Summary
נתאר כאן שיטה כדי לבודד ולטהר תאים דנדריטים שונים אנטומי בתאים אנושיים באיברי הרבייה הנקביים על ההערכה של תכונות פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונליים שלהם. בשיטה זו ניתן להתאים כדי לבודד תאים חיסוניים אחרים או תאים דנדריטים של רקמות הרירית אחרות.
Abstract
האפיון של האדם התאים הדנדריטים (Dc) תושב ברקמות הרירית מאתגר עקב הקושי בהשגת דגימות, המספרים נמוכים בדרור להציג לכל רקמות. ובכל זאת, כמו פנוטיפ והתפקוד של בקרי קבוצת מחשבים משתנה על ידי הסביבה רקמות, זה הכרחי לנתח אוכלוסיות DC תושב רקמות, מאז דם נגזר DCs שהיישום לשקף את המורכבות של בקרי קבוצת מחשבים ברקמות. כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד DCs מ האדם באיברי הרבייה הנקביים (והשפלתם) באמצעות דגימות כריתת רחם המאפשרת ניתוח פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר וגם פונקציונלי. הפרוטוקול מורכב עיכול רקמת ליצירת תא בודד מעורב תא ההשעיה, ואחריו הבחירה חרוז מגנטי חיובי. פרוטוקול מערכת העיכול שלנו רקמות לא קליב סמני פני השטח, מה שמאפשר ניתוח פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונליים של בקרי קבוצת מחשבים במצב יציב, ללא הפעלה דגירה או תא לילה. פרוטוקול זה ניתן להתאים עבור בידוד של סוגי תאים חיסוניים אחרים או בידוד של בקרי קבוצת מחשבים של רקמות אחרות.
Introduction
והשפלתם יש את הפונקציה כפול של הגנה מפני פתוגנים תוך מתן אפשרות השרשה והריון1. כדי לעשות זאת, והשפלתם באופן ממודר, עם כל אזור אנטומי מציג מאפיינים ייחודיים היסטולוגית, חיסונית, פונקציונלי1.
DCs נוכח משטחים הרירית לעשות קשר עם החיידקים הריאה, הבטן, ואת מערכת איברי המין, או לספק מעקב המערכת החיסונית פתוגנים פוטנציאליים2. בקרי קבוצת מחשבים יש יכולת ייחודית פריים תמים תאי-T ו לעורר תגובות מערכת החיסון מסתגלת3. בקרי קבוצת מחשבים והשפלתם מתמחה גם לסבול אנטיגנים זרים, כגון אלה שנמצאו הזרע ואת העובר המתפתח, כדי לאפשר הריון מוצלח4. לכן, בהתאם למיקום, פנוטיפ DC פונקציה יהיו ברורים. זה ידוע DCs מושפעים מאוד הסביבה רקמות, כך מספר שלהם, פנוטיפ ופונקציות עוברות שינוי על ידי הסביבה רקמות שבו הן שוכנות3. לכן, כדי להבין את התפקיד כי והשפלתם DCs לשחק ב מחלות זיהומיות, הריון ו סרטן והשפלתם, DCs תושב צריך להילמד, מאז דם מודלים DC הנגזר אינם הולמים לטפל המורכבות רגולטורי מצאו ברקמות והשפלתם.
האפיון של רקמה אנושית DCs תושב הוא מאתגר בשל המספרים הנמוכים של תאים נוכח רקמות הרירית ואת הקושי קבלת דגימות רקמה אנושית. DCs נחקרו על והשפלתם באמצעות אימונוהיסטוכימיה5,6, אשר מודיע על המיקום תאים בתוך הרקמה, אבל מונע מחקרים פונקציונלי, מוגבל במספר זיהוי סמנים התא מסוגל לנתח בעת ובעונה אחת. יתר על כן, תא בודד בידוד פרוטוקולים עבור ניתוח תזרים cytometric כבר מפותחת7,8,9. כמה מהפרוטוקולים האלה לנצל יכולת הנדידה של בקרי קבוצת מחשבים לבודד תאים אלה זה להעביר. שיטות אלה בדרך כלל דורשים incubations לילה ומבחר DCs מופעל, אך אינם מאפשרים את המחקר של בקרי קבוצת מחשבים במצב יציב.
