Summary
Här beskriver vi en metod för att isolera och rena dendritiska celler från olika anatomiska fack i mänskliga kvinnliga fortplantningsorganen för utvärdering av deras fenotypiska och funktionella egenskaper. Denna metod kan anpassas att isolera andra immunceller eller dendritiska celler från andra slemhinnor vävnader.
Abstract
Karakterisering av de mänskliga dendritiska cellerna (DCs) bosatta i slemhinnor vävnader är utmanande på grund av svårigheten att erhålla prover, och det låga antalet DCs närvarande per vävnad. Ändå, eftersom den fenotyp och funktion av DCs ändras genom vävnad miljön, är det nödvändigt att analysera vävnad bofasta DC populationer, eftersom blod kommer DCs ofullständigt speglar komplexiteten i DCs i vävnader. Här presenterar vi ett protokoll för att isolera DCs från mänskliga kvinnliga fortplantningsorganen (FRT) med hysterektomi prover som tillåter både fenotypiska och funktionella analyser. Protokollet består av vävnad matsmältningen att generera en enda cell som blandade cellsuspension, följt av positiv magnetisk pärla urval. Vår vävnad matsmältningen protokoll inte klyva yta markörer, som tillåter fenotypiska och funktionell analys av DCs i steady state, utan övernattning inkubation eller cell aktivering. Detta protokoll kan anpassas för isolering av andra immunceller typer eller isolering av DCs från andra vävnader.
Introduction
FRT har den dubbla funktionen att skydda mot patogener samtidigt implantation och graviditet1. För att åstadkomma detta, är FRT uppdelade, med varje anatomisk region visar unika histologiska, immunologiska och funktionella egenskaper1.
DCs närvarande vid slemhinnorna ta kontakt med mikrober i lungorna, tarmen och könsorganen, och ge immun övervakning för potentiella patogener2. DCs har en unik förmåga att prime naiva T-celler och utlösa adaptiva immunsvaret3. DCs i FRT är också specialiserade för att tolerera främmande antigener, såsom de som finns i spermier och det växande fostret, att tillåta lyckad graviditet4. Därför beroende på platsen, kommer att på DC fenotyp och funktion vara distinkt. Det är känt att DCs påverkas starkt av vävnad miljön, så att deras antal, fenotyp och funktioner modifieras av vävnad miljön där de bor.3. Därför, för att förstå den roll som FRT DCs spela i smittsamma sjukdomar, graviditet och cancer i FRT, bosatt DCs måste studeras, eftersom blod härledda DC-modeller är otillräckliga för att lösa rättsliga komplexiteten i FRT vävnader.
Karakterisering av mänsklig vävnad bosatt DCs är utmanande på grund av det låga antalet celler som finns i slemhinnor vävnader och svårigheten att få mänskliga vävnadsprover. DCs har studerats i den FRT med hjälp av immunohistokemi5,6, som informerar om den cell platsen i vävnaden, men utesluter funktionella studier och är begränsad i antalet identifiera cell markörer som kan analyseras på en gång. Dessutom har enstaka cell isolering protokoll för flöde flödescytometrisk analys varit utvecklade7,8,9. Några av dessa protokoll utnyttja DCs flyttande förmåga att isolera de celler som migrerar. Dessa metoder brukar kräva övernattning inkubationer och urval av aktiverade DCs, men tillåter inte för studier av DCs i steady state.
Här, med hysterektomi prover, vi optimerat ett protokoll för att isolera DCs från olika anatomiska platser i FRT, endometrium (EM), livmoderhalskanalens (CX), och den ectocervix (ECX), som möjliggör både fenotypiska och funktionella analyser. Med en icke-proteolytiska enzymatisk nedbrytning-protokollet, kan vi gå vidare omedelbart efter vävnad matsmältningen att cell isolering och flöde flödescytometrisk karakterisering utan cellaktivering. Med multicolor flödescytometri och anpassa funktionella studier för lågt antal celler, kan vi identifiera och karaktärisera sällsynta delmängder av domänkontrollanter i olika platser för FRT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studier där försökspersoner har genomförts enligt de principer som uttrycks i Helsingforsdeklarationen. Studier var godkända av Dartmouth College institutionella Review Board och kommittén för skydd av mänskliga försökspersoner (CPHS). Skriftligt informerat samtycke erhållits före operation från HIV-negativa kvinnor som genomgår hysterektomi vid Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Libanon, NH). Utbildade patologer valt vävnadsprover från EM, CX och ECX, fri från patologiska lesioner och avlägsna från platserna för patologi. Blodprov erhölls från frivilliga friska donatorer rekryteras vid Dartmouth Hitchcock Medical Center. Blodgivare var anonyma. Nymalen isolerade EM, CX och ECX vävnader från operationssalen överfördes till patologi för isolering och klassificering tidigare att överföra till vårt laboratorium i separat, sterila polypropylene rören.
