Summary
Hier beschrijven we een methode om te isoleren en te zuiveren van dendritische cellen uit verschillende anatomische compartimenten in de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem voor de evaluatie van hun phenotypical en functionele kenmerken. Deze methode kan worden aangepast aan het isoleren van andere immune cellen of van dendritische cellen uit andere mucosal weefsels.
Abstract
De karakterisering van de menselijke dendritische cellen (DC's) woonachtig in de mucosal weefsels is uitdagend als gevolg van de moeilijkheden bij het verkrijgen van monsters, en de lage aantallen van DCs presenteren per weefsel. Nog, als de fenotype en de functie van DCs is gewijzigd door het weefsel milieu, er moet analyseren weefsel resident DC populaties, omdat bloed afkomstig DCs onvolledig weerspiegelen de complexiteit van DCs in weefsels. Hier presenteren we een protocol om te isoleren van de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem (FRT) met behulp van hysterectomie specimens waarmee zowel phenotypical en functionele analyses DCs. Het protocol bestaat uit weefsel spijsvertering voor het genereren van een eencellige gemengd celsuspensie, gevolgd door positieve magnetische kraal selectie. Ons weefsel spijsvertering protocol doet niet klieven oppervlakte markers, waardoor phenotypical en functionele analyse van DCs in de steady-state, zonder overnachting incubatie of cel activering. Dit protocol kan worden aangepast voor de isolatie van andersoortige immuun cel of isolatie van DCs uit andere weefsels.
Introduction
De FRT heeft de dubbele functie van de bescherming tegen ziekteverwekkers terwijl het toestaan van implantatie en zwangerschap1. Om dit te bereiken, is de FRT gecompartimenteerd, met elke anatomische regio unieke histologische, immunologische en functionele kenmerken1weer te geven.
DCs bijwonen mucosal oppervlakken maken contact met microben in de longen, de darmen en de voortplantingsorganen en immuun toezicht voor potentiële ziekteverwekkers2bieden. DCs hebben de unieke mogelijkheid om prime naïef T-cellen en adaptieve immuunresponsen3te activeren. DCs in de FRT zijn ook gespecialiseerd om het dulden van vreemde antigenen, zoals die gevonden in sperma en de zich ontwikkelende foetus, dat succesvolle zwangerschap4. Daarom, afhankelijk van de locatie, de DC fenotype en functie zal zijn verschillend. Het is bekend dat DCs sterk worden beïnvloed door het milieu weefsel, zodat hun aantal, fenotype en functies zijn gewijzigd door het milieu van de weefsels waarin zij3 wonen. Daarom, om te begrijpen van de rol die FRT DCs bij besmettelijke ziekten, zwangerschap, en kanker in de FRT spelen, resident DCs moeten worden bestudeerd, sinds bloed afgeleide DC modellen onvoldoende zijn om de regelgevende complexiteit gevonden in FRT weefsels.
De karakterisatie van menselijke weefsel resident DCs is uitdagend vanwege de lage aantallen cellen aanwezig in de mucosal weefsels en het moeilijk verkrijgen van menselijk weefselmonsters. DCs zijn bestudeerd in de FRT via immunohistochemistry5,6, die informeert over de cellocatie in het weefsel, maar verzet zich tegen de functionele studies, en die is beperkt in het aantal identificeren cel markeringen die kunnen worden geanalyseerd tegelijk. Bovendien zijn eencellige isolatie protocollen voor flow cytometrische analyse ontwikkelde7,8,9. Sommige van deze protocollen te profiteren van de trekkende capaciteit van DCs te isoleren van de cellen die migreren. Deze methoden meestal 's nachts incubations en selectie van geactiveerde DCs vereisen, maar laat niet voor de studie van DCs in de steady state.
