Summary
Здесь мы описываем метод, чтобы изолировать и очистить дендритные клетки из различных анатомических отсеков в человека женского репродуктивного тракта для оценки их Фенотипические и функциональные характеристики. Этот метод может быть адаптирована для изоляции другие иммунные клетки или дендритные клетки от других слизистых тканей.
Abstract
Характеристика человека дендритных клеток (DCs) проживающих в слизистых тканей сложной из-за трудностей в получении образцов, и малочисленность РСУ представляют на ткани. Тем не менее измененная фенотипа и функции контроллеров домена является ткани окружающей среды, необходимо анализировать ткани жителей DC, поскольку кровь производные DCs неполно отражают сложность DCs в тканях. Здесь мы представляем протокол изолировать DCs от человека женского репродуктивного тракта (ФРТ) с использованием образцов гистерэктомия, позволяющий Фенотипические и функционального анализа. Протокол состоит из ткани пищеварение сформировать одну ячейку смешанные суспензию клеток, последовали положительные магнитный шарик выбор. Наши ткани пищеварение протокол не прилепится поверхностных маркеров, который позволяет Фенотипические и функциональный анализ DCs в стационарном состоянии, без ночи инкубации или клетки активации. Этот протокол может быть адаптирована для изоляции других типов иммунных клеток или изоляции DCs из других тканей.
Introduction
ФРТ имеет двойную функцию защиты от патогенов, позволяя имплантации и беременность-1. Для этого, ФРТ разобщенным, с каждого анатомического региона отображения уникальные гистологические, иммунологических и функциональные характеристики1.
DCs на слизистой поверхности сделать контакт с микробами в легких и кишечника, половых путей и обеспечивают иммунной наблюдения для потенциальных патогенов2. Контроллеры домена имеют уникальную возможность премьер наивные Т-клеток и инициировать адаптивного иммунного ответа3. DCs на ФРТ также специализированные терпеть иностранных антигены, например в спермы и развивающегося плода, чтобы позволить беременность4. Таким образом в зависимости от местоположения, DC фенотипа и функция будет собственный. Известно, что DCs сильно зависит от окружающей среды ткани, таким образом, что их количество, фенотип и функции изменяются средой ткани, в которой они проживают3. Таким образом чтобы понять роль, которую играют FRT DCs в инфекционных заболеваний и беременности, рака в ФРТ, резидентов DCs необходимо изучить, поскольку производные DC модели являются недостаточными для решения нормативные сложности в тканях FRT крови.
Характеристика тканей человека резидентов DCs является сложной задачей из-за низкого числа клеток в слизистой ткани и трудности с получением образцов человеческой ткани. РСУ были изучены в ФРТ, иммуногистохимия5,6, который сообщает о местонахождении клеток в тканях, но исключает функциональных исследований и ограничено количество идентификации ячейки маркеры, которые могут быть проанализированы с помощью за один раз. Кроме того протоколы изоляции одной ячейки для анализа потока гранулярных были развитых7,8,9. Некоторые из этих протоколов воспользоваться мигрирующих DCs способность изолировать те клетки, которые мигрируют. Эти методы обычно требуют ночи инкубаций и подбор активированного DCs, но не позволяют для изучения DCs в стационарном состоянии.
Здесь, используя образцы гистерэктомия, оптимизированный протокол изолировать DCs из различных анатомических сайтов в ФРТ, эндометрия (EM), эндоцервикса (CX) и ectocervix (ECX), что позволяет Фенотипические и функционального анализа. С помощью протокола не протеолитических ферментативного пищеварения, мы можем приступить сразу же после переваривания ткани для ячейки изоляции и потока гранулярных характеристика без активации клеток. Используя многоцветные проточной цитометрии и адаптации функциональные исследования для незначительного числа клеток, мы можем определить и охарактеризовать редких подмножеств DCs в различных сайтах фрахт
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследования с участием людей были проведены в соответствии с принципами, выраженные в Хельсинкской декларации. Исследования были утверждены Дартмутский колледж институциональных Наблюдательный Совет и Комитет для защиты человеческих субъектов (центрах). Письменное информированное согласие было получено до операции от ВИЧ негативных женщин проходят гистерэктомии в Дартмут-Хичкок медицинский центр (Ливан, NH). Подготовленных патологоанатомов выбранные образцы ткани из EM, CX и ECX, бесплатно патологических поражений и отдаленных от мест его патологии. Образцы крови были получены из добровольцев здоровых доноров, набранных в медицинский центр Дартмута Хичкока. Доноры крови являются анонимными. Свежевыделенных EM, CX и ECX тканей от операционной комнате были переданы патологии для изоляции и классификации до передачи в нашу лабораторию в отдельных, стерильные полипропиленовые трубы.