1. enzymatisk nedbrytning av vävnader
Obs: Använd sterila material och arbeta i biologiska säkerhetsdragskåp.
- Förbereda en modifierad Hank's Balanced Salt lösning (HBSS) med 1 x HBSS med fenolrött, 100 U/mL penicillin-streptomycin, 0,35 g/L NaHCO3och 20 mM HEPES.
- Förbereda den enzymatiska cocktailen (modifierad HBSS, 450 U/mL kollagenas IV, 0,01% [wt/vol] deoxyribonuclease jag och 2 mg/mL D-glukos). Passera ett sterilt 0,22 µm filter lösningen. Idealiskt, förbereda enzymet matsmältningen på dagen för användning, men det kan frysas vid-20 ° C för lagring. Undvik upprepad frysning och upptining cykler.
- Skölj vävnaden med modifierade HBSS och placera det i en 100 x 15 mm2 petriskål. Justera petriskål storlek baserat på mängden vävnad tillgängliga och volymen av enzymet cocktail används (se steg 1.4.2 nedan).
Obs: Vävnader varierar i storlek beroende på kirurgisk provet erhålls från patologi, alltifrån 1-10 g. - Fysisk bearbetning med disponibla skalpell och pincett:
- Tillsätt ungefär 3 mL av matsmältningen enzym cocktail till vävnaden att förhindra torkning medan skära.
- Använd tången för att stabilisera vävnaden och färs med en skalpell att öka ytan av vävnaden utsätts för enzymet matsmältningen cocktail. Skär vävnaden i små bitar (< 2 mm på en sida). Lägg till tillräcklig matsmältningen enzym cocktail för att täcka alla vävnad bitar (5 mL/g vävnad). Placera locket på petriskål.
- Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 på en rotator på cirka 80 rpm för 45 min. se till att rotatorkuffen hastigheten grundligt blandar matsmältningen enzym cocktail utan att spilla eller producera bubblor.
- Visualisera vävnad preparationen med ett inverterat ljusmikroskop med 4 X och 10 X mål.
Obs: Efter matsmältningen, små vävnad fragment och en blandad cellsuspension inklusive synliga epithelial körtlar bör vara närvarande (se figur 1A).
2. fysisk Separation av enstaka celler
- I en steril miljö, placera en spänd 250 µm mesh med hållare i en 150 x 15 mm2 petriskål. Se till att maskorna är ca 0,5 cm ovanför ytan av petriskål.
- Blöt maskor med 2 mL modifierade HBSS och överföra smält vävnaden på mesh.
- Med hjälp av den plana ytan av en 10 mL kolv, försiktigt men bestämt, slipa smält malet vävnaden genom maskan.
Försiktighet: Slipning för aggressivt kommer skada mesh och öka cellen dödlighet. Detta steg kommer att separera epitelceller och stromaceller (inklusive immunceller) från bindväv och slem. - När vävnad fragment har varit grundligt spridda, lyfta maskor och innehavaren 2-3 cm ovanför petriskål och sköljning med 3 mL modified HBSS återställa ytterligare celler.
- Samla cellsuspension. Placera 20 µm mesh med hållare i en petriskål och våt med 2 mL modifierade HBSS. Häll cellsuspensionen genom mesh håller maskorna 2-3 cm ovanför petriskål och skölj med 6 mL av modifierade HBSS.