Hier, met behulp van hysterectomie specimens, we geoptimaliseerd een protocol om te isoleren DCs van verschillende anatomische sites in de FRT, het endometrium (EM), de endocervix (CX), en de ectocervix (ECX), waarmee zowel de phenotypical en de functionele analyses. Een niet-Proteolytische enzymatische spijsvertering-protocol gebruikt, kunnen wij onmiddellijk na weefsel spijsvertering aan cel isolatie en stroom cytometrische karakterisering zonder activering van de cel. Multicolor stroom cytometry gebruikt en functionele studies voor de lage aantallen cellen aan te passen, kunnen we identificeren en karakteriseren van zeldzame deelverzamelingen van DCs in de verschillende sites van de FRT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studies waarbij menselijke proefpersonen werden uitgevoerd volgens de beginselen die zijn uitgedrukt in de verklaring van Helsinki. Studies werden goedgekeurd door de Dartmouth College institutionele Review Board en de Commissie voor de bescherming van de menselijke onderwerpen (CPHS). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen HIV-negatieve vrouwen ondergaan operaties bij Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Libanon, NH) voor de operatie. Opgeleide pathologen geselecteerd weefselmonsters van de EM CX en de ECX, vrij van pathologische laesies en ver van de sites van de pathologie. Bloedmonsters werden van vrijwilliger gezonde donoren aangeworven bij Dartmouth Hitchcock Medical Center. Bloeddonoren waren anonieme. Vers geïsoleerde EM, CX en ECX weefsels van de operatiekamer werden overgedragen aan pathologie voor isolatie en classificatie voorafgaande overbrengen naar ons laboratorium in afzonderlijke, steriele polypropyleen-buizen.
1. enzymatische vertering van weefsels
Opmerking: Gebruik van steriele materialen en werken in een biologische veiligheidskast.
- Een gemodificeerde Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) 1 x HBSS met fenol rood, 100 U/mL penicilline-streptomycine, 0,35 g/L NaHCO3en 20 mM HEPES voor te bereiden.
- De enzymatische cocktail bereiden (gewijzigd HBSS, 450 U/mL collagenase IV, 0,01% [wt/vol] deoxyribonuclease ik, en 2 mg/mL D-glucose). Laat de oplossing door een steriele 0,22 µm filter. Het enzym spijsvertering ideaal, voor te bereiden op de dag van gebruik, maar het kan worden bevroren bij-20 ° C voor opslag. Vermijd het herhaaldelijk bevriezen en ontdooien cycli.
- Spoel het weefsel met gemodificeerde HBSS en plaats in een petrischaal van 100 x 15 mm2 . Aanpassen van de grootte van de petrischaal op basis van de hoeveelheid weefsel beschikbaar en het volume van enzym cocktail gebruikt (zie stap 1.4.2 hieronder).
Opmerking: Weefsels variëren in grootte, afhankelijk van het chirurgische monster verkregen van de pathologie, variërend van 1-10 g. - Fysische procédés met wegwerp scalpel en pincet:
- Voeg ongeveer 3 mL van spijsvertering enzym cocktail aan het weefsel te voorkomen tijdens het knippen drogen.
- Gebruik pincet te stabiliseren van het weefsel en gehakt met een scalpel te verhogen van het oppervlak van het weefsel blootgesteld aan de cocktail spijsvertering-enzym. Snijd het weefsel in kleine stukjes (< 2 mm op een kant). Voeg voldoende spijsvertering enzym cocktail ter dekking van alle weefsel stukken (5 mL/g weefsel). Plaats het deksel op de petrischaal.
- Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 op een rotator bij ongeveer 80 omwentelingen per minuut gedurende 45 minuten ervoor zorgen dat de snelheid van de rotator grondig de spijsvertering enzym cocktail mixen zonder morsen of produceren van bubbels.
- Visualiseer de voorbereiding van de weefsel met een omgekeerde licht microscope met de 4 X en 10 X doelstellingen.
Opmerking: Na vertering, kleine weefsel fragmenten en een gemengde celsuspensie, met inbegrip van zichtbaar epithelial klieren moeten aanwezig zijn (Zie figuur 1A).
2. fysieke scheiding van afzonderlijke cellen
- In een steriele omgeving, plaatst u een strak 250 µm gaas met houder in een petrischaal van 150 x 15 mm2 . Ervoor zorgen dat het net ongeveer 0,5 cm boven het oppervlak van de petrischaal is.
