Summary
여기 분리 하 고 그들의 phenotypical 및 기능 특성의 평가 대 한 인간의 여성 재생산 지역에 다른 해 부 격실에서 수지상 세포를 정화 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다른 면역 세포 또는 다른 점 막 조직에서 수지상 세포를 분리 적용할 수 있습니다.
Abstract
인간의 수지상 세포 (DCs) 점 막 조직에서의 특성화 샘플, 취득에 어려움으로 인해 도전 이며 DCs의 낮은 수는 조직 당 제시. 그러나, 표현 형 및 Dc의 기능 조직 환경에 의해 수정 되는, 그것은 조직 거주 DC 인구 분석, 혈액 파생 Dc 불완전 이후 반영 Dc의 복잡 한 조직에 필요한. 여기 우리는 인간 여성 생식 관에서 (FRT) 자 군 절제 견본을 사용 하 여 phenotypical 및 기능 분석을 허용 하는 Dc를 분리 하는 프로토콜을 제시. 조직 소화 혼합 세포 현 탁 액, 긍정적인 자기 구슬 선택 다음 단일 셀을 생성 하는 프로토콜에 의하여 이루어져 있다. 우리의 조직 소화 프로토콜 않습니다 하지 쪼개 다 표면 마커, phenotypical 기능 분석 Dc 야간 보육 또는 셀 활성화 없이 안정 된 상태에 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 면역 세포 유형의 격리 또는 다른 조직에서 Dc의 격리에 대 한 적응 될 수 있다.
Introduction
FRT 이식 및 임신1하면서 병원 균에 대 한 보호의 이중 기능이 있다. 이 작업을 수행 하는 FRT는 들 에게만, 각 해 부 지역 표시 하는 독특한 조직학, 면역학, 및 기능적 특성1.
DCs 점 막 표면에 존재 확인 폐, 창 자, 그리고 성 기 요로에 미생물과 접촉 하 고 잠재적인 병원 균2에 대 한 면역 감시를 제공 합니다. DCs 프라임 순진한 T-세포 및 적응 면역 반응3는 독특한 기능이 있다. Dc는 FRT에도 정자 및 성공적인 임신4있도록 개발 태아에 있는 등 외국 항을 용납을 전문화 된다. 따라서, 위치에 따라 DC 형 및 기능 있을 것 이다 고유. 그것은 그들의 숫자, 표현 형, 고 기능 조직 환경 존재 하는3에 의해 수정 되는 Dc는 조직 환경에 의해 강하게 영향을 알려져 있다. 따라서, FRT Dc 전염 성 질환, 임신, 그리고는 FRT에 암에 재생 하는 역할을 이해 하려면 거주 Dc 혈액 파생된 DC 모델은 FRT 조직에서 발견 규제 복잡성을 해결 하기 위해 적절 한 이후 공부 필요.
인간의 조직 특성 거주 Dc 세포 점 막 조직에의 낮은 수와 인간의 조직 샘플을 얻기 어려움 도전적 이다. Dc에서 FRT immunohistochemistry5,6, 조직 내의 셀 위치에 대해 알려줍니다 하지만 기능 연구 하는 걸로 하 고 셀 마커 분석 될 수 있는 식별 하는 수에 제한 됩니다를 사용 하 여 연구 에 한 번. 또한, 단일 세포 격리 프로토콜 흐름 cytometric 분석에 대 한 개발된7,,89되었습니다. 이러한 프로토콜의 일부 활용 마이그레이션하는 그 세포를 분리 하는 Dc의 철새 용량. 이러한 메서드는 일반적으로 하룻밤 외피 및 활성화 된 Dc의 선택을 요구 하지만 안정 된 상태에서 Dc의 연구에 대 한 허용 하지 않습니다.