Obs: Detta steg kommer separata epitelial arken, som bevaras på toppen, från enstaka celler som passerar genom maskan. Genomströmmande är en blandad cellsuspension, som innehåller immunceller och stromal fibroblaster. - Samla in blandade cellsuspension och centrifugera vid 500 x g i 10 min. Aspirera vätska och återsuspendera pelleten i 4 mL modifierade HBSS för täthet lutning centrifugering.
- Layer blandade cellsuspensionen över 3 mL polysucrose lösning och centrifugera vid rumstemperatur vid 500 x g under 30 minuter med ingen broms. Samla vita bandet från toppen av polysucrose lösningen och tvätta med PBS.
Obs: Denna fraktion är berikad blandad cell fjädringen, som är rik på immunceller och innehåller vissa stromal fibroblaster.
3. döda cellen borttagning
Obs: Om en stor andel av döda celler (> 20%) finns i berikade blandade cellsuspensionen efter densitet gradient centrifugering, döda cellen borttagning med magnetiska pärlor rekommenderas. Döda celler måste tas bort eftersom de kan störa positiv magnetisk pärla urvalsprocessen.
- Räkna cellerna med en hemocytometer på ett ljusmikroskop med målsättningen 10 X. Snurra ner alla celler i berikade blandade cellsuspensionen (500 x g, 10 min, 4 ° C). Helt aspirera och kasta bort supernatanten. Tillsätt 100 µL av döda cellen borttagning pärlor per 1 x 107 totala celler (levande och döda), enligt tillverkarens instruktioner. Odla i rumstemperatur i 15 min.
- Placera ett 30 µm filter på kolumnen magnetiska, applicera cellsuspensionen och låt pärla-märkt cellerna att falla genom kolumnen magnetiska.
- Skölj kolonnen med döda cellen borttagning buffert som rekommenderade (3 mL). Samla den genomströmmande som innehåller levande celler. Spänna av cell återhämtning efter döda cellen borttagning presenteras i figur 1B.
Obs: Dessa celler kan användas för att utföra flödescytometri färgning för fenotypiska studier (avsnitt 5) eller fortsätta med DC isolering (avsnitt 4).
4. DC rening av positiv magnetisk pärla urval
- Efter att döda cellen (steg 3,2), snurra cellerna ner, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 80 µL magnetiska urval buffert per 1 x 107 celler (PBS, 0,5% Värmeinaktiverade AB humanserum (HS), 2 mM EDTA).
- För positiva urval av DC populationer, lägga till CD1a eller CD14 magnetiska pärlor enligt tillverkarens anvisningar (20 µL magnetiska pärlor per 1 x 107 celler). Inkubera i 15 minuter vid 4° C.
- Tvätta cellerna med magnetiska urval bufferten, snurra ner och ta bort buffert helt. Att resuspendera cellerna i ett minimum av 500 µL av magnetiska urval buffert.
- Bifoga kolumnen att magneten och lägga till 30 µm filter på toppen av kolumnen att behålla alla återstående cell klumpar. Skölj filtret och kolumn med magnetiska urval buffert som rekommenderas.
- Tillämpa cellsuspensionen till kolumnen. Skölj 3 gånger med magnetiska urval buffert.
- Flytta kolumnen till en 15-mL tub, tillsätt 5 mL av magnetiska urval buffert och tillämpa kolven för att släppa de markerade cellerna i kolumnen.
- För att öka renhet, upprepa steg 4,4-4,6 med återvunna celler med hjälp av en ny kolumn. Spänna av cell återhämtning efter magnetiska pärla urval presenteras i figur 1 c.
5. bedömning av Cell renhet: Flow flödescytometri och mikroskopi
- Antikropp färgning för flödescytometri:
- Återsuspendera upp till 1 x 106 celler i 100 µL av PBS som innehåller 20% Värmeinaktiverade HS att blockera Fc receptorer och inkubera i 10 min på is.
- Lägg till önskad fluorescently märkt antikroppar och reagens för identifiering av döda celler (för ett exempel, se avsnitt 6.5). Ställ in fluorescens minus en (FMO) kontroller att inrätta grindarna och använda kompensation pärlor för att förbereda enda fläcken kontroller för ersättning. Exempel på antikroppar används ges i tabell 1. Inkubera i 20 minuter vid 4 ° C, skyddas från ljus.