- De Maas met 2 mL gemodificeerde HBSS NAT en breng het verteerd weefsel op de Maas.
- Met behulp van het platte oppervlak van de zuiger van een 10 mL spuit, zachtjes maar stevig, het verteerd gehakt weefsel via de Maas grind.
Let op: Slijpen te agressief zal schade toebrengen aan de Maas en verhogen van de sterfte van de cel. Deze stap zal scheiden de epitheliale cellen en stromale cellen (met inbegrip van immune cellen) van het bindweefsel en het slijm. - Zodra de weefsel fragmenten hebben grondig zijn verspreid, de Maas en de houder verheffen 2-3 cm boven de petrischaal en de spoel met 3 mL gemodificeerde HBSS extra cellen herstellen.
- Het verzamelen van de celsuspensie. Breng de 20 µm gaas met houder in een petrischaal en nat met 2 mL gemodificeerde HBSS. Giet de celsuspensie door de Maas houden de Maas 2-3 cm boven de petrischaal en spoelen met 6 mL gemodificeerde HBSS.
Opmerking: Deze stap zal scheiden de epitheliale bladen, die worden bewaard op de top, van afzonderlijke cellen die passeren aan de Maas. De doorstroming is een gemengde celsuspensie, waaronder immuuncellen en stromale fibroblasten. - Verzamel de gemengde celsuspensie en centrifuge op 500 x g gedurende 10 minuten Aspirate de vloeistof en resuspendeer de pellet in 4 mL gemodificeerde HBSS voor dichtheid kleurovergang centrifugeren.
- Layer de gemengde celsuspensie meer dan 3 mL polysucrose oplossing en centrifugeer bij kamertemperatuur op 500 x g gedurende 30 min met geen rem. De witte band vanaf de bovenkant van de oplossing polysucrose verzamelen en wassen met PBS.
Opmerking: Dit gedeelte is de verrijkt gemengd celsuspensie, die is rijk aan immuuncellen en bevat enkele stromale fibroblasten.
3. dode cel verwijderen
Opmerking: Als een groot percentage van dode cellen (> 20%) aanwezig in de verrijkte gemengde celsuspensie na dichtheid kleurovergang centrifugeren zijn, verwijdering van de dode cel met magnetische kralen wordt aanbevolen. Dode cellen moeten worden verwijderd omdat ze met het selectieproces positieve magnetische kraal interfereren kunnen.
- Met behulp van een hemocytometer op een lichte Microscoop met de 10 X doelstelling cellen tellen. Spin down alle cellen in de verrijkte gemengde celsuspensie (500 x g, 10 min, 4 ° C). Volledig gecombineerd en verwijder het supernatant. Voeg 100 µL van de parels van de verwijdering van de dode cel per 1 x 107 totaal aantal cellen (levende en dode), volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Een 30 µm filter plaatsen op de magnetische kolom, de celsuspensie van toepassing en de kraal-geëtiketteerden cellen te vallen door de magnetische kolom toestaan.
- Spoel de kolom met de verwijdering van de dode cel buffer als aanbevolen (3 mL). Verzamel de doorstroming met de levende cellen. Het bereik van cel herstel na verwijdering van de dode cel wordt weergegeven in figuur 1B.
Opmerking: Deze cellen kunnen worden gebruikt voor het uitvoeren van stroom cytometry kleuring voor phenotypical studies (sectie 5) of voortzetten van DC isolatie (punt 4).
4. DC zuivering door positieve magnetische kraal selectie
- Na verwijdering van de dode cel (stap 3.2), draaien de cellen naar beneden, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 80 µL magnetische selectie buffer per 1 x 107 cellen (PBS, 0,5% warmte-geïnactiveerd menselijk AB serum (HS), 2 mM EDTA).
- Voor positieve selectie van DC populaties, voegt u CD1a of CD14 magnetische kralen volgens de instructies van de fabrikant (20 µL magnetische kralen per 1 x 107 cellen). Incubeer gedurende 15 min bij 4° C.