כאן, אנחנו באמצעות דגימות כריתת רחם, אופטימיזציה פרוטוקול כדי לבודד DCs מאתרי אנטומי שונה והשפלתם, רירית הרחם (EM), בלוטת endocervix (CX), ectocervix (ECX), המאפשרת ניתוח פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר וגם פונקציונלי. באמצעות פרוטוקול שאינו הפרוטאוליטי עיכול אנזימטי, נוכל להתקדם מיד לאחר מערכת העיכול הרקמה תא בידוד ואת זרימת cytometric אפיון ללא הפעלה תא באמצעות cytometry זרימה ססגוניות והתאמת פונקציונלי ללימודי מספר נמוך של תאים, אנחנו יכולים לזהות ולאפיין נדיר קבוצות משנה של בקרי קבוצת מחשבים באתרים שונים של FRT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקרים שכללו ניסויים נערכו על פי עקרונות לידי ביטוי הצהרת הלסינקי. מחקרים אושרו על-ידי המכללה דארטמאות מוסדיים המנהלים והוועדה עבור ההגנה של האדם נושאים (CPHS). בכתב הסכמה מדעת הושג לפני הניתוח של HIV-שלילי בנשים שעברו hysterectomies במרכז הרפואי דארטמות-היצ'קוק (NH לבנון). פתולוגים מיומן נבחרת דגימות רקמה מן EM, CX, ECX, ללא נגעים פתולוגיים ומרוחק מן האתרים של פתולוגיה. דגימות דם התקבלו מתורמים בריאים המתנדבים גייס במרכז הרפואי של דארטמות היצ'קוק. תורמים דם היו אנונימיים. רקמות EM, CX ו ECX טרי מבודד מן חדר הניתוח הועברו לידי פתולוגיה בידוד, סיווג מוקדמת להעביר למעבדה שלנו צינורות פוליפרופילן נפרדים, סטרילי.
1. עיכול אנזימטי של רקמות
הערה: משתמשים בחומרים סטרילי ולעבוד על בטיחות ביולוגית בארון.
- הכן מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק שונה) 1 x HBSS באמצעות פנול אדום, 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין, 0.35 g/L NaHCO3ו- 20 מ מ HEPES.
- להכין את הקוקטייל אנזימטי (שונה deoxyribonuclease 0.01% [wt/כרך] HBSS, 450 הרביעי collagenase U/mL, ואני 2 מ"ג/מ"ל D-גלוקוז). עוברים את הפתרון מסנן מיקרומטר 0.22 סטרילי. באופן אידיאלי, להכין את אנזים עיכול ביום של שימוש, אבל זה יכול להיות קפוא ב-20 ° C עבור אחסון. הימנע חוזרות הקפאה והפשרה של מחזורים.
- יש לשטוף את הרקמה עם ששונה HBSS והמקום בצלוחית 100 x 15 מ מ2 . להתאים את גודל פטרי מבוסס על הסכום של רקמה זמין ואת הנפח של אנזים קוקטייל בשימוש (ראה שלב 1.4.2 להלן).
הערה: רקמות בגדלים שונים בהתאם הדגימה כירורגי המתקבל הפתולוגיה, הנע בין 1-10 גרם. - עיבוד פיזית עם האיזמל חד פעמיות, מלקחיים:
- להוסיף כ- 3 מ ל אנזים עיכול קוקטייל הרקמה כדי למנוע התייבשות בעת גזירה.
- להשתמש מלקחיים כדי לייצב את הרקמה, מינצ עם איזמל כדי להגדיל את שטח הפנים של הרקמה נחשפים האנזים עיכול קוקטייל. חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות (< 2 מ מ בכל צד). הוסף קוקטייל אנזים עיכול מספיק כדי לכסות את רקמת כל החלקים (5 מ ל/g של רקמות). מניחים את המכסה על הפטרי.
- דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 מסובב כ 80 סל ד במשך 45 דקות ודא כי המהירות מסובב מתערבב ביסודיות את הקוקטייל אנזים עיכול מבלי לשפוך או לייצור בועות.
- דמיינו הכנת רקמות עם מיקרוסקופ אור הפוך עם 4 X ויעדים X 10.
הערה: לאחר עיכול, שברי רקמת קטן והשעיה לתא מעורב כולל בלוטות אפיתל גלוי צריך להיות נוכח (ראה איור 1 א').