- Tvätta cellerna med 2 mL av magnetiska urval buffert.
Obs: Närvaro av EDTA är viktigt att undvika bildandet av cell klumpar för flöde flödescytometrisk analys. Snurra ner och kasta bort supernatanten. - Fixa cellerna genom att lägga till 100 µL av 2% PARAFORMALDEHYD lösning per rör.
- Analysera proverna i genom ett flöde cytometer10,11.
- Spin kolumnen (t.ex., cytospin) och använda Giemsa färgning för att analysera morfologi:
- Att resuspendera cellerna i 200 µL av magnetiska urval buffert.
- Fyll i en spin kolumn och spin för 5 min. Låt bilden torka helt.
- Fixa bilden genom nedsänkning i 100% metanol för 2 min. Skölj bilden med avjoniserat vatten och låt den torka.
- Utföra en standard Wrights-Giemsa färgning. Täcka cellerna med Eosin och inkubera i 10 min, skölj med avjoniserat vatten och låt det torka. Täcka cellerna med Wrights-Geimsa fläcken, inkubera i 1 min, skölj med avjoniserat vatten och lufttorka.
- Undersöka förberedelserna med ett inverterat Mikroskop (figur 2A, 40 X-objektiv).
6. allogen stimulering Assay att bedöma DC Cell-funktion
- Tina de frysta perifera mononukleära blodcellerna (PBMC)
- Värma cell kultur media med 10% HS till 37 ° C.
- Tina PBMC genom att placera cryotube i 37 ° C vattenbad, tills en liten mängd frysta cell media förblir i cryotube. I en steril miljö, överför innehållet i cryotube 10 ml av pre värmde cell kultur media med 10% HS i en 15mL tub.
- Centrifugera vid ~ 500 x g för 7 min. ta bort materialet, skingra pelleten, Återsuspendera PBMC i 10 mL av cell kultur media med 10% HS och centrifugera cellerna.
- Upprepa tvättningen en tredje gång. Räkna cellerna.
- Naïve T-cell urval:
- Använda ett negativt urval magnetiska antikropp cellen urval kit för att isolera naiva T-celler enligt tillverkarens protokollet.
- Efter isolering, kontrollera renhet med CD45RA och CCR7 antikroppar.
Obs: Typiska renheten är > 99% naiva T-celler.
- Naïve T-cell spridning färgämnet färgning:
- Förbereda 600 µL av 2 x lösning av cell spridning dye, skyddar färgen från exponering för ljus.
- Tvätta naivt T-celler 2 x med PBS. Att resuspendera cellerna i 500 µL PBS.
- Cellerna i biosäkerhet skåp, lägga till 500 µL av spridning färgämne i naivt T-celler medan försiktigt vortexa.
- Inkubera cellerna under 10 minuter vid 37° C.
- Stoppa cell märkningen genom att tillsätta 5 mL cell kultur media med 10% HS till cellerna. Inkubera i ice för 5 min, skyddas från ljus.
- Centrifugera cellerna på ~ 500 x g för 7 min, aspirera media och resuspendera cellerna i 4 ° C cell kultur medier med 10% HS. Upprepa två gånger för totalt 3 tvättar. Ta en alikvot av celler att räkna innan den sista centrifugeringen.
Obs:, Slutliga naiva T-cell nummer kommer varierar vanligtvis mellan 5% och 15% av det ursprungliga PBMC celltalet. - Att resuspendera cellerna med cell kultur media med 10% HS i önskad cell koncentration.
- DC-allogen naiva T-cell samarbete kultur:
- Tavla den isolerade DCs och naiva T-celler i en 96 brunnar, runda-botten plattan, en 1:15 förhållandet av DCs till T-celler. Se till att den optimala nummer för DCs varierar mellan 3 000 och 5 000 celler per brunn.
- Centrifugera plattan på ~ 500 x g i 3 min att säkerställa cellerna är belägna i mitten av brunnen. Cell till cell kontakt är viktigt för korrekt signalering ska ske.
- Inkubera vid 37 ° C i 6 dagar. Övervaka kluster av celler som visas i brunnarna som spridning sker, med mikroskopi (figur 3A).
