكل 2A) ونقاء (الشكل 2، ج) وحدات تحكم المجال Dc معزولة. عندما يتم تنفيذ جولتين من التحديد كما ورد في البروتوكول، ونقاء المتوقع يتراوح بين 85-92% (الشكل 2). عدد الخلايا المستردة هو متغير ويعتمد على تباين حجم والمانحة الأنسجة الأولية. وقد وصف الخلايا المعزولة وصف13. ويبين الشكل 3 مقايسة تحفيز متمكنة ممثل لتقييم الأداء الوظيفي في العاصمة. ويبين الشكل 3 ألف كتل تي خلية المميزة التي تظهر عندما يحدث الانتشار، ويبين الشكل 3B تقدير الانتشار بالتدفق الخلوي. يمكن أيضا أن تكون فحوصات الوظيفية الأخرى، مثل التقاط الفيروسية أو إنتاج سيتوكين و chemokine يؤديها13. ويبين الشكل 4 استراتيجية النابضة لتحديد مختلف السكان وحدات تحكم المجال Dc في المقصورات التشريحية معاهدة سجل الأفلام المتميزة بعد تحليل تدفق--سيتوميتريك لتعليق التخصيب الخلايا المختلطة (الشكل 4 أ). معايرة الأجسام المضادة وعناصر سلبية هامة، كما عرض وحدات تحكم المجال Dc والضامة أوتوفلوريسسينسي عالية. ويبين الشكل 4BFMO عناصر التحكم. ويبين الشكل 4 أمثلة على كيفية تحديد مجموعات فرعية DC محددة، مثل CD1c + CD207 + أو CD103 + وحدات تحكم المجال Dc.
رقم 1: توافر التجهيز وخلايا الأنسجة. (أ) صورة تمثيلية صحائف الظهارية، وأفرج عنه بعد هضم أنسجة الغدد. (ب) مجموعة من العدد الإجمالي لخلايا قابلة للحياة شُفي بعد تجهيز الأنسجة وإزالة خلية ميتة في كل حجرة FRT: بطانة الرحم (م) واندوسيرفيكس (CX) واكتوسيرفيكس (ECX). كل نقطة تمثل الخلايا من موضوع مختلف. (ج) "عدد من وحدات تحكم المجال Dc" استرداد كل غرام من الأنسجة بعد عزل حبة المغناطيسية. B و C مقتبسة من13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: مورفولوجيا ونقاء الخلايا المعزولة. (أ) الجذعية مورفولوجيا الخلايا المعزولة يحدده الفحص المجهري بعد تلطيخ Giemsa. (ب) التعبير علامات المظهرية قبل وبعد حبة العزلة، كما يحددها التدفق الخلوي. (ج) نقاء التمثيلية التي تم الحصول عليها بعد CD1a + وحبه العزلة CD14 +. مقتبس من13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: انتشار المقايسة. صور مجهرية الممثل (A) T-خلية الكتلة تشكيل خلال الانتشار: مرحلة التباين (يسار)، انتشار صبغ تلطيخ (الأوسط)، وتراكب (يمين). (ب) مثال على الاستقراء من انتشار ثقافة المشارك بعد عزل بطانة الرحم CD1a + أو وحدات تحكم المجال Dc CD14 + ومتمكنة من السذاجة الحصول على خلايا تي من المجمدة ببمكس. ب مقتبسة من13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مختلطة توصيف Phenotypical من وحدات تحكم المجال Dc في الإثراء تعليق خلية من FRT. (أ) استراتيجية لتحديد وحدات تحكم المجال Dc في تعليق خلية مختلطة النابضة. ويرد كل السكان المبوب في قطع متعددة الألوان في الفريق القادم. إظهار مؤامرات كفاف CD11c + CD11b + و CD11c + CD11b-غيتس، على التوالي. يمكن الملون على علامات تحديد الخلايا غير المرغوب فيها باستخدام نفس القناة لاستبعادها من التحليل؛ على سبيل المثال، الخلايا الميتة CD3 + و CD19 + الخلايا. (ب) FMO عناصر التحكم لإنشاء بوابات المناسبة. (ج) التمييز ضد مجموعات فرعية DC اتباع استراتيجية النابضة. وقد اختيرت المؤامرات كفاف بدلاً من قطع متعددة الألوان لتمثيل أكثر دقة توزيع السكان عند إعداد الخلية كانت منخفضة10. أرقام الخلية منخفض المتوقع في نهاية الاستراتيجية النابضة، وحدات تحكم المجال Dc الأنسجة هي نادرة السكان. مقتبس من13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| علامة خلية | فلوروتشرومي | استنساخ | تركيز | كمية الأجسام المضادة كل عينة |