- Wassen van de cellen met de magnetische selectie buffer, spin naar beneden en volledig verwijderen van de buffer. Resuspendeer de cellen in een minimum van 500 µL van magnetische selectie buffer.
- De kolom toevoegen aan de magneet en een 30 µm filter bovenaan de kolom te behouden elke resterende cel klontjes toe te voegen. Spoel de filter- en kolominstellingen met magnetische selectie buffer zoals aanbevolen.
- De celsuspensie toepassen in de kolom. Spoel 3 keer met magnetische selectie buffer.
- De kolom overbrengen in een buis 15 mL, voeg 5 mL van magnetische selectie buffer en de plunjer om los van de geselecteerde cellen in de kolom toepassen.
- Het vergroten van de zuiverheid, herhaalt u stappen 4.4-4.6 met de herstelde cellen met behulp van een nieuwe kolom. In Figuur 1 cis het bereik van cel herstel na magnetische kraal selectie gepresenteerd.
5. beoordeling van de zuiverheid van de cel: Stroom Cytometry en microscopie
- Antilichaam kleuring voor stroom cytometry:
- Resuspendeer tot 1 x 106 cellen in 100 µL van PBS met 20% warmte-geïnactiveerd HS te blokkeren Fc receptoren, en incubeer gedurende 10 min op ijs.
- Voeg de gewenste fluorescently label antilichamen en het reagens voor identificatie van dode cellen (voor een voorbeeld, zie punt 6.5). Fluorescentie minus één (FMO) controles te de poorten, gebruiken compensatie kralen voor te bereiden op één vlek besturingselementen compensatie instellen Voorbeelden van antilichamen die gebruikt zijn gegeven in tabel 1. Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C, beschermd tegen licht.
- Wassen van de cellen met 2 mL magnetische selectie buffer.
Opmerking: De aanwezigheid van EDTA is belangrijk te voorkomen dat de vorming van cel samendoen voor flow cytometrische analyse. Draai naar beneden en verwijder het supernatant. - De cellen door toevoeging van 100 µL van 2%-oplossing van de paraformaldehyde per buis bevestigen.
- Analyseer de monsters in een stroom cytometer10,11.
- Draaien de kolom (bijvoorbeeld, cytospin) en toepassing Giemsa-kleuring voor het analyseren van de morfologie:
- Resuspendeer de cellen in 200 µL van magnetische selectie buffer.
- Laden in een kolom van de spin en de spin voor 5 min. Laat de dia volledig drogen.
- Herstellen van de dia door onderdompeling in 100% methanol gedurende 2 minuten spoelen de dia met gedeïoniseerd water en laat ze in de lucht droog.
- Voer een standaard Wrights-Giemsa-kleuring. Dekking van de cellen met eosine en incubeer gedurende 10 min, spoel af met gedeïoniseerd water en laten drogen. Dekking van de cellen met Wrights-Geimsa vlek, Incubeer gedurende 1 min, spoel af met gedeïoniseerd water, en droge lucht.
- Bekijk de voorbereidingen met een omgekeerde Microscoop (figuur 2A, 40 X doelstelling).
6. allogene stimulatie test om te beoordelen van de functie van de cel DC
- Ontdooi de bevroren perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs)
- Warm de cel voedingsbodems met 10% HS tot 37 ° C.
- Ontdooi de PBMCs door het plaatsen van de cryotube in een waterbad 37 ° C, totdat een kleine hoeveelheid bevroren cel media in de cryotube blijft. In een steriele omgeving, breng de inhoud van de cryotube tot 10 mL van de voedingsbodems voorverwarmde cel met 10% HS in een tube van 15mL.
- Centrifugeer bij ~ 500 x g voor 7 min. verwijderen van de media, verspreiden de pellet, resuspendeer de PBMCs in 10 mL cel voedingsbodems met 10% HS en centrifuge de cellen.
- Herhaal de stap was een derde keer. Cellen tellen.
- Naïve T-cel-selectie:
- Gebruik een negatieve selectie magnetische antilichaam cel selectie kit te naïef T-cellen isoleren volgens protocol van de fabrikant.
- Controleer de zuiverheid met CD45RA en CCR7 antilichamen na isolatie.