여기, 우리는 FRT, endometrium (EM)에서 다른 해 부 사이트에서 Dc를 분리 하는 프로토콜 최적화 된 hysterectomy 표본을 사용 하 여, endocervix (CX), 그리고 ectocervix (ECX), phenotypical 및 기능 분석을 가능 하 게. 비 분해 효소 소화 프로토콜을 사용 하 여, 우리 조직 세포 활성화 없이 셀 고립과 흐름 cytometric 특성을 소화 후 즉시 진행할 수 있습니다. 다 색 cytometry 사용 하 고 적응 하는 셀의 낮은 수에 대 한 기능 연구, 우리 식별 하 고 Dc는 FRT.의 다른 사이트에서의 드문 하위 집합의 특성
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Protocol
인체와 관련 된 연구는 헬싱키의 선언에 표현 하는 원칙에 따라 실시 했다. 연구는 다트머스 대학 기관 검토 위원회와 보호의 인간의 과목 (CPHS)를 위한 위원회에 의해 승인 되었다. 서 면된 동의 다트머스-히치콕 병원 (레바논, NH) hysterectomies를 받고 HIV 음성 여성에서 수술 전에 얻은 했다. 숙련 된 병리학 ECX, 병 적인 장애의 자유롭고 병 리의 사이트에서, CX, 및 그들에서 조직 샘플을 선택. 혈액 샘플은 다트머스 히치콕 의료 센터에서 모집 하는 자원 봉사 건강 한 기증자 로부터 얻은 했다. 혈액 기증자 했다 익명입니다. 수술 실에서 갓 고립 된 전각, CX, 및 ECX 조직 고립과 분류 사전 별도, 살 균 하는 폴 리 프로필 렌 튜브에 우리의 실험실에 전송에 대 한 병 리로 옮겨 졌다.
1. 효소 소화의 조직
참고: 살 균 물질을 사용 하 고 생물 안전 캐비닛에서 작동.
- 수정 된 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)와 페 놀 레드, 100 U/mL 페니실린 스, 0.35 g/L NaHCO3, 20 mM HEPES 1 x HBSS를 사용 하 여 준비 합니다.
- 효소 칵테일을 준비 (수정 HBSS, 450 U/mL 콜라 4, 0.01% [wt/집] deoxyribonuclease, 2 mg/mL D-포도 당). 살 균 0.22 μ m 필터를 통해 솔루션을 전달 합니다. 이상적으로,의 사용, 하루에 소화 효소를 준비 하지만 저장용-20 ° C에 얼 수 있다. 반복 및 주기를 해빙 하지 마십시오.
- 수정 HBSS와 100 x 15 m m2 배양 접시에서 조직 린스. 조직의 사용 가능한 금액에 따라 페 트리 접시 크기와 사용 하는 효소 칵테일의 볼륨 조정 (단계 1.4.2 아래 참조).
참고: 조직 병 리, 1-10에서 배열에서 얻은 수술 샘플에 따라 크기가 다양 합니다. - 일회용 메스와 집게 물리적 처리:
- 절단 하면서 건조를 방지 하기 위해 조직에 소화 효소 칵테일의 약 3 mL를 추가 합니다.
- 집게를 사용 하 여 조직을 안정화 하 고 칵테일 소화 효소에 노출 하는 직물의 표면 영역을 증가 하는 메스를 말하다. 작은 조각 (< 2mm 측에)에 조직을 잘라. 모든 조직 조각 (5 mL/g 조직)를 충당 하기 위해 충분 한 소화 효소 칵테일을 추가 합니다. 페 트리 접시에 뚜껑을 놓습니다.
- 5% CO2 45 분 흘리 고 또는 거품을 생산 하지 않고 철저 하 게 혼합 소화 효소 칵테일을 회전 속도 확인을 위해 약 80 rpm에 회전에 37 ° C에서 품 어.
- 4 X 거꾸로 가벼운 현미경으로 조직 준비 10 X 목표를 시각화.
참고: 소화, 후 작은 조직 조각 및 표시 상피 땀 샘을 포함 하 여 혼합된 셀 서 스 펜 션 존재 해야 ( 그림 1A참조).
2. 단일 셀의 물리적 분리
- 메 마른 환경에서 홀더를 가진 긴장 된 250 µ m 메쉬를 150 x 15 m m2 페 트리 접시에 놓습니다. 메쉬 페 트리 접시의 표면 위에서 약 0.5 c m 인지 확인 합니다.