2. פיזית הפרדת תאים בודדים
- בסביבה סטרילית, מניחים רשת מיקרומטר 250 מתוח עם מחזיק לתוך צלחת פטרי 150 x 15 מ מ2 . ודא רשת השינוי הוא כ- 0.5 ס מ מעל פני השטח של הפטרי.
- להרטיב את רשת השינוי עם 2 מיליליטר ששונה HBSS ולהעביר את הרקמה מתעכל על גבי רשת השינוי.
- באמצעות משטח שטוח של פומפה מזרק 10-mL, בעדינות אך בתקיפות, לטחון את הרקמה טחון מתעכל מבעד לרשת.
התראה: שחיקה אגרסיבית נזק רשת השינוי ולהגדיל תא התמותה. שלב זה יפריד לתאי האפיתל של תאי סטרומה (כולל תאים חיסוניים), רקמת חיבור, ריר. - ברגע שברי רקמת כבר התפזרו ביסודיות, לרומם את רשת השינוי, בעל 2-3 ס מ מעל צלחת פטרי ולאחר מכן לשטוף עם 3 מ"ל של שינוי HBSS להתאושש תאים נוספים.
- לאסוף את התליה תא. מניחים את רשת השינוי 20 מיקרומטר עם מחזיק פטרי, רטוב עם 2 מ של HBSS ששונה. יוצקים התליה תא מבעד לרשת מחזיק רשת השינוי 2-3 ס מ מעל צלחת פטרי, ולאחר מכן לשטוף עם 6 מ של HBSS שונה.
הערה: שלב זה להפריד את הדפים אפיתל, אשר נשמרים על למעלה מתאים בודדים לעבור דרך רשת השינוי. הזרימה דרך היא השעיית לתא מעורב, הכולל תאים חיסוניים ו fibroblasts סטרומה. - לאסוף את ההשעיה לתא מעורב צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות לשאוב הנוזלים, resuspend בגדר ב 4 מיליליטר ששונה HBSS עבור צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות.
- שכבת המתלה לתא מעורב מעל 3 מ"ל של פתרון polysucrose, צנטריפוגה בטמפרטורת החדר 500 גרם x במשך 30 דקות עם בלי בלמים. לאסוף את הלהקה לבנה מהחלק העליון של הפתרון polysucrose, לשטוף עם PBS.
הערה: fraction זו המתלה לתא מעורב מועשר, אשר עשיר תאים חיסוניים ומכיל כמה fibroblasts סטרומה.
3. להסרת תאים מתים
הערה: אם אחוז גבוה של תאים מתים (> 20%) קיימות ההשעיה מועשר מעורבות לתאים לאחר צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות, הסרת תאים מתים עם beads מגנטי מומלץ. תאים מתים עליך להסיר מכיוון שהם עלולים להפריע בתהליך הבחירה חרוז מגנטי חיובי.
- לספור את התאים באמצעות hemocytometer של מיקרוסקופ אור עם המטרה X 10. ספין לאורך כל התאים ההשעיה מועשר לתא מעורב (500 x גרם, 10 דקות, 4 ° C). לגמרי מחוק לגמרי וזורקים את תגובת שיקוע. להוסיף 100 µL של חרוזים להסרת תאים מתים לכל עונה 1 פרק 107 הכולל תאים (בשידור חי וגם מת), על פי הוראות היצרן. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- מקום 30 מיקרומטר מסנן על העמודה מגנטי, להחיל התליה תא ולאפשר את התאים התווית על-ידי חרוז ליפול דרך העמודה מגנטי.
- יש לשטוף את העמודה עם מאגר להסרת תאים מתים כמו המומלצת (3 מ ל). לאסוף את הזרימה דרך המכילות את התאים בשידור חי. הטווח של התא שחזור לאחר הסרת תאים מתים מוצג איור 1B.
הערה: תאים אלה ניתן להשתמש כדי לבצע cytometry זרימה מכתים ללימודי פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר (סעיף 5) או להמשיך עם בידוד DC (סעיף 4).
4. DC טיהור לפי בחירה חיובי חרוז מגנטי
- בעקבות הסרת תאים מתים (שלב 3.2), ספין התאים למטה, הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא במאגר הבחירה מגנטי µL 80 לכל עונה 1 פרק 107 תאים (PBS, 0.5% לא פעיל חום AB בנסיוב אדם (HS), 2 מ מ EDTA).
