Summary
Vi beskriver her en metode til at isolere og rense dendritiske celler fra forskellige anatomiske rum i den menneskelige kvindelige forplantningsorganerne for evalueringen af deres phenotypical og funktionelle egenskaber. Denne metode kan tilpasses til at isolere andre immunceller eller dendritiske celler fra andre slimhinden væv.
Abstract
Karakterisering af de menneskelige dendritiske celler (DCs) bopæl i slimhinden væv er udfordrende på grund af vanskeligheden ved at få udleveret prøver, og det lave antal DCs præsentere pr. væv. Men fænotype og funktion af DCs er modificeret af væv miljø, det er nødvendigt at analysere væv bosiddende DC populationer, da blodet stammer DCs ufuldstændigt afspejler kompleksiteten af DCs i væv. Her præsenterer vi en protokol for at isolere DCs fra menneskelige kvindelige forplantningsorganerne (FRT) ved hjælp af hysterektomi prøver der giver mulighed for både phenotypical og funktionelle analyser. Protokollen består af væv fordøjelse til at generere en enkelt celle blandet cellesuspension, efterfulgt af positiv magnetisk bead udvalg. Vores væv fordøjelsen protokol ikke spaltes celleoverflademarkører, som giver mulighed for phenotypical og funktionel analyse af DCs i steady state, uden natten inkubation eller celle aktivering. Denne protokol kan tilpasses til isolation af andre immun celletyper eller isolation af DCs fra andre væv.
Introduction
FRT har den dobbelte funktion at beskytte mod patogener knappanel implantation og graviditet1. For at opnå dette, er FRT opdelte, med hver anatomiske region viser unikke histologiske, immunologiske og funktionelle karakteristika1.
DCs stede ved slimhindeinfektioner gøre kontakt med mikrober i lungen, tarmen og kønsorganerne, og give immun overvågning for potentielle patogener2. DCs har den unikke evne til at prime naive T-celler og udløse adaptive immunrespons3. DCs i FRT er også specialiseret til at tolerere fremmede antigener, som dem der findes i sæd og det udviklende foster, at vellykket graviditet4. Derfor, afhængigt af placeringen, DC fænotype og funktion vil være adskilte. Det er kendt at DCs er stærkt påvirket af væv miljø, således at deres antal, fænotype og funktion er ændret af væv miljø, hvor de er placeret3. Derfor, for at forstå den rolle, FRT DCs spille i smitsomme sygdomme, graviditet og kræft i FRT, bosiddende DCs skal studeres, da blod afledte DC modeller er utilstrækkelige til at løse de regulerende kompleksiteter fundet i FRT væv.
Karakterisering af humant væv bosiddende DCs udfordrende på grund af det lave antal celler i slimhinden væv og det er vanskeligt at opnå menneskelige vævsprøver. DCs er blevet undersøgt i FRT ved hjælp af Immunhistokemi5,6, som informerer om celleplacering inden for væv, men udelukker funktionelle studier og er begrænset af antallet af at identificere celle markører, der kan analyseres på én gang. Desuden har enkelt celle isolation protokoller for analysen af cytometric været udviklede7,8,9. Nogle af disse protokoller drage fordel af DCs vandrende evne til at isolere de celler, der overflyttes. Disse metoder normalt kræver overnight inkubationer og udvalg af aktiverede DCs, men tillader ikke for undersøgelse af DCs i steady state.
Her, ved hjælp af hysterektomi prøver, vi optimeret en protokol for at isolere DCs fra forskellige anatomiske steder i FRT, endometriet (EM), endocervix (CX) og ectocervix (ECX), der giver mulighed for både phenotypical og funktionelle analyser. Ved hjælp af en ikke-proteolytiske enzymatisk fordøjelsen protokol, kan vi fortsætte umiddelbart efter væv fordøjelse til celle isolation og flow cytometric karakterisering uden celle aktivering. Ved hjælp af flerfarvet flowcytometri og tilpasse funktionelle studier for lavt antal celler, kan vi identificere og karakterisere sjældne delmængder af DCs i de forskellige steder i FRT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelser, hvor forsøgspersoner blev gennemført efter principperne udtrykt i Helsinki-erklæringen. Undersøgelser blev godkendt af Udvalget for beskyttelse af menneskelige emner (CPHS) og Dartmouth College institutionelle Review Board. Skriftligt informeret samtykke blev opnået før operationen fra HIV-negative kvinder, der gennemgår hysterektomier på Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Libanon, NH). Uddannet patologer valgt vævsprøver fra EM, CX og ECX, gratis af patologiske læsioner og fjernt fra steder i patologi. Blodprøver blev indhentet fra frivillige raske donorer rekrutteret på Dartmouth Hitchcock Medical Center. Bloddonorer var anonym. Frisk isolerede EM, CX og ECX væv fra operationsstuen blev overført til patologi for isolation og klassificering forudgående at overføre til vores laboratorium i separate, sterile polypropylen rør.