- 메쉬 수정된 HBSS의 2 mL와 습식 및 메쉬에 소화 조직 전송.
- 10 mL 주사기 플런저의 평평한 표면에 사용 하 여, 부드럽게 하지만 단단히, 갈기는 메시를 통해 소화 다진된 조직.
주의: 너무 적극적으로 연 삭 메시 손상 되며 세포 사망률 증가. 이 단계 결합 조직 및 점액에서 상피 세포와 stromal 세포 (면역 세포를 포함 하는) 별도 것입니다. - 조직 파편 철저 하 게 분산 되어, 일단 상승 메시 및 홀더 페 트리 접시의 3 mL와 린스 위의 2-3 cm HBSS 복구 추가 셀을 수정.
- 세포 현 탁 액을 수집 합니다. 페 트리 접시에 수정된 HBSS의 2 mL와 젖은 홀더 20 µ m 메쉬를 배치 합니다. 들고 메쉬 망을 통해 세포 현 탁 액을 부 어 2-3 cm 배양 접시와 수정된 HBSS 6 mL와 린스.
참고:이 단계는 메쉬를 통과 하는 단일 셀에서 위에 유지 됩니다 상피 시트 분리 됩니다. 통해 흐름 혼합된 셀 서 스 펜 션, 면역 세포 및 stromal 섬유 아 세포를 포함 하는. - 혼합된 셀 펜션과 10 분 Aspirate 액체에 대 한 500 x g에서 원심 분리기를 수집 하 고 펠 릿 조밀도 기온 변화도 원심 분리에 대 한 수정된 HBSS 4 mL에 resuspend.
- 아니 브레이크와 혼합된 세포 현 탁 액 3 mL 이상 polysucrose 솔루션 및 30 분 동안 500 x g에서 상 온에서 원심 분리기의 레이어. Polysucrose 솔루션의 위에서 흰색 밴드를 수집 하 고 PBS로 세척.
참고:이 분수 농축된 혼합된 세포 현 탁 액, 면역 세포에 풍부 하 고 일부 stromal 섬유 아 세포를 포함 하는.
3. 죽은 세포 제거
참고: 죽은 세포 (> 20%)의 큰 비율에에서 있는 농축된 혼합된 세포 현 탁 액 조밀도 기온 변화도 원심 분리 후, 자석 구슬 죽은 세포 제거 것이 좋습니다. 죽은 세포는 긍정적인 자기 구슬 선택 과정을 방해할 수 있기 때문에 제거 될 필요가 있다.
- 10 X 목적으로 가벼운 현미경에는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 농축된 혼합된 세포 현 탁 액 (500 g, 10 분, 4 ° C)의 모든 셀을 아래로 회전 합니다. 완전히 발음 하 고는 상쾌한 삭제. 1 x 107 총 셀 (라이브 및 죽은), 제조업체의 지침에 따라 당 죽은 세포 제거 구슬의 100 µ L를 추가 합니다. 15 분 동안 실 온에서 품 어.
- 30 µ m 필터 자석 열에, 셀 서 스 펜 션 적용 놓고 자기 열을 구슬 표시 된 셀을 허용 합니다.
- 권장된 (3 mL)으로 죽은 세포 제거 버퍼 열을 씻어. 흐름을 통해 라이브 셀을 포함 하는 수집 합니다. 죽은 세포 제거 후 셀 복구의 범위는 그림 1B에서 제공 됩니다.
참고: 이러한 셀 phenotypical 연구 (제 5) 얼룩이 cytometry 수행을 사용할 수 있습니다 또는 DC 절연 (제 4) 계속.
4. DC 정화 긍정적인 자기 구슬 선택에 의해
- 죽은 세포 제거 (3.2 단계), 다음 셀 아래로 회전 하 고 상쾌한, 제거 하 고 셀 펠 릿 1 x 107 셀 (PBS, 0.5% 열 비활성화 인간의 AB 혈 청 (HS), 2 mM EDTA) 당 80 µ L 자석 선택 버퍼에 resuspend.