- מבחר חיובית של אוכלוסיות DC, הוסיפו beads מגנטי CD1a או CD14 על פי הוראות היצרן (20 µL beads מגנטי לכל עונה 1 פרק 107 תאים). תקופת דגירה של 15 דקות ב- 4מעלות צלזיוס.
- לשטוף את התאים עם המאגר הבחירה מגנטי, ספין למטה, להסיר לחלוטין את המאגר. Resuspend התאים במינימום של 500 µL מאגר הבחירה מגנטי.
- לצרף את העמודה המגנט, להוסיף 30 מיקרומטר מסנן על העמודה כדי לשמור את כל גושים תא הנותרים. יש לשטוף את המסנן ושל העמודות באמצעות מאגר מגנטי הבחירה המומלצים.
- התליה תא חלות על העמודה. לשטוף 3 פעמים עם מאגר הבחירה מגנטי.
- להעביר את העמודה צינור 15-mL, הוסף 5 מ של הבחירה מגנטי מאגר ולהחיל על הבוכנה כדי לשחרר את התאים שנבחרו מן העמודה.
- כדי להגדיל את הטוהר, חזור על השלבים 4.4-4.6 עם תאי התאושש באמצעות עמודה חדשה. הטווח של תא התאוששות לאחר הבחירה חרוז מגנטי מוצג באיור 1C.
5. הערכה של טוהר תא: Flow Cytometry, מיקרוסקופ
- נוגדן צביעת עבור cytometry זרימה:
- Resuspend עד 1 x6 10, בתאים 100 µL ל- PBS המכיל 20% חום-להשבית HS לחסום קולטנים Fc, ולאחר תקופת דגירה של 10 דקות על קרח.
- הוסף את הרצוי fluorescently שכותרתו נוגדנים, של ריאגנט לזיהוי של תאים מתים (לדוגמה, עיין בסעיף 6.5). הגדר פלורסצנטיות מינוס אחד פקדים (FMO) להקים את השערים, ולהשתמש פיצוי חרוזים להתכונן יחיד כתם פקדים פיצוי. דוגמאות של נוגדנים בשימוש ניתנת טבלה1. תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 ° C, מוגן מפני אור.
- לשטוף את התאים עם 2 מ של הבחירה מגנטי מאגר.
הערה: נוכחות של EDTA חשוב למנוע היווצרות של תאים clumping לניתוח cytometric זרימה. ספין למטה וזורקים את תגובת שיקוע. - לתקן את התאים על-ידי הוספת 100 µL של 2% paraformaldehyde פתרון למחזור.
- לנתח את הדגימות ב עד זרימת cytometer10,11.
- לסובב את העמודה (למשל, cytospin) ולהשתמש Giemsa מכתים לנתח מורפולוגיה:
- Resuspend התאים µL 200 מאגר הבחירה מגנטי.
- לטעון עמודה ספין ו ספין במשך 5 דקות. לאפשר לשקופית להתייבש לחלוטין.
- לתקן השקופית על-ידי טבילה 100% מתנול עבור 2 דק שטיפה השקופית עם מים יונים ולאפשר לו אוויר יבש.
- לבצע צביעת Giemsa רייט סטנדרטי. לכסות את התאים עם אאוזין ואת תקופת דגירה של 10 דקות, לשטוף עם מים יונים, והנח לו להתייבש. לכסות את התאים עם הכתם רייט-Geimsa, תקופת דגירה של 1 דקות, לשטוף עם מים יונים, אוויר יבש.
- לבחון את ההכנות עם מיקרוסקופ הפוכה (איור 2 א, 40 X המטרה).
6. allogeneic גירוי הנועד להעריך את תפקוד התא DC
- הפשרת תאי תאי דם היקפיים קפוא (PBMCs)
- חמה תא תרבות התקשורת עם 10% HS כדי 37 מעלות צלזיוס.
- להפשיר את PBMCs על-ידי הצבת את cryotube באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, עד כמות קטנה של מדיה תא קפוא נשאר cryotube. בסביבה סטרילית, להעביר את התוכן של cryotube 10 מ"ל של מדיה התרבות תאים טרום ומחוממת עם 10% HS בשפופרת 15-mL.
- צנטריפוגה ~ 500 g x עבור 7 מינימלית מסיר את המדיה, לפזר את צניפה, resuspend את PBMCs ב- 10 מ"ל תא תרבות המדיה עם 10% HS וצנטריפוגה התאים.