1. Enzymatisk nedbrydning af væv
Bemærk: Brug sterile materialer og arbejde i en biologisk sikkerhed kabinet.
- Forberede en modificeret Hank Balanced Salt løsning (HBSS) ved hjælp af 1 x HBSS med phenol rød, 100 U/mL penicillin-streptomycin, 0,35 g/L NaHCO3og 20 mM HEPES.
- Forberede den enzymatiske cocktail (ændret HBSS, 450 U/mL collagenase IV, 0,01% [wt/vol] deoxyribonuclease jeg, og 2 mg/mL D-glucose). Passere en steril 0,22 µm filter løsningen. Ideelt, forbereder fordøjelsen enzym dag af brug, men det kan fryses ved-20 ° C til opbevaring. Undgå gentagen nedfrysning og optøning cyklusser.
- Skyl væv med modificeret HBSS og sted i en 100 x 15 mm2 petriskål. Justere petriskål størrelse baseret på mængden af væv ledige og anvendte mængde enzym cocktail (Se trin 1.4.2 nedenfor).
Bemærk: Væv varierer i størrelse afhængigt af kirurgisk prøven fremstillet af patologi, lige fra 1-10 g. - Fysisk behandling med engangs skalpel og pincet:
- Tilsættes ca 3 mL fordøjelsen enzym cocktail til væv til at forhindre udtørring mens der skæres.
- Bruge pincet til at stabilisere væv og hakkekød med en skalpel til at øge overfladearealet af væv udsat for fordøjelsen enzym cocktail. Skære væv i små stykker (< 2 mm på en side). Tilføje tilstrækkelig fordøjelsen enzym cocktail for at dække alle væv stykker (5 mL/g væv). Låget lægges på petriskålen.
- Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 på en rotator på ca 80 rpm i 45 min. Kontroller at rotator hastighed grundigt blander fordøjelsen enzym cocktail uden spilde eller producerer bobler.
- Visualisere væv forberedelse med en inverteret lysmikroskop med 4 X og 10 X mål.
Bemærk: Efter fordøjelse, lille væv fragmenter og en blandet cellesuspension herunder synlige epitelial kirtler bør være til stede (Se figur 1A).
2. fysisk adskillelse af enkelt celler
- I et sterilt miljø, skal du placere en stram 250 µm mesh med indehaveren i en 150 x 15 mm2 petriskål. Sikre, at trådnet ca 0,5 cm over overfladen af petriskålen.
- Våd trådnet med 2 mL af modificerede HBSS og overføre den fordøjede væv på trådnet.
- Brug den flade del af en 10-mL sprøjte stemplet, sagte men fast, male fordøjet hakket vævet gennem trådnet.
Forsigtig: Slibning for aggressivt vil skade trådnet og øge celle dødelighed. Dette trin vil adskille epitelceller og stromale celler (herunder immunceller) fra bindevæv og slim. - Når væv fragmenter er blevet grundigt spredt, ophøje trådnet og indehaveren 2-3 cm over petriskål og skyl med 3 mL ændret HBSS til at gendanne yderligere celler.
- Indsamle cellesuspension. Placere 20 µm mesh med indehaveren i en petriskål og våd med 2 mL af ændrede HBSS. Hæld cellesuspension gennem den trådnet holder trådnet 2-3 cm over petriskål, og skyl med 6 mL af ændrede HBSS.