Opmerking: Typische zuiverheid is > 99% naïef T-cellen.
- Naïve T-cel proliferatie kleurstof vlekken:
- Bereiden 600 µL van 2 x oplossing van cel proliferatie kleurstof, de kleurstof te beschermen tegen blootstelling aan licht.
- Wassen van de naïeve T-cellen 2 x met PBS. Resuspendeer de cellen in 500 µL PBS.
- Terwijl zachtjes vortexing toevoegen de cellen in het kabinet, biosafety 500 µL van proliferatie kleurstof aan de naïeve T-cellen.
- Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 37° C.
- Stop het labelen van de cel door toevoeging van 5 mL van cel voedingsbodems met 10% HS aan de cellen. Incubeer op ijs voor 5 min, beschermd tegen licht.
- Centrifugeer de cellen bij ~ 500 x g gedurende 7 minuten, de media gecombineerd en resuspendeer de cellen in de 4 ° C voor cel voedingsbodems met 10% HS. Herhaal nog tweemaal voor een totaal van 3 wasbeurten. Neem een hoeveelheid cellen zullen worden geteld voorafgaand aan de laatste centrifugeren.
Opmerking: Doorgaans laatste naïef T-cel nummers zullen variëren tussen 5% en 15% van de initiële PBMC cel graaf. - Resuspendeer de cellen met de cel-cultuur-media met 10% HS in de gewenste cel concentratie.
- DC-allogene naïef T-cel co cultuur:
- De geïsoleerde DCs en naïef T-cellen in een 96-Wells, ronde bodem plaat, plaat op een 1:15 verhouding van DCs naar T-cellen. Ervoor zorgen dat het optimale aantal voor DCs varieert tussen de 3.000 en 5.000 cellen per putje.
- Centrifugeer de plaat duikt met ~ 500 x g gedurende 3 minuten om ervoor te zorgen dat de cellen zich bevinden in het midden van de put. Cel-naar-cel contact is belangrijk voor de juiste signalering optreden.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 6 dagen. Toezicht op het cluster van cellen, die worden weergegeven in de putjes zoals proliferatie, met microscopie (figuur 3A gebeurt).
- Stroom cytometry vlekken om te beoordelen van verspreiding:
- Na 6 dagen, kunnen de cellen door stroom cytometry worden onderzocht. De co cultuur voor stroom cytometry vlek.
- Bereid een 2 x-oplossing van gele levensvatbaarheid kleurstof (maximale emissie 572 nm) in PBS.
Opmerking: Het gebruik van PBS zonder serum is belangrijk, als serum eiwitten mengen met de kleurstof). - De plaat met cellen bij centrifugeren ~ 500 x g gedurende 5 minuten.
- 100 µL van de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
Opmerking: op dit punt verzamelen en opslaan van het supernatant voor afzonderlijke analyse van oplosbare factoren. - Wassen van de cellen twee keer met PBS: toevoegen van 150 µL per putje van PBS, centrifugeer bij ~ 500 x g gedurende 5 minuten, verwijder 150 µL van bovendrijvende substantie met een pipet. Zorg ervoor dat er 50 µL van supernatant in elk putje blijft.
- Aan elk putje 50 µL van 2 x levensvatbaarheid kleurstof toevoegen Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, beschermd tegen licht.
- Tijdens de incubatie, bereiden een master mengsel van gewenste antilichaam markers. Bijvoorbeeld: CD3 APC/Cy7, CD4 PE, CD8 FITC, enz.
- Het antilichaam mengsel toevoegen aan elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, beschermd tegen licht.
- Wassen van de cellen 2 x met PBS + 2% HS: toevoegen van 150 µL per putje van PBS + 2% HS. Centrifugeer bij ~ 500 x g voor 5 min. verwijderen 150 µL van bovendrijvende substantie met een pipet.
- Het vaststellen van de cellen door toevoeging van 100 µL per putje van 2% para-formaldehyde. Indien nodig: de cellen en de media overzetten polypropyleen stroom cytometry buizen. Buizen worden bij 4 ° C bewaard en beschermd tegen het licht, tot en met de stroom cytometrische analyse.