- חזור על השלב לשטוף בפעם השלישית. לספור את התאים.
- תא T נאיביים בחירה:
- השתמש ערכת מבחר הבחירה שלילי תא נוגדן מגנטי כדי לבודד תמים תאי-T על פי הפרוטוקול של היצרן.
- לאחר בידוד, לבדוק את טוהר באמצעות נוגדנים CD45RA ו- CCR7.
הערה: טוהר טיפוסי הוא נאיבי > 99% תאי-T.
- תא T נאיביים התפשטות צבע צביעת:
- להכין 600 µL של פתרון 2 x של התא התפשטות צבע, הגנה על לצבוע מפני חשיפה לאור.
- לשטוף את תמימה תאי-T 2 x עם PBS. Resuspend התאים ב- 500 µL PBS.
- בזמן בעדינות vortexing בתאים אבטחה, מארון להוסיף 500 µL של התפשטות צבע נאיבי תאי-T.
- דגירה התאים 10 דקות ב- 37מעלות צלזיוס.
- . תפסיק תיוג תא על-ידי הוספת 5 מ של תא מדיה תרבות עם 10% HS לתאים. דגירה על קרח למשך 5 דקות, מוגן מפני אור.
- Centrifuge התאים ב ~ 500 g x במשך 7 דקות, תשאף התקשורת ו resuspend תאי 4 ° C תא תרבות המדיה עם 10% HS. חזור עוד פעמיים על סך של 3 מנקי. קח של aliquot של תאים לספור לפני צנטריפוגה האחרון.
הערה: בדרך כלל, תמים הסופי T-cell מספרים ינוע בין 5% ל- 15% של הרוזן תא PBMC הראשונית. - Resuspend התאים עם התקשורת התרבות תאים עם 10% HS-ריכוז התא הרצוי.
- DC-allogeneic תמים T-cell תרבות משותפת:
- לוחית רישוי של בקרי קבוצת מחשבים מבודדים תמים תאי-T בצלחת 96-ובכן, הסיבוב-למטה, בשעה 1:15 יחס של בקרי קבוצת מחשבים כדי תאי-T. ודא כי המספר האופטימלי עבור בקרי קבוצת מחשבים נעה בין 3,000 ל תאים/טוב.
- Centrifuge את הצלחת ~ 500 x g למשך 3 דקות על מנת להבטיח התאים ממוקמים במרכז של הבאר. צור קשר לתא חשוב איתות ראוי להופיע.
- דגירה ב 37 ° C ל-6 ימים. לפקח על האשכול של תאים, אשר מופיעים הבארות כפי התפשטות מתרחשת, עם מיקרוסקופ (איור 3 א).
- Flow cytometry מכתים כדי להעריך את התפשטות:
- לאחר 6 ימים, תאים יכולים להיבדק על ידי cytometry זרימה. כתם תרבות משותפת עבור cytometry זרימה.
- להכין פתרון 2 x של צבען צהוב הכדאיות (פליטת מרבית 572 ננומטר) ב- PBS.
הערה: השימוש של PBS ללא סרום הוא חשוב, כמו סרום חלבונים להתערב לצבוע). - Centrifuge לצלחת עם תאים על ~ 500 x g עבור 5 דקות.
- הסר µL 100 של תגובת שיקוע.
הערה: בשלב הזה לאסוף ולאחסן את תגובת שיקוע לצורך ניתוח נפרד של גורמים מסיסים. - לשטוף את התאים פעמיים עם PBS: להוסיף 150 µL טוב ל- PBS, צנטריפוגה ~ 500 g x עבור 5 דקות, להסיר µL 150 של תגובת שיקוע עם פיפטה. ודא כי יש µL 50 של תגובת שיקוע שנותרו מכל קידוח.
- להוסיף 50 µL של 2 x הכדאיות לצבוע כל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, מוגן מפני אור.
- במהלך הדגירה, להכין את תערובת הבסיס של סימני נוגדנים הרצוי. לדוגמה: CD3 APC/Cy7, CD4 PE, CD8 FITC, וכו
- להוסיף את התערובת נוגדן כל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, מוגן מפני אור.
- לשטוף את התאים 2 x עם PBS + 2% HS: להוסיף 150 µL טוב של PBS + 2% HS. צנטריפוגה ~ 500 x g עבור 5 דק 150 להסיר µL של תגובת שיקוע עם פיפטה.