| (في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت) | ||||
| CD45 | vioblue450 | HI30 | 1.0 ميكروغرام/5µl | 0.4 ميكروغرام |
| CD11b | PE | ICRF44 | 1.0 ميكروغرام/5µl | 0.4 ميكروغرام |
| CD11c | بيركب/Cy5.5 | Bu15 | 200 ميكروغرام/مل | 0.4 ميكروغرام |
| CCR5 | PE Cy7 | 7 2 | 0.25 ميكروغرام/5µl | 0.1 ميكروغرام |
| CCR7 | PE Cy7 | REA108 | 99 ميكروغرام/مل | 0.2 ميكروغرام |
| الدكتور هلا | BV-570 | L243 | 100 ميكروغرام/مل | 0.2 ميكروغرام |
| الدكتور هلا | فيتك | AC122 | 82.5 ميكروغرام/مل | ميكروغرام 0.16 |
| CD3 | آسيا والمحيط الهادئ | UCHT1 | 16 ميكروغرام/مل | 0.03 ميكروغرام |
| CD3 | فيوجرين | REA614 | 137 ميكروغرام/مل | ميكروغرام 0.27 |
| CD163 | آسيا والمحيط الهادئ | غي/61 | 80 ميكروغرام/مل | ميكروغرام 0.16 |
| CD207 | آسيا والمحيط الهادئ | 1OE2 | 200 ميكروغرام/مل | 0.4 ميكروغرام |
| CD1a | فيتك | HI149 | 0.5 ميكروغرام/5µl | 0.2 ميكروغرام |
| CD1a | AF--700 | HI149 | 0.5 ملغ/مل | ميكروغرام 1.0 |
| CD103 | PE Cy7 | ب-Ly7 | 0.25 ميكروغرام/5µl | 0.1 ميكروغرام |
| CD83 | PE | HB15e | 0.25 ميكروغرام/5µl | 0.1 ميكروغرام |
| CD14 | آسيا والمحيط الهادئ لإطلاق النار | 3 63 | 400 ميكروغرام/مل | 0.8 ميكروغرام |
| CD209 | فيتك، بي، آسيا والمحيط الهادئ | 120507 | 1.25 ميكروغرام/0.25 مل | مكغ 0.01 |
| صبغ الصفراء بقاء الكسول | ||||
| 7AAD | 0.1 مغ/مل | 0.2ug |
الجدول 1: مثال للأجسام المضادة للتوصيف لوحدات تحكم المجال Dc في معاهدة سجل الأفلام بالتدفق الخلوي-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وحدات تحكم المجال Dc المخاطية هي خلية نادرة سكان تأثرا شديدا بالبيئة الأنسجة، مما يؤدي إلى تغيير النمط الظاهري، والدالة بمجرد دخولهم الأنسجة3. بينما تستمد الدم DCs نموذجا مفيداً للغاية، وهي لا تمثل كامل تنوع سكان العاصمة وجدت في الأنسجة. ولذلك، فهم الخصائص الفريدة لوحدات تحكم المجال Dc المخاطية، عزل الخلايا الأولية من الأنسجة ضروري. عزل من وحدات تحكم المجال Dc من مختلف المواقع التشريحية في معاهدة سجل الأفلام يوفر الفرصة لدراسة DC الدالة في المختبر ، وقارن بين المجموعات الفرعية في العاصمة والمواقع التشريحية.
ونقدم هنا بروتوكول يسمح للتنقية من وحدات تحكم المجال Dc من الأنسجة البشرية FRT في المختبر تقييم الخصائص الوظيفية. حيث تم العثور على وحدات تحكم المجال Dc في مواقع المخاطية في الأرقام منخفضة، قمنا بتطوير بروتوكول لإثراء الأنسجة الخلية بإعداد الكثافة المتدرجة الطرد المركزي وإزالة خلية ميتة قبل عزل الخلية مع الخرز المغناطيسية. سليم إزالة الخلايا الميتة مفتاح، كما أنها سوف تتداخل مع عزل حبة. يوفر هذا الأسلوب درجة نقاء عالية من الخلايا المعزولة إيجابيا (≈ 90%)، في فترة قصيرة نسبيا من الزمن (ح 4-6)، ودون الحاجة للاحتضان بين عشية وضحاها، وزراعة الخلايا في المختبر ، أو الهجرة قبل عزلة، كل منها يمكن تنشيط وحدات تحكم المجال Dc و تغيير خصائصها المظهرية. لدينا بروتوكول لا يؤدي تنشيط الخلية، مقيسة بالافتقار إلى التنظيم حتى نضوج علامات (CD86، الدكتور هلا، CD83)13. ميزة أخرى هي استخدام عملية الهضم الأنزيمي غير بروتيوليتيك، التي لم تهزم علامات السطحية ويسمح لعزل الخلية فورا أو تحليل phenotypical عقب الأنسجة الهضم14.