- Flödescytometri färgning för att bedöma spridning:
- Efter 6 dagar, kan celler undersökas av flödescytometri. Fläcken samtidig kulturen för flödescytometri.
- Bered en 2 x gul livskraft färgämne (maximala utsläpp 572 nm) i PBS.
Obs: Användningen av PBS utan serum är viktigt, som serum proteiner stör färgämnet). - Centrifugera plattan med celler på ~ 500 x g i 5 min.
- Ta bort 100 µL av supernatanten.
Obs: vid denna punkt samla in och lagra supernatanten för separat analys av lösliga faktorer. - Tvätta cellerna två gånger med PBS: Tillsätt 150 µL per brunn PBS, Centrifugera vid ~ 500 x g i 5 min, ta bort 150 µL av supernatanten med en pipett. Se till att det finns 50 μl av supernatanten kvar i varje brunn.
- Tillsätt 50 μl av 2 x livskraft färgämne till varje brunn. Odla i rumstemperatur i 10 min, skyddas från ljus.
- Under inkubationstiden, förbereda en master blandning av önskad antikropp markörer. Till exempel: CD3 APC/Cy7, CD4 PE, CD8 FITC, m.m.
- Tillsätt blandningen antikroppar till varje brunn. Odla i rumstemperatur i 10 min, skyddas från ljus.
- Tvätta cellerna 2 x med PBS + 2% HS: Tillsätt 150 µL per brunn PBS + 2% HS. Centrifugera vid ~ 500 x g för 5 min. ta bort 150 µL av supernatanten med en pipett.
- Fixa cellerna genom att tillsätta 100 μl/brunn 2% para-formaldehyd. Om det behövs: överföra celler och media till polypropylen flöde flödescytometri rör. Rören kan hållas vid 4 ° C samt skyddas från ljus, tills flödet flödescytometrisk analys.
- Läs rören i en flödescytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Följande vävnad matsmältningen, frisläppandet av epitelial lakan och körtlar kan observeras, som visas i figur 1A; Detta är en positiv kontroll som anger enzymatisk nedbrytning lyckades. Antalet totala viabla celler och DCs återvinnas per gram vävnad visas också i figur 1B och figur 1 c, respektive. Immunceller utgör mellan 5-30% av stromaceller före densitet centrifugering12,13. Figur 2 visar morfologi (figur 2A) och renhet (figur 2B, C) av de isolerade DCs. När två omgångar av markeringen utförs som anges i protokollet, varierar förväntade renhet mellan 85-92% (figur 2 c). Antal återskapade celler är variabel och beror på inledande vävnad storlek och givare variabiliteten. Karakterisering av isolerade celler har beskrivits13. Figur 3 visar en representativ allogen stimulering analysen att bedöma DC funktionalitet. Figur 3A visar de karakteristiska T-cell klumpar som visas när spridningen sker och figur 3B visar spridning kvantifiering av flödescytometri. Andra funktionella analyser, såsom viral fångst eller cytokin och chemokine produktion kan också vara utförda13. Figur 4 visar den portande strategin för att identifiera olika DCs populationer i de distinkta FRT anatomiska fack efter flöde-flödescytometrisk analys av berikade blandade cellsuspensioner (figur 4A). Titrering av antikroppar och negativa kontroller är viktiga, eftersom DCs och makrofager visar hög autofluorescens. FMO kontroller visas i figur 4B. Figur 4 c visar exempel på hur att identifiera enskilda DC undergrupper, till exempel CD1c +, CD207 + eller CD103 + DCs.