Bemærk: Dette trin vil adskille de epitelial ark, som er bevaret på toppen, fra enkelt celler, der passerer gennem trådnet. Gennemstrømnings-er en blandet cellesuspension, som omfatter immunceller og stromale fibroblaster. - Indsamle blandet cellesuspension og centrifugeres ved 500 x g i 10 min. aspirat væsken og resuspenderes i 4 mL af modificerede HBSS for tæthed gradient centrifugering.
- Lag af den blandede cellesuspension over 3 mL af polysucrose løsning og centrifugeres ved stuetemperatur på 500 x g i 30 min med ingen bremse. Indsamle de hvide bånd fra top af polysucrose løsning og vask med PBS.
Bemærk: Denne fraktion er beriget blandet cellesuspension, som er rig på immunceller og indeholder nogle stromale fibroblaster.
3. død celle fjernelse
Bemærk: Hvis en stor procentdel af døde celler (> 20%) findes i berigede blandet cellesuspension efter tæthed gradient centrifugering, død celle fjernelse med magnetiske perler kan anbefales. Døde hudceller skal fjernes, da de kan forstyrre positiv magnetisk bead udvælgelsesprocessen.
- Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer på et lysmikroskop med 10 X målet. Spin ned alle celler i beriget blandet cellesuspension (500 x g, 10 min, 4 ° C). Helt Aspirér og supernatanten. Tilsæt 100 µL af døde celle fjernelse perler pr. 1 x 107 samlede celler (levende og døde), ifølge producentens anvisninger. Inkuber ved stuetemperatur i 15 min.
- Placer en 30 µm filter på kolonnen magnetiske, gælder cellesuspension og lad perle-mærket cellerne til at falde igennem kolonnen magnetisk.
- Skylles kolonnen med døde celle fjernelse buffer som anbefalet (3 mL). Indsamle de gennemstrømnings-med de levende celler. Rækken af celle opsving efter døde celle fjernelse er præsenteret i figur 1B.
Bemærk: Disse celler kan bruges til at udføre flowcytometri farvning for phenotypical undersøgelser (afsnit 5) eller fortsætte med DC isolation (afsnit 4).
4. DC rensning af positiv magnetisk Bead udvalg
- Efter død celle fjernelse (trin 3.2), spin cellerne ned, Fjern supernatanten og resuspenderes celle i 80 µL magnetiske udvalg buffer pr. 1 x 107 celler (PBS, 0,5% varme-inaktiverede menneskelige AB serum (HS), 2 mM EDTA).
- Til positiv udvælgelse af DC populationer, tilføje CD1a eller CD14 magnetiske perler ifølge producentens anvisninger (20 µL magnetiske perler pr. 1 x 107 celler). Inkuber i 15 min. ved 4° C.
- Cellerne vaskes med magnetisk udvalg buffer, spin ned og fjerne buffer helt. Resuspend celler i et minimum af 500 µL af magnetiske udvalg buffer.
- Knytte kolonnen til magneten og tilføje en 30 µm filter på toppen af kolonnen for at bevare eventuelle resterende celle klumper. Skyl filter- og Kolonneindstillinger med magnetisk udvalg buffer som anbefalet.
- Anvende cellesuspension til kolonnen. Skyl 3 gange med magnetisk udvalg buffer.
- Overfør kolonnen til et 15 mL tube, tilsættes 5 mL af magnetiske udvalg buffer og anvende stemplet for at frigive de markerede celler i kolonnen.
- For at øge renheden, skal du gentage trin 4,4-4,6 med de gendannede celler ved hjælp af en ny kolonne. Rækken af celle opsving efter magnetisk bead valg er præsenteret i figur 1 c.
5. vurdering af celle renhed: Flow flowcytometri og mikroskopi
- Antistof farvning for flowcytometri:
- Resuspend op til 1 x 106 celler i 100 µL af PBS, som indeholder 20% varme-inaktiverede HS at blokere Fc receptorer, og der inkuberes i 10 min. på køl.
- Tilføj den ønskede fluorescently mærket antistoffer og reagens til identifikation af døde celler (for eksempel, se afsnit 6.5). Indstille fluorescens minus én (FMO) kontrol at fastlægge portene og bruge kompensation perler til at forberede enkelt pletten kontrolelementer for kompensation. Eksempler på antistoffer bruges er vist i tabel 1. Ruger i 20 min. ved 4 ° C, beskyttet mod lys.