- DC 인구의 긍정적인 선택에 대 한 CD1a 또는 CD14 자석 구슬 (20 µ L 자기 당 구슬 1 x 107 셀) 제조 업체의 지침에 따라 추가 합니다. 4° c.에서 15 분 동안 품 어
- 자기 선택 된 셀을 세척 하 고 스핀 다운, 버퍼를 완전히 제거. 자기 선택의 500 µ L의 최소 셀 resuspend
- 자석에 열을 연결 하 고 모든 나머지 세포 덩어리를 유지 하기 위해 열 상단 30 µ m 필터 추가. 필터 및 자기 선택 버퍼 권장 열 린스.
- 열에 세포 현 탁 액을 적용 합니다. 마그네틱 선택 3 번 린스 합니다.
- 15 mL 튜브에 열을 전송, 자기 선택 버퍼의 5 mL을 추가 하 고 열에서 선택한 셀을 출시 플런저를 적용.
- 순도 높이려면 새 열을 사용 하 여 복구 된 세포 단계 4.4-4.6을 반복 합니다. 마그네틱 비드 선택 후 셀 복구의 범위는 그림 1C에서 제공 됩니다.
5. 셀 순도의 평가: Flow Cytometry 그리고 현미경 검사 법
- 항 체 cytometry에 대 한 얼룩:
- 20%를 포함 하는 PBS의 106 셀 100 µ L x 1 resuspend 열 비활성화 Fc 수용 체를 차단 하 고 얼음에 10 분 동안 품 어 버렸습니다.
- 붙일 항 체 및 죽은 세포의 식별을 위해 시 약 분류는 원하는 추가 (예, 섹션 6.5 참조). 설정 하는 게이츠 고 보상 비즈를 사용 하 여 보상에 대 한 하나의 얼룩 컨트롤을 준비 하나 (FMO) 컨트롤 마이너스 형광을 설정 합니다. 사용 하는 항 체의 예는 표 1에 주어진 다. 빛 으로부터 보호 4 ° C에서 20 분 동안 품 어.
- 자기 선택의 2 mL로 세포 세척.
참고: EDTA의 존재는 흐름 cytometric 분석에 대 한 응집 하는 세포의 형성을 피하기 위해 해야 합니다. 스핀 다운 하 고는 상쾌한 삭제. - 튜브 당 2 %paraformaldehyde 솔루션의 100 µ L을 추가 하 여 셀을 수정.
- 교류 cytometer10,11에 샘플을 분석 합니다.
- 열 (예를 들어, cytospin) 스핀과 Giemsa 얼룩 형태 분석을 사용 하 여:
- 자기 선택의 200 µ L 셀 resuspend
- 5 분 동안 스핀에 스핀 열 로드. 슬라이드를 완전히 건조 보자.
- 수정 슬라이드 2 분 린스에 대 한 100% 메탄올에 침수에 의해 슬라이드 이온된 수로 그리고 건조 공기를 허용.
- 표준 Wrights Giemsa 얼룩을 수행 합니다. 오신 셀 커버 하 고 10 분 동안 품 어, 이온을 제거 된 물으로 씻어 말리 면. Wrights Geimsa 얼룩과 셀 커버, 1 분 동안 품 어, 이온을 제거 된 물으로 헹 구 고 건조 한 공기.
- 준비 (그림 2A, 40 X 목표) 거꾸로 현미경으로 검사 합니다.
6. 수용자 자극 DC 세포 기능을 평가 하기 위해 분석 결과
- 해 동 냉동된 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)
- 10% 셀 문화 미디어 따뜻한 HS 37 ° c
- 적은 양의 언된 셀 미디어는 cryotube에 남아 때까지 37 ° C 물 목욕에는 cryotube를 배치 하 여는 PBMCs를 녹여. 메 마른 환경에서 미리 데워 진된 셀 문화 미디어 10%의 10 mL에는 cryotube의 내용을 전송 15 mL 튜브에 HS.
- 원심에서 ~ 500 x g 7 분에 대 한 미디어를 제거, 펠 릿을 분산, 셀 문화 미디어 10 %HS, 그리고 원심 분리기의 10 mL에는 PBMCs resuspend 셀.