Figur 1: vävnad behandling och cell tillgänglighet. (A) representativ bild av epitelial ark och körtlar som släppts efter vävnad matsmältningen. (B) utbud av totala antalet livskraftiga celler återhämtade sig efter vävnad behandling och döda cellen borttagning i varje FRT fack: endometrium (EM), livmoderhalskanalens (CX) och ectocervix (ECX). Varje prick representerar celler från ett annat ämne. (C) nummer av DCs återhämtade sig per gram vävnad efter magnetiska pärla isolering. B och C är anpassade från13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: morfologi och renhet av isolerade celler. (A) dendritiska morfologi av isolerade celler bestäms av mikroskopi efter Giemsa färgning. (B) uttrycket av fenotypiska markörer före och efter pärla isolering, som bestäms av flödescytometri. (C) representativa renhet erhålls efter CD1a + och CD14 + pärla isolering. Anpassad från13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Proliferation assay. (A) representativa mikroskopi bilder av T-cell kluster bildas under spridning: fas-kontrast (vänster), proliferation färga färgning (mitten) och overlay (höger). (B) representativt exempel induktion av spridning efter samtidig kultur av isolerade livmodercancer CD1a + eller CD14 + DCs och allogen naiva T-celler som erhållits från frysta PBMC. B är anpassade från13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: fenotypiska karakteriseringen av DCs i den berikade blandat cellsuspensioner från FRT. (A) Gating strategi för identifiering av DCs i blandade cellsuspension. Varje gated befolkningen i multicolor tomter visas i nästa panel. Contour tomter Visa CD11c + CD11b + och CD11c + CD11b-grindar, respektive. Markörer för att identifierar oönskade celler kan färgas med samma kanal för att utesluta dem från analysen; till exempel döda celler, CD3 + och CD19 +-celler. (B), FMO kontroller för att fastställa lämpliga portar. (C) diskriminering av DC undergrupper efter Usenets strategin. Contour tomter valdes i stället för multicolor tomter att mer korrekt representera Befolkningfördelningen när de cell nummer var låg10. Låg cell nummer förväntas i slutet av den portande strategin, eftersom vävnad DCs är sällsynta populationer. Anpassad från13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Cell markör | Fluorokrom | Klon | Koncentration | Mängden antikroppar per prov |
| (i 100 µl buffert) | ||||
| CD45 | vioblue450 | HI30 | 1,0 µg/5 µl | 0,4 µg |
| CD11b | PE | ICRF44 | 1,0 µg/5 µl | 0,4 µg |
| CD11c | PerCp/Cy5.5 | Bu15 | 200 µg/ml | 0,4 µg |
| CCR5 | PE-Cy7 | 2D 7 | 0,25 µg/5 µl | 0,1 µg |
| CCR7 | PE-Cy7 | REA108 | 99 µg/ml | 0,2 µg |
| HLA-DR | BV-570 | L243 | 100 µg/ml | 0,2 µg |
| HLA-DR | FITC | AC122 | 82,5 µg/ml | 0,16 µg |
| CD3 | APC | UCHT1 | 16 µg/ml | 0.03 µg |
| CD3 | viogreen | REA614 | 137 µg/ml | 0,27 µg |
| CD163 | APC | GHI/61 | 80 µg/ml | 0,16 µg |
| CD207 | APC | 1OE2 | 200 µg/ml | 0,4 µg |
| CD1a | FITC | HI149 | 0,5 µg/5 µl | 0,2 µg |
| CD1a | AF-700 | HI149 | 0,5 mg/ml | 1,0 µg |
| CD103 | PE-Cy7 | B-Ly7 | 0,25 µg/5 µl | 0,1 µg |
| CD83 | PE | HB15e | 0,25 µg/5 µl | 0,1 µg |
| CD14 | APC-brand | 63D 3 | 400 µg/ml | 0,8 µg |
| CD209 | FITC, PE, APC | 120507 | 1,25 µg/0,25 ml | 0.01 µg |
| Zombie gul livskraft färgämne | ||||
| 7AAD | 0,1 mg/ml | 0.2ug |
Tabell 1: Exempel på antikroppar för karakterisering av DCs i FRT av flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Slemhinnor DCs är en ovanlig cell befolkningen starkt influerad av vävnad miljö, som ändrar sin fenotyp och funktion när de anger de vävnader3. Medan blod kommer DCs är en mycket användbar modell, de representerar inte fullt mångfalden av DC populationer finns i vävnader. Därför, för att förstå de unika egenskaperna hos slemhinnor DCs, isolering av primära celler från vävnader är nödvändigt. Isolering av DCs från olika anatomiska platser i FRT erbjuder möjlighet att studera DC funktion in vitro- och jämför mellan DC underdelar och anatomiska lokalisationerna.