- Lees buizen in een flow-cytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgende weefsel spijsvertering, de vrijlating van epitheliale bladen en klieren kan worden waargenomen, zoals weergegeven in figuur 1A; Dit is een positieve controle verschijnt dat de enzymatische vertering is voltooid. Het aantal totaal aantal levensvatbare cellen en DCs hersteld per gram weefsel worden ook weergegeven in figuur 1B en Figuur 1 c, respectievelijk. Immune cellen vertegenwoordigen tussen 5-30% van de stromale cellen vóór dichtheid centrifugeren12,13. Figuur 2 toont de morfologie (figuur 2A) en zuiverheid (figuur 2B, C) van de geïsoleerde DCs. Wanneer twee rondes van de selectie worden uitgevoerd zoals vermeld in het protocol, varieert de verwachte zuiverheid tussen 85-92% (figuur 2C). Het aantal herstelde cellen is variabel en hangt af van het oorspronkelijke weefsel grootte en donor variabiliteit. Karakterisering van geïsoleerde cellen geweest beschreven13. Figuur 3 toont een representatieve allogene stimulatie test om te beoordelen van DC functionaliteit. Figuur 3A geeft de karakteristieke T-cel-bosjes die verschijnen wanneer proliferatie optreden, en figuur 3B de kwantificering van de proliferatie door stroom cytometry toont. Andere functionele testen, zoals virale vangen of cytokine en chemokinereceptoren productie kunnen ook worden uitgevoerd13. Figuur 4 toont de gating strategie om te identificeren van verschillende DCs populaties in de verschillende anatomische compartimenten van de FRT na stroom-cytometrische analyse van verrijkte Gemengde cel schorsingen (figuur 4A). De titratie van antilichamen en negatieve controles zijn belangrijk, aangezien DCs en macrofagen tonen hoog autofluorescence. FMO besturingselementen worden weergegeven in figuur 4B. Figuur 4C ziet u voorbeelden van hoe te identificeren specifieke deelverzamelingen van de DC, zoals CD1c +, CD207 + of CD103 + DCs.
Figuur 1: weefsel verwerking en cel beschikbaarheid. (A) representatieve afbeelding van epitheliale lakens en klieren vrijgegeven na vertering van weefsel. (B) bereik van totale aantal levensvatbare cellen herstelde zich na het weefsel verwerking en verwijdering van de dode cel in elk compartiment FRT: baarmoederslijmvlies (EM), endocervix (CX) en ectocervix (ECX). Elke stip geeft cellen van een ander onderwerp. (C) nummer van DCs herstelde zich per gram weefsel na magnetische kraal isolatie. B en C zijn aangepast van13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: morfologie en zuiverheid van de geïsoleerde cellen. (A) dendritische morfologie van de geïsoleerde cellen bepaald door microscopie na Giemsa-kleuring. (B) uitdrukking van fenotypische markeringen voor en na de kraal isolatie, zoals bepaald door de stroom cytometry. (C) vertegenwoordiger zuiverheid verkregen na CD1a + en CD14 + kraal isolatie. Aangepast van13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: proliferatie assay. (A) representatieve microscopie beelden van T-cel formatie tijdens proliferatie cluster: fase contrast (links), proliferatie kleurstof vlekken (midden), en bedekken (rechts). (B) representatief voorbeeld van inductie van proliferatie na co cultuur van baarmoederslijmvlies CD1a + of CD14 + DCs geïsoleerd en allogene naïef T-cellen bevroren PBMCs. B verkregen is aangepast van13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Phenotypical karakterisering van DCs in de verrijkte Gemengde cel schorsingen van de FRT. (A) strategie voor de identificatie van DCs in de gemengde celsuspensie Gating. Elke gated bevolking in multicolor percelen wordt weergegeven in het volgende venster. Contour percelen tonen de CD11c + CD11b + en