- Cellerne vaskes med 2 mL af magnetiske udvalg buffer.
Bemærk: Tilstedeværelse af EDTA er vigtigt at undgå dannelsen af celle sammenklumpning for flow cytometric analyse. Spin ned og supernatanten. - Fix cellerne ved at tilføje 100 µL af 2% PARAFORMALDEHYD løsning pr tube.
- Analysere prøverne i et flow Flowcytometret10,11.
- Spin kolonne (f.eks., cytospin) og bruge Giemsa farvning for at analysere morfologi:
- Resuspend celler i 200 µL af magnetiske udvalg buffer.
- Indlæse i en spin kolonne og spin i 5 min. Lod den glide tørre fuldstændigt.
- Fix diasset ved nedsænkning i 100% methanol i 2 min. Skyl diaset med deioniseret vand og lad det luft tørre.
- Udføre en standard Wrights-Giemsa farvning. Dække celler med Eosin og inkuberes i 10 min., skyl med deioniseret vand og lad det tørre. Dække celler med Wrights-Geimsa pletten, inkuberes i 1 min., skyl med deioniseret vand og lufttørre.
- Undersøge forberedelserne med en inverteret mikroskop (figur 2A, 40 X mål).
6. allogen Stimulation Assay at vurdere DC cellefunktion
- Optø frosne perifert blod mononukleære celler (PBMC)
- Varm celle Kulturmedier med 10% HS til 37 ° C.
- Optø PBMC ved at placere cryotube i et 37 ° C vandbad, indtil en lille mængde af frosne celle media forbliver i cryotube. I et sterilt miljø, overføre indholdet af cryotube til 10 mL af pre varmede celle kultur medier med 10% HS i en 15mL tube.
- Der centrifugeres ved ~ 500 x g i 7 min. Fjern medierne, sprede pellet, resuspend PBMC i 10 mL af celle kultur medier med 10% HS, og der centrifugeres cellerne.
- Gentag trinnet vask en tredje gang. Tælle cellerne.
- Naïve T-celle udvalg:
- Brug en negativ udvalg magnetiske antistof celle udvalg kit for at isolere naive T-celler efter producentens protokol.
- Efter isolering, kontrollere renhed ved hjælp af CD45RA og CCR7 antistoffer.
Bemærk: Typisk renhed er > 99% naive T-celler.
- Naïve T-celle spredning farvestof farvning:
- Forberede 600 µL af 2 x opløsning af celle spredning farvestof, beskytter farven mod udsættelse for lys.
- Vaske naivt T-celler 2 x med PBS. Resuspend celler i 500 µL PBS.
- Mens blidt vortexing tilføje celler i biosikkerhed kabinet, 500 µL af spredning farvestof til naive T-celler.
- Inkuber celler i 10 minutter ved 37° C.
- Stop celle mærkning ved tilsætning af 5 mL af celle kultur medier med 10% HS til cellerne. Der inkuberes i isbad i 5 min, beskyttet mod lys.
- Centrifugeres celler på ~ 500 x g i 7 min, Aspirér medierne, og pelleten celler i 4 ° C celle kultur medier med 10% HS. Gentag to gange til et samlet beløb på 3 vasker. Tage en alikvot af celler til at tælle før den sidste centrifugering.
Bemærk: Typisk, endelige naive T-celle numre vil variere mellem 5% og 15% af den oprindelige PBMC celletal. - Resuspend celler med celle kultur medier med 10% HS på den ønskede celle koncentration.
- DC-allogene naive T-celle Co kultur:
- Plade isoleret DCs og naive T-celler i en 96-brønd, runde-nederste plade på en 1:15 forholdet mellem DCs til T-celler. Sikre, at optimale antallet for DCs svinger mellem 3.000 og 5.000 celler/brønd.
- Centrifugeres plade på ~ 500 x g i 3 min. at sikre, at cellerne er beliggende i centrum af brønden. Celle til celle kontakt er vigtigt for korrekt signalerer at forekomme.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 6 dage. Overvåge klyngen af celler, der vises i brøndene som spredning sker, med mikroskopi (figur 3A).