- 세척 단계는 제 3 시간을 반복 합니다. 셀을 계산 합니다.
- 순진한 T-셀 선택:
- 부정적인 선택 자기 항 체 셀 선택 키트를 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 순진한 T-세포를 분리.
- 절연, 후 CD45RA 및 CCR7 항 체를 사용 하 여 순도 확인 하십시오.
참고: 일반적인 순도 > 99% naïve T 세포입니다.
- 순진한 T 세포 확산 염료 얼룩이 지기:
- 600 µ L 셀 확산 염료, 염료를 보호 하는 빛에 노출에서의 2 배 솔루션의 준비.
- 순진한 T-세포 2 워시 x PBS. 500 µ L PBS에 셀 resuspend
- 부드럽게 vortexing 동안 biosafety 내각에 셀 순 T-세포를 확산 염료의 500 µ L를 추가 합니다.
- 37° c.에서 10 분에 대 한 셀을 품 어
- 세포 배양 10%의 5 mL을 추가 하 여 셀 라벨 중지 셀에 HS. 5 분, 빛 으로부터 보호에 대 한 얼음에 품 어.
- 원심에서 셀 ~ 7 분, 500g x 미디어, 발음 및 세포 배양 10%의 4 ° C에 셀 resuspend HS. 3 세척의 총에 대 한 두 번 더 반복 합니다. 마지막 원심 분리 이전 계산 셀의 약 수를 가져가 라.
참고: 일반적으로, 최종 순 T-셀 번호 초기 PBMC 세포 수의 15%와 5% 사이 범위 것입니다. - 10%로 셀 문화 미디어 셀 resuspend 원하는 셀 농도에서 HS.
- DC 수용자 naïve T 세포 공동 문화:
- 1시 15분에서 격리 된 Dc와 순진한 T-세포는 96-글쎄, 라운드-하단 접시에서 접시 T-세포에 Dc의 비율. 3000 및 5000 셀/잘 Dc 범위에 대 한 최적의 수를 확인 합니다.
- 원심에서 접시 ~ 500 x g 3 분 셀 우물의 센터에서 위치 확인. 셀 연락처 적절 한 신호 발생을 위해 중요 하다.
- 6 일 동안 37 ° C에서 품 어. 확산 발생, 현미경 검사 법 (그림 3A)와 우물에 표시 되는 셀의 클러스터를 모니터링 합니다.
- Flow cytometry 확산을 평가 하기 위해 얼룩:
- 6 일 후 세포 cytometry에 의해 시험 될 수 있다. Cytometry에 대 한 공동 문화 얼룩.
- PBS에서 노란색 생존 염료 (최대 방출 572 nm)의 2 배 솔루션을 준비 합니다.
참고: 혈 청 하지 않고 PBS 사용 하 여 중요 한, 혈 청으로 단백질 방해 염료). - 에 세포 격판덮개 원심 ~ 5 분 동안 500 x g.
- 상쾌한의 100 µ L을 제거 합니다.
참고:이 시점에서 수집 하 고 저장 성 요인의 별도 분석을 위한 상쾌한. - 두 번 PBS로 세포 세척: 150 µ L/잘 PBS의 추가에 원심 ~ 5 분 동안 500 x g 150 µ L를 피펫으로와 상쾌한의 제거. 각 잘에 남아 상쾌한의 50 µ L 인지 확인 합니다.
- 각 우물에 2 x 생존 염료의 50 µ L를 추가 합니다. 빛 으로부터 보호 하는 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
- 부 화, 중 원하는 항 체 마커 마스터 혼합물을 준비 합니다. 예: CD3 APC/Cy7, PE CD4, CD8 FITC, 등
- 각 우물에 항 체의 혼합물을 추가 합니다. 빛 으로부터 보호 하는 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
- 셀 2 워시 x PBS + 2 %HS: 150 µ L/잘 PBS + 2%의 추가 HS. 원심에서 ~ 500 x g를 피펫으로와 상쾌한의 5 분 제거 150 µ L에 대 한.