CD11c + CD11b-poorten, respectievelijk. Markeringen die ongewenste cellen opsporen kunnen worden gekleurd met behulp van hetzelfde kanaal ze uit te zonderen van de analyse; bijvoorbeeld, dode cellen, CD3 + en CD19 + cellen. (B) FMO controles vast te stellen van de juiste poorten. (C) discriminatie van DC deelverzamelingen na de gating strategie. Contour percelen werden gekozen in plaats van multicolor percelen te nauwkeuriger de verdeling van de bevolking vertegenwoordigen, toen de cel nummers laag10 waren. Lage cel nummers worden verwacht aan het einde van de gating strategie, zoals weefsel DCs zeldzame populaties zijn. Aangepast van13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Cel marker | Fluorescerende | Kloon | Concentratie | Bedrag van antilichaam per monster |
| (in 100 µl van buffer) | ||||
| CD45 | vioblue450 | HI30 | 1.0 µg/5µl | 0.4 µg |
| CD11b | PE | ICRF44 | 1.0 µg/5µl | 0.4 µg |
| CD11c | PerCp/Cy5.5 | Bu15 | 200 µg Mo/ml | 0.4 µg |
| CCR5 | PE-Cy7 | 2D 7 | 0,25 µg/5µl | 0,1 µg |
| CCR7 | PE-Cy7 | REA108 | 99 µg Mo/ml | 0,2 µg |
| HLA-DR | BV-570 | L243 | 100 µg/ml | 0,2 µg |
| HLA-DR | FITC | AC122 | 82,5 µg Mo/ml | 0.16 µg |
| CD3 | APC | UCHT1 | 16 µg Mo/ml | 0.03 µg |
| CD3 | viogreen | REA614 | 137 µg Mo/ml | 0,27 µg |
| CD163 | APC | GHI/61 | 80 µg Mo/ml | 0.16 µg |
| CD207 | APC | 1OE2 | 200 µg Mo/ml | 0.4 µg |
| CD1a | FITC | HI149 | 0,5 µg/5µl | 0,2 µg |
| CD1a | AF-700 | HI149 | 0,5 mg/ml | 1.0 µg |
| CD103 | PE-Cy7 | B-Ly7 | 0,25 µg/5µl | 0,1 µg |
| CD83 | PE | HB15e | 0,25 µg/5µl | 0,1 µg |
| CD14 | APC-brand | 63D 3 | 400 µg Mo/ml | 0.8 µg |
| CD209 | FITC, PE, APC | 120507 | 1,25 µg/0,25 ml | 0,01 µg |
| Zombie levensvatbaarheid van de gele kleurstof | ||||
| 7AAD | 0,1 mg/ml | 0.2ug |
Tabel 1: Voorbeeld van antilichamen voor de karakterisatie van DCs in de FRT door stroom cytometry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mucosale DCs zijn een zeldzame celpopulatie sterk beïnvloed door het milieu weefsel, dat verandert hun fenotype en functie zodra ze de weefsels3invoert. Terwijl bloed afkomstig DCs zijn een handig model, ze doen niet geheel representatief is de diversiteit van DC populaties gevonden in weefsels. Daarom, om te begrijpen van de unieke kenmerken van mucosal DCs, isolatie van primaire cellen van weefsels is noodzakelijk. Isolatie van DCs van verschillende anatomische sites in de FRT biedt de mogelijkheid om te studeren DC functie in vitro en vergelijk tussen DC deelverzamelingen en anatomische locatie.
Wij bieden hier een protocol waarmee de zuivering van DCs van FRT weefsels voor in vitro -beoordeling van de functionele kenmerken. Aangezien DCs op mucosal sites in lage aantallen worden gevonden, ontwikkelden we een protocol om te verrijken het weefsel cel voorbereiding door dichtheid kleurovergang centrifugeren en dode cel verwijdering voorafgaand aan cel isolatie met magnetische kralen. Correcte verwijdering van dode cellen is de sleutel, als zij met kraal isolatie interfereren zal. Deze techniek biedt hoge zuiverheid van positief geïsoleerde cellen (≈ 90%), in een relatief korte tijd (4-6 h), en zonder de noodzaak voor overnachting incubatie, in vitro celkweek of migratie voorafgaand aan isolatie, die elk DCs kunt activeren en hun fenotypische kenmerken wijzigen. Ons protocol activeren geen cel activatie, zoals gemeten door het ontbreken van up-regulatie van rijping markeringen (CD86, HLA-DR, CD83)13. Een ander voordeel is het gebruik van een niet-Proteolytische enzymatische spijsvertering, die doet niet klieven oppervlakte markeringen en zorgt voor onmiddellijke cel isolatie of phenotypical analyse na weefsel spijsvertering14.