- Flow flowcytometri farvning for at vurdere spredningen:
- Efter 6 dage, kan celler undersøges ved flowcytometri. Plette fælles kultur til flowcytometri.
- Forbered en 2 x opløsning af gule levedygtighed farvestof (maksimal emission 572 nm) i PBS.
Bemærk: Brugen af PBS uden serum er vigtig, som serum proteiner interferere med farvestoffet). - Centrifugeres pladen med celler på ~ 500 x g i 5 min.
- Fjerne 100 µL af supernatanten.
Bemærk: på dette tidspunkt indsamle og gemme supernatanten separat analyse af opløselige faktorer. - Cellerne vaskes to gange med PBS: Tilføj 150 µL/brønd af PBS, centrifugeres ved ~ 500 x g i 5 min, fjerne 150 µL af supernatanten med en pipette. Sikre, at der er 50 µL af supernatanten tilbage i hver brønd.
- Tilsæt 50 µL af 2 x levedygtighed farvestof til hver brønd. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min, beskyttet mod lys.
- Under inkubation, forberede en master blanding af ønskede antistof markører. For eksempel: CD3 APC/Cy7, CD4 PE, CD8 FITC, osv.
- Tilføje antistof blandingen til hver brønd. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min, beskyttet mod lys.
- Vaske celler 2 x med PBS + 2% HS: Tilføj 150 µL/brønd af PBS + 2% HS. Der centrifugeres ved ~ 500 x g for 5 min. Fjern 150 µL af supernatanten med en pipette.
- Fix cellerne ved at tilføje 100 µL/brønd af 2% para-formaldehyd. Hvis det er nødvendigt: Overfør celler og medier til polypropylen flow flowcytometri rør. Rør kan opbevares ved 4 ° C og beskyttet mod lys, indtil strømmen cytometric analyse.
- Læs rør i et flow Flowcytometret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Følgende væv fordøjelse, frigivelse af epitel ark og kirtler kan observeres, som vist i figur 1A; Dette er en positiv kontrol, der angiver den enzymatiske fordøjelsen var vellykket. Antallet af samlede levedygtige celler og DCs inddrives pr. gram væv er også vist i figur 1B og figur 1 c, henholdsvis. Immunceller repræsenterer mellem 5-30% af de stromale celler før tæthed centrifugering12,13. Figur 2 viser morfologi (figur 2A) og af de isolerede DCs renhed (figur 2B, C). Når to runder af udvalg udføres som anført i protokollen, svinger de forventede renhed mellem 85-92% (figur 2 c). Antal genoprettede celler er variabel og afhænger af den oprindelige væv størrelse og donor variation. Karakterisering af de isolerede celler har været beskrevet13. Figur 3 viser en repræsentativ allogene stimulation assay at vurdere DC funktionalitet. Figur 3A viser de karakteristiske T-celle klumper, der vises, når spredning forekomme, og figur 3B viser spredning kvantificering ved flowcytometri. Andre funktionelle assays, såsom viral capture eller cytokin og chemokine produktion kan også være udført13. Figur 4 viser de gating strategi til at identificere forskellige DCs befolkninger i de særskilte FRT anatomiske rum efter flow-cytometric analyse af beriget blandet celle suspensioner (figur 4A). Titrering af antistoffer og negative kontroller er vigtige, som DCs og makrofager vise høj autofluorescence. FMO kontrolelementer er vist i figur 4B. Figur 4 c viser eksempler på, hvordan til at identificere specifikke DC delmængder, CD1c +, CD207 + eller CD103 + DCs.