- 100 µ L / 2% 파라 포름알데히드의 우물을 추가 하 여 셀을 수정. 필요한 경우: 폴 리 프로필 렌 흐름 cytometry 튜브에 세포와 미디어를 전송. 튜브 4 ° C에서 보관 고 흐름 cytometric 분석까지, 빛에서 보호 될 수 있습니다.
- 교류 cytometer에서 읽기 튜브입니다.
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Representative Results
다음 조직 소화, 상피 시트와 땀 샘의 릴리스 관찰 될 수 있다, 그림 1A;와 같이 이것은 효소 소화 성공적인 나타내는 긍정적인 컨트롤입니다. 총 실행 가능한 세포 및 조직의 그램 당 복구 Dc의 숫자도 표시 됩니다 그림 1B 및 그림 1C, 각각. 면역 세포 밀도 원심12,13이전 stromal 세포의 5-30% 사이 나타냅니다. 그림 2 는 형태 (그림 2A)와 격리 된 Dc의 순도 (그림 2B, C). 2 라운드 선택의 프로토콜에서 수행 됩니다, 예상된 순도 85-92% (그림 2C) 사이 범위. 복구 된 셀 개수 변수 이며 초기 조직 기증자와 크기 변화에 따라 달라 집니다. 고립 된 세포의 특성 설명된13되었습니다. 그림 3 DC 기능을 평가 하는 대표적인 수용자 자극 분석 결과를 보여준다. 그림 3A 확산 발생, 그림 3B cytometry로 확산 정량화를 보여줍니다 때 나타나는 특성 T 세포 풀을 보여 줍니다. 바이러스 성 캡처 또는 cytokine 및 chemokine 생산 등 다른 기능 분석 수행된13수도 있습니다. 그림 4 는 농축된 혼합된 셀 사용 (그림 4A)의 흐름-cytometric 분석 후 뚜렷한 FRT 해부학 구획에 다른 Dc 인구를 식별 하는 제어 전략. DCs와 대 식 세포 표시 높은 autofluorescence 항 체와 부정적인 컨트롤의 적정 중요 하다. FMO 컨트롤 그림 4B에 표시 됩니다. 그림 4C 등 CD1c +, CD207 +, CD103 + Dc 특정 DC 하위 집합을 식별 하는 방법의 예를 보여줍니다.
그림 1: 조직 처리 및 셀 가용성. (A) 상피 시트와 땀 샘 조직 소화 후 출시의 대표 이미지. 조직 처리 및 각 FRT 구획에 죽은 세포 제거 후 복구 가능한 세포의 총 수의 (B) 범위: endometrium (EM), endocervix (CX), 및 ectocervix (ECX). 모든 도트는 다른 주제에서 셀을 나타냅니다. (C) 수의 Dc 자석 구슬 격리 후 조직의 그램 당 회복. B와 C는13에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 형태학 및 고립 된 세포의 순도. (A) 다음 Giemsa 얼룩 현미경 검사 법에 따라 격리 된 세포의 수지상 형태학. (B) 식의 phenotypic 마커 비드 격리, cytometry 정한 전후. (C) 대표 순도 CD1a + 및 CD14 + 구슬 격리 후 얻은. 13에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 확산 분석 결과. T-세포의 (A) 대표 현미경 이미지 클러스터 확산 동안 형성: 단계 대조 (왼쪽), 확산 (가운데), 얼룩 염료 및 오버레이 (오른쪽). (B)의 공동 문화 후 확산의 유도의 대표적인 예 절연 자궁내 막 CD1a + 또는 CD14 + Dc 이며 T-세포 냉동된 PBMCs. B에서 얻은 수용자 순진한13에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 고 농축에 Dc의 Phenotypical 특성 혼합 셀 정지는 FRT.에서 (A) 게이팅 혼합된 세포 현 탁 액에 Dc의 식별에 대 한 전략. 다 색 음모에 각 문이 인구는 다음 패널에 표시 됩니다. 등고선 플롯 표시 CD11c + CD11b +와 CD11c + CD11b-빌 게이츠, 각각. 분석;에서 그들을 제외 하는 동일한 채널을 사용 하 여 원치 않는 셀을 식별 하는 마커를 얼룩이 질 수 있다 예, 죽은 세포, CD3 + 고 CD19 + 셀. (B) FMO 컨트롤 적절 한 게이트를 확립 합니다. (C) DC 하위 집합 다음 제어 전략의 차별. 등고선 플롯 셀 숫자 낮은10때 더 정확 하 게 인구 분포를 표현 하기 위해 다 색 플롯 대신 선택 되었다. 낮은 셀 번호 조직 Dc는 드문 인구 제어 전략의 끝에 예상 된다. 13에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 셀 표식 | 형광 색소 | 클론 | 농도 | 샘플 당 항 체의 양 |