1. ферментативный пищеварения тканей
Примечание: Использование стерильных материалов и работы в биологической безопасности кабинета.
- Подготовьте измененный Хэнк сбалансированный соли раствор (HBSS) 1 x HBSS с помощью фенола красного, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина, 0,35 г/Л NaHCO3и 20 мм HEPES.
- Подготовить ферментативные коктейль (изменение HBSS, 450 ед/мл коллагеназы IV, дезоксирибонуклеаза 0,01% [wt/vol] я и 2 мг/мл D-глюкозы). Решение пройти через стерильную 0,22 мкм фильтром. В идеале, подготовить Пищеварение энзима в день использования, но она может быть заморожены при-20 ° C для хранения. Избегайте повторного замораживания и оттаивания циклов.
- Промывайте ткань с модифицированных HBSS и место в чашке Петри2 100 x 15 мм. Отрегулируйте размер Петри, основанный на количество ткани доступны и объем фермента коктейль используется (см. шаг 1.4.2 ниже).
Примечание: Ткани варьируется в зависимости от хирургического образца, полученные от патологии, начиная от 1-10 g. - Физическая обработка с одноразовые скальпель и пинцет:
- Добавьте около 3 мл пищеварения фермента коктейль в ткани для предотвращения высыхания во время резки.
- Используйте щипцы для стабилизации ткани и фарш с помощью скальпеля для увеличения площади поверхности ткани, подвергается пищеварение фермента коктейль. Разрежьте ткань на мелкие кусочки (< 2 мм на стороне). Добавьте достаточно пищеварение фермента коктейль для покрытия всех тканей штук (5 мл/г ткани). Поместите крышку на Петри блюдо.
- Инкубируйте при 37 ° C с 5% CO2 на вращателе на приблизительно 80 об/мин за 45 мин убедитесь, что скорость ротатор тщательно смешивается пищеварение фермента коктейль без разлив или пузырей.
- Визуализация Подготовка тканей с инвертированным микроскопом света с 4 X и 10 X целей.
Примечание: После переваривания, небольшие фрагменты тканей и смешанных клеток подвеска, включая видимый эпителия желез должна присутствовать (см. рис. 1A).
2. физическое разделение одиночных клеток
- В стерильных условиях поместите сетку тугой 250 мкм с держателем в чашку Петри2 150 x 15 мм. Убедитесь, что сетка около 0,5 см над поверхностью Петри.
- Мокрые сетки с 2 мл модифицированных HBSS и передачи переваривается ткани на сетке.
- С помощью плоской поверхности 10-мл шприц плунжерный, мягко, но твердо, шлифуют переваривается фарша ткани через сетку.
Предупреждение: Шлифование слишком агрессивно будет повреждения сетки и увеличения смертности клеток. Этот шаг будет отделить эпителиальных клеток и стромальных клеток (включая иммунные клетки) от соединительной ткани и слизи. - После того, как тщательно были разогнаны фрагменты тканей, поднять сетки и держателя 2-3 см выше Петри и полоскания с 3 мл изменение HBSS восстановить дополнительные ячейки.
- Соберите суспензию клеток. Место 20 мкм сетки с держателем в чашку Петри и мокрый с 2 мл модифицированных HBSS. Залить суспензию клеток через сетку, держа сетки 2-3 см выше Петри и полоскания с 6 мл модифицированных HBSS.
Примечание: Этот шаг будет отдельный эпителиальных листы, которые сохраняются на вершине, от одной клетки, которые проходят через сетку. Поток через представляет собой суспензию смешанных клеток, которая включает в себя иммунные клетки и фибробласты стромы. - Собирать суспензию смешанных клеток и центрифуги на 500 x g 10 мин аспирата жидкости и Ресуспензируйте гранулы в 4 мл модифицированных HBSS для плотности градиентного центрифугирования.