- לתקן את התאים על-ידי הוספת µL 100/טוב של 2% פארא-פורמלדהיד. במידת הצורך: להעביר את התאים ואת התקשורת צינורות cytometry זרימה פוליפרופילן. צינורות יכול להיות שמר ב 4 ° C, מוגן מפני האור, עד הניתוח cytometric זרימה.
- צינורות לקריאה cytometer זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עיכול רקמת הבאים, שחרורו של גליונות אפיתל ובלוטות יכול להיות שנצפו, כפי שמוצג באיור 1A; זה פקד חיובי המציין שעיכול אנזימטי היה מוצלח. מספר התאים קיימא הכולל ו- DCs התאושש לגרם של רקמות מוצגים גם איור 1B , איור 1C, בהתאמה. תאים חיסוניים מייצגים בין 5-30% של תאי סטרומה לפני צפיפות צנטריפוגה12,13. איור 2 מציג את מורפולוגיה (איור 2 א) ואת טוהר Dc מבודד (איור 2B, ג). כאשר שני סיבובים של הבחירה נעשות כמצוין בפרוטוקול, טוהר הצפוי נע בין 85-92% (איור 2C). מספר התאים התאושש משתנה ותלוי ההשתנות התורם בגודלם רקמות ראשונית. אפיון של תאים מבודדים כבר מתואר13. איור 3 מראה וזמינותו של גירוי allogeneic נציג כדי להעריך את הפונקציונליות של DC. איור 3A מראה כגיהנום T-cell האופייניים המופיעים בעת התפשטות להתרחש, ומציג איור 3B כימות התפשטות מאת cytometry זרימה. מבחני פונקציונליים אחרים, כגון לכידת ויראלי או ייצור ציטוקינים, כימוקין ניתן גם בביצוע13. איור 4 מציג את האסטרטגיה חסימה כדי לזהות אוכלוסיות שונות DCs בתאים אנטומי והשפלתם ברורים לאחר ניתוח תזרים-cytometric של המתלים מועשר לתא מעורב (איור 4A). טיטרציה של נוגדנים ופקדים שליליים חשובים, כמו DCs ו מקרופאגים להציג autofluorescence גבוהה. FMO שולט מוצגים באיור 4B. איור 4C מציג דוגמאות כיצד לזהות הנדונים DC, כגון CD1c +, CD207 + או CD103 + Dc.
איור 1: עיבוד רקמה וזמינות תא. (א) תמונה ייצוגית של גליונות אפיתל ובלוטות שוחרר לאחר עיכול רקמת. (B) טווח המספר הכולל של התאים קיימא התאושש לאחר עיבוד רקמות והסרת תאים מתים בתוך כל תא והשפלתם: רירית הרחם (EM) endocervix (CX), ectocervix (ECX). כל נקודה מייצגת תאים נושא שונים. (C) של מספר בקרי תחום התאושש לגרם של רקמות לאחר בידוד חרוז מגנטי. B ו- C הם ממאמרו של13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: מורפולוגיה וטוהר של תאים מבודדים. (א) מורפולוגיה דנדריטים של תאים מבודדים נקבע על ידי מיקרוסקופ בעקבות צביעת Giemsa. (B) ביטוי פנוטיפי סמני לפני ואחרי חרוז בידוד, כפי שנקבע על ידי cytometry זרימה. (ג) טוהר נציג שהושג לאחר CD1a + ובידוד CD14 + חרוז. חיבור מקורי13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: התפשטות assay. (א) תמונות מיקרוסקופ נציג של T-cell אשכול היווצרות במהלך ההפצה: שלב-ניגודיות (משמאל), התפשטות לצבוע מכתים (באמצע), כיסוי (מימין). דוגמה אינדוקציה של התפשטות אחרי תרבות משותפת של נציג (B) מבודד רירית הרחם CD1a + או CD14 + Dc, תמים allogeneic תאי-T המתקבל PBMCs. קפ ממאמרו של13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: אפיון פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר של בקרי קבוצת מחשבים במועשר מעורבת תא המתלים מתוך FRT. (א) Gating אסטרטגיה לצורך זיהוי בקרי תחום לתא מעורב ההשעיה. כל אוכלוסייה מגודרת חלקות ססגוניות מוצג בחלונית ' הבא '. מתווה מתאר מראים את CD11c + CD11b + CD11c + CD11b-שערים, בהתאמה. סמני לזהות תאים לא