| (버퍼의 100 µ l)에 | ||||
| CD45 | vioblue450 | HI30 | 1.0 µ g/5µl | 0.4 µ g |
| CD11b | PE | ICRF44 | 1.0 µ g/5µl | 0.4 µ g |
| CD11c | PerCp/Cy5.5 | Bu15 | 200 µ g/ml | 0.4 µ g |
| CCR5 | PE-Cy7 | 2D 7 | 0.25 µ g/5µl | 0.1 µ g |
| CCR7 | PE-Cy7 | REA108 | 99 µ g/ml | 0.2 µ g |
| HLA-DR | BV-570 | L243 | 100 µ g/ml | 0.2 µ g |
| HLA-DR | FITC | AC122 | 82.5 µ g/ml | 0.16 µ g |
| CD3 | APC | UCHT1 | 16 µ g/ml | 0.03 µ g |
| CD3 | viogreen | REA614 | 137 µ g/ml | 0.27 µ g |
| CD163 | APC | GHI/61 | 80 µ g/ml | 0.16 µ g |
| CD207 | APC | 1OE2 | 200 µ g/ml | 0.4 µ g |
| CD1a | FITC | HI149 | 0.5 µ g/5µl | 0.2 µ g |
| CD1a | AF-700 | HI149 | 0.5 mg/ml | 1.0 µ g |
| CD103 | PE-Cy7 | B-Ly7 | 0.25 µ g/5µl | 0.1 µ g |
| CD83 | PE | HB15e | 0.25 µ g/5µl | 0.1 µ g |
| CD14 | APC 화재 | 63D 3 | 400 µ g/ml | 0.8 µ g |
| CD209 | FITC, PE, APC | 120507 | 1.25 µ g/0.25 ml | 0.01 µ g |
| 좀비 생존 노란색 염료 | ||||
| 7AAD | 0.1 mg/ml | 0.2ug |
표 1: Dc cytometry에 의해 FRT에 특성에 대 한 항 체의 예.
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Discussion
점 막 Dc는 조직 환경, 조직3입력 일단 그들의 표현 형 및 기능 변경에 의해 강하게 영향을 희귀 세포 인구. 혈액 파생 하는 동안 Dc 매우 유용한 모델, 그들은 조직에서 발견 되는 DC 인구의 다양성을 완전히 대표 하지 않는다. 따라서, 점 막 Dc의 독특한 특성을 이해, 조직에서 1 차 셀의 격리 필요 하다. Dc는 FRT에 다른 해 부 사이트에서의 절연 DC 기능에서 생체 외에서 연구 하 고 DC 하위 집합 및 해 부 위치 사이 비교 기회를 제공 합니다.
여기 우리는 생체 외에서 기능적 특성의 평가 대 한 인간의 FRT 조직에서 Dc의 정화를 허용 하는 프로토콜을 제공 합니다. 이후 Dc 낮은 숫자에 점 막 사이트에서 찾을 수 있습니다, 우리 밀도 그라데이션 원심 분리 및 자석 구슬 가진 셀 격리 전에 죽은 세포 제거 하 여 조직 세포 준비를 풍부 하 게 하는 프로토콜을 개발 했다. 죽은 세포의 적절 한 제거는 키, 그들은 구슬 격리에 방해가 됩니다. 이 기술은 (4-6 h), 시간의 비교적 짧은 시간에 긍정적으로 고립 된 세포 (≈ 90%)의 순도 제공 하 고 하룻밤 배양, 세포 배양 체 외에서 또는 절연 이전 마이그레이션에 대 한 필요 없이 각각의 Dc를 활성화할 수 있습니다 및 그들의 phenotypic 특성을 변경 합니다. 우리의 프로토콜 최대-성숙의 마커 (CD86, HLA-DR, CD83)13의 규제의 부족에 의해 측정 된 세포 활성화, 트리거되지 않습니다. 또 다른 장점은 비 분해 효소 소화 표면 마커를 쪼개 하지 않습니다 하 고 즉시 세포 격리 또는 조직 소화14다음 phenotypical 분석에 대 한 수의 사용 이다.