- Слой суспензию смешанных клеток более 3 мл polysucrose раствора и центрифуги при комнатной температуре на 500 x g 30 мин с без тормозов. Собирать белая полоса в верхней части polysucrose раствора и промыть с PBS.
Примечание: Эта часть является обогащенный смешанных клеток подвеска, которая богата в иммунных клеток и содержит некоторые фибробласты стромы.
3. мертвые клетки удаление
Примечание: Если большой процент мертвых клеток (> 20%), присутствуют в суспензию обогащенного смешанных клеток после плотность градиентного центрифугирования, рекомендуется удаление мертвых клеток с магнитной бусины. Мертвые клетки должны быть удалены, поскольку они могут вмешиваться в процесс отбора позитивные магнитный шарик.
- Подсчет количества ячеек с помощью Горяева на световой микроскоп с тем 10 X. Спин вниз всех клеток в суспензии обогащенного смешанных клеток (500 x g, 10 мин, 4 ° C). Полностью удалить и удалить супернатант. 100 мкл бусины удаления мертвых клеток в 1 x 107 всего клетки (живых и мертвых), в соответствии с инструкциями производителя. Инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Место 30 мкм фильтр на столбце магнитные, применять суспензию клеток и позволяют клеткам шарик меченых падать через магнитную колонку.
- Промойте столбце с буфером удаления мертвых клеток как рекомендованные (3 мл). Соберите проточный, содержащие живые клетки. Диапазон ячеек восстановления после удаления мертвых клеток представлена на рисунке 1B.
Примечание: Эти клетки могут использоваться для выполнения проточной цитометрии пятнать фенотипические исследований (раздел 5) или продолжить с DC изоляции (раздел 4).
4. DC очистки выбором положительных магнитный шарик
- После удаления мертвых клеток (шаг 3.2) спина клетки вниз, удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 80 мкл буфера магнитные выбор за 1 x 10-7 клеток (PBS, 0,5% тепло инактивированная AB сыворотку крови человека (HS), 2 мм ЭДТА).
- Для позитивного выбора DC населения добавьте CD1a или CD14 магнитные бусы согласно инструкциям производителя (20 мкл магнитные бусы на ячейки 1 x 10-7 ). Инкубируйте 15 мин при 4° C.
- Вымыть клетки с магнитного выделения буфера, уменьшается и полностью удалить буфер. Ресуспензируйте клетки в минимум 500 мкл буфера магнитные выбор.
- Вставьте столбец магнита и добавьте 30 мкм фильтром на вершине столбце, чтобы сохранить любые оставшиеся сгустки ячейки. Промойте фильтр и столбец с магнитной выделения буфера как рекомендуется.
- Суспензию клеток применяются к столбцу. Промойте 3 раза с магнитной выделения буфера.
- Передать 15 мл столбца, добавить 5 мл магнитных выделения буфера и применять поршень выпустить выделенных ячеек в столбце.
- Для повышения чистоты, повторите шаги 4.4-4.6 с восстановленной клетки, с помощью нового столбца. В рисунке 1 cпредставлен ассортимент восстановления клеток после выбора магнитный шарик.
5. Оценка чистоты клеток: поток цитометрии и микроскопия
- Антитело пятная для проточной цитометрии:
- Ресуспензируйте до 1 x 106 клеток в 100 мкл ФСБ, содержащих 20% тепла инактивированная HS блокировать рецепторы Fc, и проинкубируйте втечение 10 мин на льду.
- Добавьте требуемый дневно обозначенные антитела и реагент для идентификации мертвых клеток (например, см. раздел 6.5). Установите флуоресценции минус один (FMO) элементы управления установить ворота, и использовать компенсацию бусы для подготовки единого пятно элементов управления для компенсации. В таблице 1приводятся примеры использования антител. Проинкубируйте втечение 20 мин при 4 ° C, защищать от света.
- Вымойте клетки с 2 мл магнитных выделения буфера.