الحاسمة لهذا البروتوكول الجيل من تعليق خلية واحدة لتجنب انسداد الأعمدة المغناطيسية. ولضمان ذلك، يجب إزالة الخلايا الميتة قبل تحديد الخلية المغناطيسية، مرشحات الحاجة إلى استخدامها على رأس الأعمدة المغناطيسية، والأنسجة أكبر من الجيل الثالث 3g ينبغي أن تقسم بين عمودين. استخدام عمود الثانية بعد الجولة الأولى لتنقية هو المفتاح إلى خلية عالية النقاء.
واحد الحد من أسلوب العزل هو الملازمة لانخفاض عدد وحدات تحكم المجال Dc في الأنسجة معاهدة سجل الأفلام، والتي عادة ما لا يسمح باسترداد خلية جيدة للأنسجة أصغر من 1 غ. في ظل هذه الظروف، إلا أن التحليلات الشكلية يمكن لا يزال تنفيذ باستخدام التخصيب مختلطة تعليق خلية. وهذا ممكن بسبب الهضم غير proteolytic الطريقة المستخدمة، التي لم تهزم علامات السطحية ويسمح للتحليل الفوري لخلية النمط الظاهري بعد الهضم الأنسجة14. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون سن المريض عاملاً يؤثر على عدد الخلايا التي تم استردادها.
باستخدام هذا البروتوكول، ونحن قد أثبتت سابقا أن يوفر CD1a + عزل سكان phenotypically أكثر تجانساً من CD14 +13من التحديد؛ CD1a + "وحدات تحكم المجال Dc" غير صعوبة استرداد من معادل و ECX. بينما يمكن أيضا التعبير عن CD14 في الضامة، وجدنا أن CD14 FRT + السكان معزولة وغنية بوحدات تحكم المجال Dc، استناداً إلى تعبير المشارك من علامات DC وقدرتها على حفز متمكنة من السذاجة خلايا تي، ودالة مميزة لوحدات تحكم المجال Dc13.
نظراً للعدد من وحدات تحكم المجال Dc المستردة منخفضة عموما (< 100,000 مجموع الخلايا)، بحاجة إلى الدراسات الفنية الأمثل لأرقام الخلية منخفضة. هنا نعرض الأمثل للمقايسة التحفيز متمكنة، التي يمكن تنفيذها مع وحدات تحكم المجال Dc/بئر 3,000 فقط. قمنا بدراسات مهمة أخرى مع هذه الخلايا، بما في ذلك الاستجابة الهرمونية وسيتوكين وإنتاج مضادات الميكروبات الببتيد عند تنشيط فيروس نقص المناعة البشرية وفيروس نقص المناعة البشرية--التقاط بوحدات تحكم المجال Dc FRT13. حالما يتم عزلة وحدات تحكم المجال Dc ومطلي، ينبغي إجراء فحوصات خلال 24 ساعة، كما يقلل من جدوى الخلية بعد ذلك الوقت.
هذا البروتوكول يمكن تكييفها لعزل مختلف المجموعات الفرعية في العاصمة، أو أنواع الخلايا الأخرى عن طريق تحديد العلامات المناسبة بالإضافة إلى حبات مغناطيسية والجمع بين التحديد متسلسلة حبة الإيجابية والسلبية لإزالة أنواع الخلايا غير المرغوب فيها. تنبيه واحد، رغم ذلك، أنه مع كل جولة من اختيار بعض النسبة المئوية للخلايا سيتم فقدان، حتى لعزل FRT وحدات تحكم المجال Dc، التي هي بالفعل نادرة، وحجم الأنسجة الصغيرة عموما، جولات متعددة التحديد مع علامات مختلفة (والضرورية يغسل المرتبطة) غير مرغوب فيه. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييفها مع هذا البروتوكول لعزل الخلايا المناعية أو DCs الأخرى من14،أنسجة أخرى15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
Acknowledgments
منح دراسة تدعمها المعاهد الوطنية للصحة AI102838 و AI117739 (كرو). ونحن نشكر روسول ريتشارد للمساعدة التقنية. أجرى تحليل تدفق سيتوميتريك في دارتلاب، "الموارد المشتركة" في دارتموثسوبورتيد (P30CA023108-37) و (P30GM103415-15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