Figur 1: væv forarbejdning og celle tilgængelighed. (A) repræsentativt billede af epitel ark og kirtler frigives efter væv fordøjelsen. (B) vifte af antallet af levedygtige celler inddrives efter væv forarbejdning og døde celle fjernelse i hvert FRT rum: endometriet (EM), endocervix (CX) og ectocervix (ECX). Hver prik repræsenterer celler fra et andet emne. (C) antallet af DCs inddrevet pr. gram væv efter magnetisk bead isolation. B og C er tilpasset fra13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: morfologi og renhed af de isolerede celler. (A) dendritiske morfologi af isolerede celler bestemmes ved mikroskopi efter Giemsa farvning. (B) udtryk for fænotypisk markører før og efter perle isolation, som bestemt ved flowcytometri. (C) repræsentative renhed opnået efter CD1a + og CD14 + perle isolation. Tilpasset fra13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: spredning assay. (A) repræsentative mikroskopi billeder af T-celle klynge dannelse under spredning: fase-kontrast (venstre), spredning farvestof farvning (i midten), og overlay (til højre). (B) repræsentative eksempel på induktion af spredning efter fælles kultur af isolerede endometrie CD1a + eller CD14 + DCs og allogene naive T-celler fremstillet af frosne PBMC. B er tilpasset fra13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Phenotypical karakterisering af DCs i den beriget blandet celle suspensioner fra FRT. (A) Gating strategi for identifikation af DCs blandet celle suspension. Hver låge befolkning i flerfarvet parceller er vist i panelet næste. Kontur plots Vis CD11c + CD11b + og CD11c + CD11b-gates, henholdsvis. Markører, at identificerer uønskede celler kan farves ved hjælp af samme kanal for at udelukke dem fra analyse; for eksempel, døde celler, CD3 + og CD19 + celler. (B) FMO kontrolelementer til at etablere passende gates. (C) forskelsbehandling af DC delmængder efter den gating strategi. Kontur plots blev valgt i stedet for multicolor parceller til mere præcist repræsenterer befolkningsfordeling når celle numre var lav10. Lav celle numre forventes i slutningen af strategiens gating som væv DCs er sjældne populationer. Tilpasset fra13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Celle markør | Fluorokrom | Klon | Koncentration | Mængden af antistof pr. prøve |
| (i 100 µl af buffer) | ||||
| CD45 | vioblue450 | HI30 | 1,0 µg/5 µl | 0,4 µg |
| CD11b | PE | ICRF44 | 1,0 µg/5 µl | 0,4 µg |
| CD11c | PerCp/Cy5.5 | Bu15 | 200 µg/ml | 0,4 µg |
| CCR5 | PE-Cy7 | 2D 7 | 0,25 µg/5 µl | 0,1 µg |
| CCR7 | PE-Cy7 | REA108 | 99 µg/ml | 0,2 µg |
| HLA-DR | BV-570 | L243 | 100 µg/ml | 0,2 µg |
| HLA-DR | FITC | AC122 | 82,5 µg/ml | 0.16 µg |
| CD3 | APC | UCHT1 | 16 µg/ml | 0,03 µg |
| CD3 | viogreen | REA614 | 137 µg/ml | 0,27 µg |
| CD163 | APC | GHI/61 | 80 µg/ml | 0.16 µg |
| CD207 | APC | 1OE2 | 200 µg/ml | 0,4 µg |
| CD1a | FITC | HI149 | 0,5 µg/5 µl | 0,2 µg |
| CD1a | AF-700 | HI149 | 0,5 mg/ml | 1,0 µg |
| CD103 | PE-Cy7 | B-Ly7 | 0,25 µg/5 µl | 0,1 µg |
| CD83 | PE | HB15e | 0,25 µg/5 µl | 0,1 µg |
| CD14 | APC-brand | 63D 3 | 400 µg/ml | 0,8 µg |
| CD209 | FITC, PE, APC | 120507 | 1,25 µg/0,25 ml | 0,01 µg |
| Zombie gule levedygtighed farvestof | ||||
| 7AAD | 0,1 mg/ml | 0.2ug |
Tabel 1: Eksempel på antistoffer til karakterisering af DCs i FRT ved flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Slimhinde DCs er en sjælden celle population stærkt påvirket af væv miljø, som ændrer deres fænotype og funktion, når de træder væv3. Mens blod afledt DCs er en meget nyttig model, de repræsenterer ikke fuldt ud mangfoldigheden af DC populationer fundet i væv. Derfor, for at forstå de unikke egenskaber af slimhinde DCs, dyrkning af primære celler fra væv er nødvendigt. Isolering af DCs fra forskellige anatomiske steder i FRT tilbyder mulighed for at studere DC funktion i vitro og sammenligne mellem DC delmængder og anatomiske steder.