Här tillhandahåller vi ett protokoll som tillåter rening av DCs från mänskliga FRT vävnader för in vitro- bedömning av funktionella egenskaper. Eftersom DCs finns på slemhinnor platser i låga siffror, utvecklade vi ett protokoll för att berika vävnad cell utarbetandet av täthet lutning centrifugering och döda cellen borttagning före cell isolering med magnetiska pärlor. Korrekt avlägsnande av döda celler är nyckeln, som de kommer att störa pärla isolering. Denna teknik ger hög renhet av positivt isolerade celler (≈ 90%), i en relativt kort tid (4-6 h) och utan behov av övernattning inkubation, in vitro- cellkultur eller migration före isolering, som kan aktivera DCs och förändra deras fenotypiska egenskaper. Våra protokoll utlöser inte cellaktivering, mätt som bristen på Uppregleringen av mognad markörer (CD86, HLA-DR, CD83)13. En annan fördel är användningen av en icke-proteolytiska enzymatisk nedbrytning, som inte klyva yta markörer och möjliggör omedelbar cell isolering eller fenotypiska analys efter vävnad matsmältningen14.
Kritiska till detta protokoll är generation av en enda cellsuspension att undvika en blockering av den magnetiska kolumner. För att säkerställa detta, döda celler måste avlägsnas före magnetiska cellmarkeringen, filter behöver användas ovanpå magnetiska kolumnerna, och vävnader större än 3 g bör delas mellan två kolumner. Användning av en andra kolumn efter först omgången av rening är nyckeln till hög cell renhet.
En begränsning med metoden isolering är inneboende låg antalet DCs i FRT vävnader, som vanligtvis inte tillåter för bra cell återvinning av vävnader mindre än 1 g. Under dessa omständigheter, dock kan fenotypiska analyser fortfarande utföras med den berikade blandat cellsuspension. Detta är möjligt på grund av den icke-proteolytiska matsmältning metod som används, vilket inte klyva yta markörer och gör för omedelbar analys av cell fenotyp efter vävnad matsmältningen14. Dessutom, kan den patientens åldern vara en faktor som påverkar antalet celler som återvinns.
Användning av detta protokoll, har vi tidigare visat att CD1a + isolering ger en fenotypiskt mer homogen befolkning än CD14 + urval13; CD1a + DCs är dock svårt att återhämta sig från CX och ECX. Medan CD14 kan också uttryckas på makrofager, fann vi att den FRT CD14 + isolerad population är rik på DCs, baserat på samtidig uttryck av DC-markörer och deras förmåga att stimulera allogen naiva T-celler, som är en kontrollstämpel funktion av DCs13.
Eftersom antalet DCs återvinns är generellt låg (< 100 000 totala celler), funktionella studier behöver optimeras för låga cell nummer. Här visar vi optimering av en allogen stimulering-test, som kan utföras med bara 3,000 DCs per brunn. Vi har utfört efter andra funktion studier med dessa celler, inklusive hormonella lyhördhet, cytokin och antimikrobiella peptid produktion vid HIV-stimulering och HIV-capture av FRT DCs13. När DCs har isolerats och förkromad, bör analyser utföras inom 24 h, eftersom cellernas viabilitet minskar efter den tiden.
Detta protokoll kan anpassas att isolera olika DC undergrupper, eller andra celltyper genom att välja korrekt markörer kopplade till magnetiska pärlor och kombinera sekventiell positiva och negativa pärla urval att ta bort oönskade celltyper. En försiktighet, är dock att med varje omgång urval några procent av cellerna försvinner, så för isolering av FRT DCs, som redan är sällsynta, och vävnad storleken är generellt små, flera rundor av urval med olika markörer (och nödvändiga tvättar associerade) är inte önskvärda. Detta protokoll kan dessutom anpassas för att isolera andra immunceller eller DCs från andra vävnader14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Studie som stöds av NIH grants AI102838 och AI117739 (CRW). Vi tackar Richard Rossoll för tekniskt bistånd. Flöde flödescytometrisk analys genomfördes i DartLab, den delade resursen på Dartmouthsupported av (P30CA023108-37) och (P30GM103415-15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