Примечание: Избежать формирования слипания для анализа потока гранулярных клеток важно присутствие ЭДТА. Спин вниз и удалить супернатант. - Исправьте ячейки, добавив 100 мкл параформальдегида 2% раствора в трубку.
- Анализировать образцы в потока цитометр10,11.
- Spin столбце (например, cytospin) и использовать Гимзы, пятнать для анализа морфологии:
- Ресуспензируйте клетки в 200 мкл буфера магнитные выбор.
- Загрузить в столбце спин и спина на 5 мин. Пусть слайд полностью просохнуть.
- Исправить слайд путем погружения в 100% метанола для 2 минут промыть слайд с дейонизированной водой и позволить ему воздух сухой.
- Выполнение стандартного пятнать Wrights-Гимза. Обложка клетки с эозином и проинкубируйте втечение 10 мин, ополосните деионизированной водой и дайте ему высохнуть. Обложка клетки с Wrights-Geimsa пятно, инкубировать в течение 1 мин, ополосните деионизированной водой и высохнуть на воздухе.
- Изучите подготовку с инвертированным микроскопом (рисунок 2A, 40 X цель).
6. Аллогенная стимуляции Assay оценить функцию клеток DC
- Оттепель замороженных периферической крови мононуклеаров (получения)
- Теплый СМИ культуры клеток с 10% HS до 37 ° C.
- Оттепель репликацию, поставив cryotube в ванну воды 37 ° C, до тех пор, пока небольшое количество замороженных клеток СМИ остается в cryotube. В стерильных условиях, передавать содержимое cryotube 10 мл подогретым клетки культуры средств массовой информации с 10% HS в 15 мл.
- Центрифуга на ~ 500 g x 7 мин удалить медиафайл, разогнать гранулы, Ресуспензируйте репликацию в 10 мл средства массовой информации культуры клеток с 10% HS и центрифуги клетки.
- Повторите шаг мыть третий раз. Подсчитать количество ячеек.
- Наивные Т-клеточный отбор:
- Используйте набор выбора ячейки негативный выбор магнитных антитела для изоляции наивные Т-клетки согласно протоколу производителя.
- После изоляции Проверьте чистоту, используя CD45RA и CCR7 антител.
Примечание: Типичный чистоты-> 99% наивные Т-клеток.
- Наивные Т-клеток распространения краситель окрашивание:
- Подготовка 600 мкл раствора 2 x клеток распространения красителя, защищая краска от воздействия света.
- Вымойте наивные Т-клетки 2 x с PBS. Ресуспензируйте клетки в 500 мкл PBS.
- Во время нежно vortexing клетки в биобезопасности кабинета, добавьте 500 мкл распространения краска наивные Т-клеток.
- Инкубировать клетки в течение 10 минут при 37° C.
- Остановить маркировки ячейки, добавив 5 мл носителей культуры клеток с 10% HS в клетки. Инкубируйте на льду на 5 мин, защищенном от света.
- Центрифуга клетки на ~ 500 g x 7 мин, аспирационная средства массовой информации и Ресуспензируйте клетки в 4 ° C носителей культуры клеток с 10% HS. Повторите еще два раза в общей сложности 3 стирок. Возьмите Алиготе клеток рассчитывать до последнего центрифугирования.
Примечание: Как правило, наивно окончательного числа Т-клеток будет варьироваться от 5% до 15% первоначального подсчета клеток КСДОР. - Ресуспензируйте клетки с медиа культуры клеток с 10% HS в концентрации нужной ячейки.
- DC-Аллогенная наивные Т-клеток Сопредседатель Культура:
- Пластина изолированных DCs и наивные Т-клеток в 96-луночных, раунд нижней пластине, в 1:15 соотношение РС для Т-клеток. Убедитесь, что оптимальное количество для DCs колеблется между 3000 и 5000 клеток/хорошо.
- Центрифуга пластину на ~ 500 x g 3 мин для обеспечения клетки расположены в центре скважины. Контакт к ячейке имеет важное значение для надлежащего сигнализации происходят.
- Инкубируйте при 37 ° C в течение 6 дней. Мониторинг этих клеток, которые появляются в скважинах, как происходит распространения, с помощью микроскопии (Рисунок 3А).