רצויים יכול להיות מוכתם באמצעות על אותו ערוץ כדי לא לכלול אותם הניתוח; לדוגמה, תאים מתים, CD3 + ותאים CD19 +. (B) FMO שולט להקים השערים המתאים. (ג) אפליה של DC קבוצות משנה בעקבות האסטרטגיה חסימה. מתווה מתאר נבחרו במקום חלקות ססגוניות לייצג באופן מדויק יותר את התפלגות האוכלוסייה כאשר המספרים תא היו נמוכים10. מספרי הטלפון הנייד נמוך צפויים בסוף האסטרטגיה המגביל, כמו רקמות DCs אוכלוסיות נדיר. חיבור מקורי13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| סמן תא | Fluorochrome | שיבוט | ריכוז | כמות נוגדנים לכל דגימה |
| (ב µl 100 המאגר) | ||||
| CD45 | vioblue450 | HI30 | µg 1.0/5µl | 0.4 µg |
| CD11b | PE | ICRF44 | µg 1.0/5µl | 0.4 µg |
| CD11c | PerCp/Cy5.5 | Bu15 | µg 200/ml | 0.4 µg |
| CCR5 | PE-Cy7 | 2D 7 | µg 0.25/5µl | 0.1 µg |
| CCR7 | PE-Cy7 | REA108 | µg 99/ml | 0.2 µg |
| ד ר הלע | BV-570 | L243 | µg 100/ml | 0.2 µg |
| ד ר הלע | FITC | AC122 | 82.5 µg/ml | 0.16 µg |
| CD3 | APC | UCHT1 | µg 16/ml | µg 0.03 נקודות |
| CD3 | viogreen | REA614 | µg 137/ml | 0.27 µg |
| CD163 | APC | GHI/61 | µg 80/ml | 0.16 µg |
| CD207 | APC | 1OE2 | µg 200/ml | 0.4 µg |
| CD1a | FITC | HI149 | µg 0.5/5µl | 0.2 µg |
| CD1a | AF-700 | HI149 | 0.5 מ"ג/מ"ל | 1.0 µg |
| CD103 | PE-Cy7 | B-Ly7 | µg 0.25/5µl | 0.1 µg |
| CD83 | PE | HB15e | µg 0.25/5µl | 0.1 µg |
| CD14 | APC-אש | 63D 3 | 400 µg/ml | 0.8 µg |
| CD209 | APC FITC, PE, | 120507 | µg 1.25/0.25 ml | 0.01 µg |
| צבע צהוב הכדאיות זומבי | ||||
| 7AAD | 0.1 מ"ג/מ"ל | 0.2ug |
טבלה 1: דוגמה של הנוגדנים עבור אפיון DCs והשפלתם מאת cytometry זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DCs הרירית הם אוכלוסיה תא נדיר מאוד מושפעת הסביבה רקמות, אשר משנה פנוטיפ והתפקוד שלהם, ברגע שהם מזינים את הרקמות3. בעוד דם נגזר DCs הם מודל שימושי מאוד, הם אינם מייצגים את המגוון של אוכלוסיות DC נמצאו ברקמות באופן מלא. לכן, כדי להבין את המאפיינים הייחודיים של הרירית DCs, בידוד תאי העיקרי של רקמות הוא הכרחי. בידוד של DCs מאתרי אנטומי שונה והשפלתם מציעה את ההזדמנות ללמוד DC פונקציה במבחנה ולהשוות בין קבוצות משנה DC מיקומם האנטומי.
כאן אנו מספקים פרוטוקול המאפשר הטיהור של בקרי קבוצת מחשבים של רקמות והשפלתם להערכת במבחנה של מאפיינים פונקציונליים. מאז DCs נמצאו באתרים הרירית במספרים נמוכים, פיתחנו פרוטוקול להעשרת הרקמה תא הכנה על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות והסרת תאים מתים טרם תא בידוד עם חרוזים מגנטי. מתאים להסרה של תאים מתים הוא מפתח, כפי שהם יפריעו חרוז בידוד. טכניקה זו מספקת טוהר גבוהה של תאים בודדים באופן חיובי (≈ 90%), בתוך קצר יחסית של זמן (4-6 שעות), והוא ללא צורך הדגירה לילה, במבחנה תרבית תאים או ההעברה לפני בידוד, שכל אחד מהם יכול להפעיל DCs ו לשנות את המאפיינים פנוטיפי שלהם. הפרוטוקול שלנו לא תחולל לתא ההפעלה, כפי שנמדד על ידי חוסר של מעלה-רגולציה של התבגרות סמנים (CD86, ד ר הלע, CD83)13. יתרון נוסף הוא השימוש של עיכול אנזימטי-הפרוטאוליטי, לא קליב סמני פני השטח ומאפשר בידוד תא מיידית או ניתוח פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר בעקבות עיכול רקמת14.