Kritisch zijn bij dit protocol is de generatie van de schorsing van een enkele cel om te voorkomen dat de blokkade van de magnetische kolommen. Om hiervoor te zorgen, moeten de dode cellen worden verwijderd vóór de magnetische celselectie, filters moeten worden gebruikt op de top van de magnetische kolommen, en weefsels groter is dan 3 g moeten worden verdeeld over de twee kolommen. Het gebruik van een tweede kolom na de eerste ronde van de zuivering is de sleutel tot hoge cel zuiverheid.
Een beperking van de isolatie-methode is de inherent lage aantal DCs in FRT weefsels, die meestal niet mogelijk is om goede cel herstel van weefsels kleiner dan 1 g. Onder deze omstandigheden kunnen phenotypical analyses echter nog steeds worden uitgevoerd met behulp van de verrijkt gemengd celsuspensie. Dit is mogelijk als gevolg van de niet-Proteolytische spijsvertering methode gebruikt, die doet niet klieven oppervlakte markeringen en zorgt voor onmiddellijke analyse van cel fenotype na weefsel spijsvertering14. Bovendien is de leeftijd van de patiënt kunnen een factor die van invloed op het aantal cellen hersteld.
Met behulp van dit protocol, hebben we eerder aangetoond dat CD1a + isolatie een fenotypische meer homogene populatie dan CD14 + selectie13 biedt; CD1a + DCs zijn echter moeilijk te herstellen van CX en ECX. Terwijl CD14 kan ook worden uitgedrukt op macrofagen, vonden we dat de FRT CD14 + geïsoleerde bevolking rijk aan DCs is, gebaseerd op co uitdrukking van DC markeringen en hun vermogen om het stimuleren van allogene naïef T-cellen, die is de functie van een waarmerk van DCs13.
Aangezien het aantal DCs hersteld over het algemeen laag is (< 100.000 totaal aantal cellen), functionele studies moeten worden geoptimaliseerd voor lage cel nummers. Hier laten we de optimalisatie van een allogene stimulatie assay, die kan worden uitgevoerd met slechts 3000 DCs/goed. Wij hebben verricht naar andere studies van de functie met deze cellen, met inbegrip van hormonale responsiviteit, cytokine en antimicrobiële peptide de productie bij HIV-stimulatie en HIV-vangst door FRT DCs13. Zodra de DCs zijn geïsoleerd en verguld, moeten tests worden verricht binnen 24 h, zoals de levensvatbaarheid van de cellen vermindert na die tijd.
Dit protocol kan worden aangepast aan het isoleren van de verschillende subgroepen van de DC, of andere celtypes door het selecteren van de juiste markeringen gekoppeld aan de magnetische kralen en combineren sequentiële kraal voor positieve en negatieve selectie te verwijderen van ongewenste celtypes. Een waarschuwing, niettemin, is dat met elke ronde van de selectie bepaald percentage van de cellen zal worden verloren, dus voor de isolatie van de FRT DCs, die reeds zeldzaam zijn, en de grootte van het weefsel is over het algemeen klein, meerdere rondes van de selectie met verschillende merkers (en de nodige wast verbonden) zijn niet wenselijk. Bovendien kan dit protocol worden aangepast om andere immune cellen of DCs isoleren van andere weefsels14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Ondersteund door de NIH studiebeurzen AI102838 en AI117739 (CRW). Wij danken Richard Rossoll voor technische bijstand. Flow cytometrische analyse werd uitgevoerd in DartLab, de gedeelde Resource Dartmouthsupported door (P30CA023108-37) en (P30GM103415-15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