- Проточная цитометрия, пятнать для оценки распространения:
- После 6 дней клетки могут быть изучены проточной цитометрии. Пятно Сопредседатель культуру для проточной цитометрии.
- Приготовляют раствор 2 x жизнеспособности желтого красителя (максимальная выбросов 572 Нм) в PBS.
Примечание: Использование PBS без сыворотки имеет важное значение, как сыворотка протеинов вмешиваться с красителем). - Центрифуга для пластины с клетки на ~ 500 x g за 5 мин.
- Удаление 100 мкл супернатант.
Примечание: на данный момент собирать и хранить супернатант для отдельного анализа растворимых факторов. - Вымыть клетки два раза с PBS: добавить 150 мкл/колодец PBS, центрифуги на ~ 500 g x 5 минут, удалить 150 мкл супернатант с пипеткой. Убедитесь, что имеется 50 мкл супернатанта, остающихся в каждой скважине.
- 50 мкл 2 x жизнеспособности красителя в каждой скважине. Инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин, защищенном от света.
- Во время инкубации Подготовьте мастер смесь желаемого антитела маркеров. Например: CD3 APC/Cy7, CD4 PE, CD8 FITC, и т.д.
- Добавьте смесь антител в каждой скважине. Инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин, защищенном от света.
- Вымыть клетки 2 x с PBS + 2% HS: добавить 150 мкл/хорошо PBS + 2% HS. Центрифуга на ~ 500 x g для 5 минут удалить 150 мкл супернатант с пипеткой.
- Исправьте ячейки, добавив 100 мкл/хорошо 2% пункт-формальдегида. При необходимости: клетки и средства массовой информации передавать цитометрии Трубы полипропиленовые потока. Трубы можно хранить при 4 ° C и защищены от света, до гранулярных анализ потока.
- Чтения трубы в проточный цитометр.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Могут наблюдаться следующие ткани пищеварение, освобождение эпителиальных листов и желез, как показано на рисунке 1A; Это позитивный элемент управления, указывающее успешность ферментативного пищеварения. Количество общего числа жизнеспособных клеток и DCs, восстановленные в грамм ткани также показано на рис. 1B и 1 c рисунок, соответственно. Иммунные клетки представляют собой 5-30% стромальных клеток до плотности центрифугирования12,13. Рисунок 2 показывает морфологии (рисунок 2A) и чистоте (Рисунок 2Б, C) изолированные DC. Когда два раунда отбора выполняются, как указано в протоколе, ожидаемые чистоты колеблется от 85-92% (рис. 2 c). Количество восстановленных клеток является переменной и зависит от первоначального ткани размер и доноров изменчивости. Характеристика изолированных клеток были описаны13. Рисунок 3 показывает представительным стимуляции аллогенной пробирного оценить функциональность DC. На рисунке 3A показывает характерные сгустки Т-клеток, которые появляются, когда происходят распространения, и рисунок 3B показывает распространение количественной подачей cytometry. Другие функциональные анализы, как вирусный захвата или производство цитокинов и хемокиновых также может быть выполненной13. Рисунок 4 показывает стробирования стратегии для выявления различных DCs популяций в различных отсеках анатомические FRT после анализа потока гранулярных обогащенного смешанных клеточных суспензий (рис. 4A). Титрование антител и негативные элементы важны, как DCs и макрофаги отображения высокой аутофлюоресценция. FMO элементы управления показаны на рисунке 4В. Рисунок 4 c показывает примеры для выявления конкретных подмножеств DC, например CD1c +, CD207 + или CD103 + DCs.