이 프로토콜에 중요 한 자석 열의 막힘을 피하기 위해 단일 세포 현 탁 액의 발생이 이다. 이것을 보장 하기 위해, 죽은 세포 자기 셀 선택, 필터 필요 자기 열 위에 사용 될 전에 제거 해야 합니다 그리고 조직 3 세대 보다 더 큰 2 개의 란 사이 분할 되어야. 두 번째 열 정화의 첫 번째 라운드 후의 사용 높은 셀 순도 열쇠입니다.
격리 방법의 한 가지 한계는 고유의 낮은 수 Dc의 FRT 조직에서 일반적으로 허용 하지 않는 좋은 셀 복구 조직 1 g 보다 작은. 그러나 이러한 상황에서, phenotypical 분석 여전히 수행할 수 있습니다 사용 하는 풍부한 세포 현 탁 액을 혼합. 이것은 가능 하 표면 마커를 쪼개 하지 않는 세포 표현 형의 즉각적인 분석을 위한 조직 소화14후 사용, 비 분해 소화 방법 때문 이다. 또한, 환자 나이 복구 하는 셀의 수를 영향을 미치는 요소를 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 이전 시연 CD1a + 절연 CD14 + 선택13; 보다 phenotypically 더 균질 인구를 제공 합니다. 그러나, CD1a + Dc는 CX ECX에서 복구 하기 어렵다. CD14 또한 대 식 세포에 표현 될 수 있다, 하는 동안 우리가 발견 FRT CD14 + 고립 된 인구 공동 식 DC 마커 및 Dc13의 특징 기능은 수용자 순진한 T-세포를 자극 하는 그들의 능력에 따라 Dc, 풍부 하다.
이후 Dc 복구의 수는 일반적으로 낮은 (< 100000 총 셀), 기능 연구는 낮은 세포 수에 대 한 최적화 될 필요가. 여기 우리가 3000 Dc/잘 실행 될 수 있는 한 수용자 자극 분석 결과의 최적화를 보여줍니다. 우리 호르몬 응답, 사이토카인, 그리고 FRT Dc13HIV-자극 및 HIV-캡처 시 항균 성 펩 티 드 생산을 포함 하 여 이러한 셀과 다른 기능 연구를 실시 했습니다. 일단 Dc 격리 도금, 세포 생존 능력 감소로 그 시간 후에 24 h, 내 분석 수행 되어야 한다.
이 프로토콜은 다른 DC 하위 집합을 적용할 수 있습니다 또는 적절 한 표시자를 선택 하 여 다른 세포 유형 결합 자석 구슬 및 원치 않는 셀 형식을 제거 하 결합 순차적 양수와 음수 구슬 선택. 한 주의 하지만, 그 선택의 모든 라운드 셀의 일부 비율 손실 됩니다, FRT Dc의 격리에 대 한 이미 드문, 그리고 조직의 크기는 일반적으로 작은, 그래서 다른 마커 (및 필요한 선택의 여러 라운드입니다. 세척 관련) 바람직하지 않습니다. 또한,이 프로토콜 다른 조직14,15다른 면역 세포 또는 Dc 격리 하기 위해 적응 될 수 있다.
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Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
NIH 지원 연구는 AI102838 및 AI117739 (CRW)을 부여 합니다. 우리는 기술 지원을 위한 리처드 Rossoll 감사합니다. 흐름 cytometric 분석은 DartLab, Dartmouthsupported (P30CA023108-37)에 의해 (P30GM103415-15)에서 공유 리소스에에서 실시 됐다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
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