קריטי כדי פרוטוקול זה הוא הדור של השעיה תא בודד כדי למנוע את החסימה של העמודות מגנטי. כדי להבטיח זאת, יש להסיר תאים מתים לפני בחירת התא מגנטי, צורך מסננים לשמש מעל העמודות מגנטי, רקמות גדולות יותר מאשר 3g יש לחלק בין שתי עמודות. השימוש של עמודה שנייה לאחר השלב הראשון של טיהור הוא מפתח התא גבוהה לטוהר.
מגבלה אחת של שיטת בידוד היא הגלום המספר הנמוך של בקרי קבוצת מחשבים ברקמות והשפלתם, אשר בדרך כלל אינה מאפשרת שחזור תא טוב של רקמות קטן מ- 1 g. בנסיבות אלה, אולם, ניתוחים פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר עדיין ניתן לבצע באמצעות את מועשר מעורב תא ההשעיה. זה אפשרי בשל פעולת העיכול הפרוטאוליטי בשימוש, לא קליב סמני פני השטח ומאפשר לניתוח מיידי של פנוטיפ תא לאחר עיכול רקמת14. בנוסף, גיל המטופל יכול להיות גורם המשפיע מספר התאים התאושש.
באמצעות פרוטוקול זה, בעבר הראו כי CD1a + בידוד מספק אוכלוסיה הומוגנית phenotypically מ- CD14 + מבחר13; עם זאת, CD1a + Dc קשים להתאושש CX ECX. בעוד CD14 יכול להתבטא גם על מקרופאגים, מצאנו כי את והשפלתם CD14 + האוכלוסייה מבודד הוא עשיר DCs, בהתבסס על ביטוי שיתוף של סמנים DC ואת יכולתם לעורר allogeneic תמים תאי-T, אשר היא פונקציה סימן ההיכר של בקרי קבוצת מחשבים13.
מאז מספר DCs התאושש בדרך כלל נמוך (תאים כוללת < 100,000), מחקרים תפקודית צריך להיות אופטימיזציה עבור מספרי הטלפון הנייד נמוך. הנה אנחנו מראים אופטימיזציה של וזמינותו גירוי allogeneic, אשר ניתן לבצע רק 3,000 Dc/טוב. אנחנו ביצעו מחקרים אחרים פונקציה עם תאים אלה, כולל התגובה ההורמונלית, ציטוקינים וייצור פפטיד מיקרוביאלית HIV-גירוי ועל לכידת HIV על ידי בקרי קבוצת מחשבים והשפלתם13. לאחר בקרי התחום הם מבודדים, מצופה, מבחני צריכה להתבצע בתוך 24 שעות, כמו תא הכדאיות פוחתת לאחר מועד זה.
פרוטוקול זה ניתן להתאים כדי לבודד קבוצות משנה DC שונה, או סוגי תאים אחרים על-ידי בחירה את סמני נכונה בשילוב beads מגנטי, שילוב של הבחירה חרוז חיוביים ושליליים רציפים כדי להסיר סוגי תאים לא רצויים. רק אזהרה אחת, זה כי עם כל סיבוב של הבחירה כמה אחוז תאים יאבדו, לבידוד של והשפלתם DCs, שהן כבר נדיר, הגודל הרקמה הוא בדרך כלל קטן, מספר סיבובים של בחירה עם סמנים שונים (, צורך מנקי הקשורים) אינן רצויות. יתר על כן, ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי לבודד תאים חיסוניים אחרים או בקרי קבוצת מחשבים אחרים רקמות14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף
Acknowledgments
המחקר נתמך על ידי NIH מעניקה AI102838 ו- AI117739 (CRW). אנו מודים Rossoll ריצ'רד לקבלת סיוע טכני. ניתוח תזרים cytometric בוצע ב DartLab, המשאב המשותף בשעה Dartmouthsupported על ידי (P30CA023108-37) ו- (P30GM103415-15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