Рисунок 1: наличие обработки и клеток ткани. (A) представитель изображение эпителиальных листов и освобожден после переваривания ткани железы. (B) спектр общее количество жизнеспособных клеток восстановился после обработки ткани и удаление мертвых клеток в каждом отсеке FRT: эндометрия (EM), эндоцервикса (CX) и ectocervix (ECX). Каждая точка представляет ячейки из другой темы. (C) число DCs восстановился в грамм ткани после изоляции магнитный шарик. Адаптировано из13B и C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: морфология и чистоту изолированных клеток. (A) дендритных морфология изолированных клеток, определяется микроскопии после окрашивания Гимза. (Б) выражение фенотипических маркеров до и после изоляции из бисера, как определяется проточной цитометрии. (C) представитель чистоты, полученные после CD1a + и CD14 + шарик изоляции. Адаптировано из13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: распространение пробирного. (A) представитель микроскопии изображений Т-клеток кластера формирование во время распространения: фазово контрастной (слева), распространения красителя окрашивания (в середине) и наложение (справа). (B) пример индукции распространения после совместного культуры изолированных эндометрия CD1a + или CD14 + DCs и аллогенной наивными, Т-клетки, полученные из замороженных репликацию. B приспособлен от13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: фенотипические характеристики РС в обогащенных смешанные клеточных суспензий от фрахт (A) стробирование стратегии для идентификации DCs в суспензию смешанных клеток. Каждый закрытый населения в многоцветный участков показана на следующей панели. Контурная участки показывают CD11c + CD11b + и CD11c + CD11b-ворота, соответственно. Маркеры, которые идентифицируют ненужные клетки могут быть окрашены, используя тот же канал для исключения их из этого анализа; например мертвые клетки, CD3 + и CD19 + клеток. (B) FMO элементов управления создать надлежащие ворота. (C) дискриминация DC подмножеств стробирования стратегии. Контурная участки были выбраны вместо многоцветной участки более точно представлять распределения населения, когда число клеток были ниже10. Число низкие клеток ожидается в конце стробирования стратегии, как DCs ткани являются редким населением. Адаптировано из13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Ячейке маркер | Флюрохром | Клон | Концентрация | Количество антител на сэмпл |
| (в 100 мкл буфера) | ||||
| CD45 | vioblue450 | HI30 | 1,0 мкг/5мкл | 0.4 мкг |
| CD11b | PE | ICRF44 | 1,0 мкг/5мкл | 0.4 мкг |
| CD11c | PerCp/Cy5.5 | Bu15 | 200 мкг/мл | 0.4 мкг |
| CCR5 | PE-Cy7 | 2D 7 | 0,25 мкг/5мкл | 0.1 мкг |
| CCR7 | PE-Cy7 | REA108 | 99 мкг/мл | 0.2 мкг |
| HLA-DR | BV-570 | L243 | 100 мкг/мл | 0.2 мкг |
| HLA-DR | FITC | AC122 | 82.5 мкг/мл | 0,16 мкг |
| CD3 | APC | UCHT1 | 16 мкг/мл | 0,03 мкг |
| CD3 | viogreen | REA614 | 137 мкг/мл | 0.27 мкг |
| CD163 | APC | ГХИ/61 | 80 мкг/мл | 0,16 мкг |
| CD207 | APC | 1OE2 | 200 мкг/мл | 0.4 мкг |
| CD1a | FITC | HI149 | 0,5 мкг/5мкл | 0.2 мкг |
| CD1a | AF-700 | HI149 | 0.5 мг/мл | 1,0 мкг |
| CD103 | PE-Cy7 | B-Ly7 | 0,25 мкг/5мкл | 0.1 мкг |
| CD83 | PE | HB15e | 0,25 мкг/5мкл | 0.1 мкг |
| CD14 | APC-огонь | 63D 3 | 400 мкг/мл | 0,8 мкг |
| CD209 | FITC, PE, APC | 120507 | 1,25 мкг/0,25 мл | 0,01 мкг |
| Краска желтая жизнеспособность зомби | ||||
| 7AAD | 0,1 мг/мл | 0.2UG |
Таблица 1: Пример антител для характеризации DCs в FRT подачей cytometry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Слизистых оболочек DCs являются популяции редких клеток под влиянием окружающей среды ткани, который изменяет их фенотипа и функции, как только они вступают в тканях3. Хотя производные крови DCs являются весьма полезной модели, они не полностью отражают разнообразие DC населения в тканях. Таким образом чтобы понимать уникальные характеристики слизистой DCs, изоляция начальных клеток тканей необходима. Изоляция РС от различных анатомических объектов в ФРТ предлагает возможность изучить DC функция в пробирке и сравнить между DC подмножеств и анатомических местах.