Her giver vi en protokol, der giver mulighed for rensning af DCs fra humane FRT væv til in vitro- vurdering af funktionelle kendetegn. Da DCs er fundet slimhinde steder i lavt antal, udviklede vi en protokol til at berige væv celle forberedelse af tæthed gradient centrifugering og døde celle fjernelse før celle isolation med magnetiske perler. Ordentlig fjernelse af døde celler er afgørende, da de vil blande sig med perle isolation. Denne teknik giver høj renhed af positivt isolerede celler (≈ 90%), i en forholdsvis kort tid (4-6 h), og uden savn i natten inkubation, in vitro- cellekultur eller migration inden isolering, som hver kan aktivere DCs og ændre deres fænotypiske egenskaber. Vores protokol udløser ikke celle aktivering, som målt ved manglen op-regulering af modning markører (CD86, HLA-DR, CD83)13. En anden fordel er brugen af en ikke-proteolytiske enzymatisk fordøjelse, der ikke spaltes celleoverflademarkører og giver mulighed for øjeblikkelig celle isolation eller phenotypical analyse efter væv fordøjelsen14.
Kritisk til denne protokol er generation af en enkelt cellesuspension at undgå blokering af de magnetiske kolonner. For at sikre dette, døde celler skal fjernes, før den magnetiske cellemarkeringen, filtre skal bruges på toppen af kolonnerne magnetiske og væv større end 3 g bør fordeles mellem to kolonner. Brug af en anden kolonne efter først runde af rensning er nøglen til høj celle renhed.
En begrænsning af metoden isolation er det iboende lavt antal DCs i FRT væv, som normalt ikke tillader god celle opsving af væv mindre end 1 g. Under disse omstændigheder, men kan phenotypical analyser stadig udføres ved hjælp af den beriget blandet cellesuspension. Dette er muligt på grund af den ikke-proteolytiske fordøjelsen metoden, der ikke spaltes celleoverflademarkører og giver mulighed for øjeblikkelig analyse af celle fænotype efter væv fordøjelsen14. Derudover kan en patient alder være en faktor, der påvirker antallet af celler inddrevet.
Ved hjælp af denne protokol, har vi tidligere vist at CD1a + isolation giver en fænotype mere homogen befolkning end CD14 + udvalg13; CD1a + DCs er imidlertid vanskeligt at tilbagesøge CX og ECX. Mens CD14 kan også udtrykkes på makrofager, fandt vi, at den FRT CD14 + isoleret befolkning er rig i DCs, baseret på fælles udtryk for DC markører og deres evne til at stimulere allogene naive T-celler, som er et holdighedsstempel funktion af DCs13.
Da antallet af DCs inddrives er generelt lav (< 100.000 samlede celler), funktionelle studier skal optimeres for lav celle numre. Her viser vi optimering af en allogen stimulation assay, der kan udføres med kun 3.000 DCs/godt. Vi har foretaget andre funktion undersøgelser med disse celler, herunder hormonelle lydhørhed, cytokin og antimikrobielle peptid produktion ved HIV-stimulation og HIV-opsamling af FRT DCs13. Når DCs er isoleret og forgyldt, skal assays udføres inden for 24 timer, som cellernes levedygtighed aftager efter dette tidspunkt.
Denne protokol kan tilpasses til at isolere forskellige DC delgrupper, eller andre celletyper ved at vælge de rigtige markører koblet til den magnetiske perler og kombinere sekventielle positive og negative perle udvalg til at fjerne uønskede celletyper. En forsigtig, selv, er, at med hver runde af valg nogle procentdel af celler vil være tabt, så til isolering af FRT DCs, som allerede er sjældne, og væv størrelsen er generelt små, flere runder af udvalg med forskellige markører (og nødvendige vasker forbundet) er ikke ønskeligt. Denne protokol kan desuden tilpasses for at isolere andre immunceller eller DCs fra andre væv14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Støttet af NIH stipendier AI102838 og AI117739 (CRW). Vi takker Richard Rossoll for teknisk bistand. Flow cytometric analyse blev udført i DartLab, den delte ressource på Dartmouthsupported af (P30CA023108-37) og (P30GM103415-15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