Здесь мы предоставляем протокол, который позволяет очистки DCs от человека FRT тканей в vitro оценки функциональных характеристик. Так как DCs находятся на слизистых оболочек участках в малом количестве, мы разработали протокол, чтобы обогатить подготовка клетки ткани плотностью градиентного центрифугирования и удаление мертвых клеток до изоляция клетки с магнитной бусины. Правильное удаление омертвевших клеток является ключевым, поскольку они будут мешать шарик изоляции. Эта технология обеспечивает высокую чистоту положительно изолированных клеток (≈ 90%), в относительно короткий промежуток времени (4-6 ч), и без необходимости в ночь инкубации, в пробирке клеточной культуры или миграции до изоляции, каждый из которых может активировать DCs и Измените их фенотипические характеристики. Наш протокол не влечет за собой активации клеток, как измеряется отсутствие вверх регулирования созревания маркеры (CD86, HLA-DR, CD83)13. Еще одним преимуществом является использование не протеолитических ферментативного пищеварения, который не прилепится поверхностных маркеров и позволяет немедленно ячейки изоляции или фенотипические анализ после ткани пищеварение14.
Решающее значение для настоящего Протокола поколения одну ячейку подвеска, чтобы избежать засорения магнитные столбцов. Для обеспечения этого, мертвые клетки должны быть удалены до магнитных клеточной селекции, фильтры необходимо использоваться поверх магнитные столбцы, и ткани больше, чем 3 g должны быть разделены между двумя столбцами. Использование второго столбца после первого раунда очистки является ключом к высокой ячейке чистоты.
Одним из ограничений метода изоляции является присущие низкой количество DCs в тканях ФРТ, который обычно не позволяют для восстановления хорошего клеток тканей меньше 1 g. В этих обстоятельствах однако, фенотипические анализы могут по-прежнему выполняться с использованием обогащенного смешанные суспензию клеток. Это возможно из-за не протеолитических пищеварение используемого метода, который не прилепится поверхностных маркеров и позволяет немедленно анализ фенотипа клетки после ткани пищеварение14. Кроме того возраст пациента может быть фактором, который влияет на количество ячеек восстановлены.
Используя этот протокол, мы ранее показали что CD1a + изоляция обеспечивает фенотипически более однородное население, чем CD14 +13выбор; Однако CD1a + DCs трудно оправиться от CX и ECX. В то время как CD14 также может быть выражен на макрофагов, мы обнаружили, что FRT CD14 + изолированная популяция богата DCs, на основе совместного выражения DC маркеров и их способность стимулировать аллогенной наивные Т-клеток, что является отличительной функцией DCs13.
Поскольку количество DCs оправился в целом низок (< 100000 всего клетки), функциональные исследования должны быть оптимизированы для низких клеток чисел. Здесь мы покажем оптимизации assay аллогенной стимуляции, которая может быть выполнена с только 3000 DCs/хорошо. Мы провели исследования другие функции с этих клеток, включая гормональные отзывчивость, цитокинов и антимикробного пептида ВИЧ стимуляции и ВИЧ захват FRT DCs13. После того, как DCs изолированы и покрытием, анализов следует выполнять в течение 24 часов, как жизнеспособность клеток уменьшается после этого времени.
Этот протокол может быть адаптирована к изолировать разные подмножества DC, или другие типы клеток, выбрав правильное маркеры в сочетании с магнитной бусины и комбинирования последовательных положительные и отрицательные шарик выбор для удаления типов нежелательных клеток. Одно предупреждение, хотя, это, что каждый раунд отбора некоторый процент клеток будет потеряно, так что для изоляции FRT DCs, который уже редки, и ткани размер мал, как правило, несколько раундов выделения с различными маркерами (и необходимые моет связанные) не желательно. Кроме того этот протокол может быть адаптирована к изолировать от других тканей14,15другие иммунные клетки или DCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать
Acknowledgments
Поддерживаемый NIH стипендии AI102838 и AI117739 (CRW). Мы благодарим Ричарда Rossoll для оказания технической помощи. Анализ потока гранулярных был проведен в DartLab, общий ресурс на Dartmouthsupported (P30CA023108-37) и (P30GM103415-15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
