Summary
Biz burada yalıtmak ve phenotypical ve fonksiyonel özellikleri değerlendirilmesi için insan kadın üreme sistemi içinde farklı anatomik bölmeleri dendritik hücrelerden arındırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem diğer bağışıklık hücreleri veya diğer Mukozal doku dendritik hücrelerden yalıtmak için adapte edilebilir.
Abstract
İnsan dendritik hücreler (DC) içinde Mukozal doku ikamet karakterizasyonu örnekleri alınırken zorluk nedeniyle zordur ve DCs az sayıda doku mevcut. Fenotip ve DCs işlevinin değiştirilmiş doku çevre tarafından henüz, doku ikamet DC nüfus analiz etmek, kan DCs eksik olarak elde edilen bu yana DCs karmaşıklığı dokularda yansıtmak için gerekli olduğu. Burada phenotypical ve fonksiyonel analiz sağlayan histerektomi örnekler kullanarak insan kadın üreme yolu (FRT) DCs yalıtmak için bir iletişim kuralı mevcut. Tek bir hücre hücre süspansiyon, pozitif manyetik boncuk seçime göre takip karışık üretmek için doku sindirim protokol oluşur. Bizim doku sindirim Protokolü phenotypical ve fonksiyonel analizde DC'lerin gecede kuluçka veya hücre etkinleştirme olmadan kararlı duruma sağlayan yüzey işaretleyicileri, ayırmak değil. Bu iletişim kuralı yalıtım diğer bağışıklık hücre tiplerinin veya diğer dokularda DC'lerin izolasyon için adapte edilebilir.
Introduction
FRT implantasyon ve gebelik1izin verirken patojenlere karşı korumanın çift işlevi vardır. Bunu yapmak için FRT, görünen benzersiz histolojik, immünolojik ve fonksiyonel özellikleri1her anatomik bölge ile bölümlere.
DCs Mukozal yüzeyler mevcut mikroplar akciğer, gut ve genital sistem ile ulaşın ve olası patojenler2için immün gözetim sağlayın olun. DCs saf T-hücreleri Başbakan ve adaptif bağışıklık yanıtı3tetiklemek için benzersiz yeteneği var. DCs FRT içinde de sperm ve başarılı gebelik4izin vermek için gelişmekte olan fetus bulunanlar gibi yabancı antijenleri tolere uzmanlaşmıştır. Bu nedenle, DC fenotip ve işlev konumuna bağlı olarak farklı olacaktır. Öyle ki onların numarası, fenotip ve işlevleri3bulundukları doku çevre tarafından değiştirilir DCs şiddetle doku çevre tarafından etkilenmiştir bilinir. Bu nedenle, bulaşıcı hastalıklar, gebelik ve FRT Kanserinde FRT DCs oynadığı rol, ikamet DCs türetilmiş DC modelleri FRT dokularda bulunan düzenleyici karmaşıklığı gidermek yetersiz kan beri incelenecektir anlamalısın.
İnsan dokusu karakterizasyonu ikamet DCs zorlu hücre içinde Mukozal doku mevcut düşük sayı ve insan doku örnekleri alınırken zorluk nedeniyle. DCs kullanarak doku içinde hücre konumu hakkında bilgilendirir ama fonksiyonel çalışmalar önler ve analiz edilebilir hücre işaretleyicileri tanımlama sayısı sınırlı immünhistokimya5,6, FRT incelenmiştir hemen. Ayrıca, tek hücre izolasyon protokolleri akış sitometrik analizi için gelişmiş7,8,9olmuştur. Bu protokollerin bazıları, geçiş hücreleri izole etmek için DCs göçmen kapasitesi avantajlarından yararlanın. Bu yöntemler genellikle gece incubations ve aktif DCs yelpazesi gerektirir ancak DCs çalışmada kararlı duruma için izin vermez.
Burada, histerektomi örnekler kullanarak, biz optimize DCs FRT, endometrium (EM), farklı anatomik sitelerden yalıtmak için bir protokol endocerviks (CX) ve ectocervix (ECX), phenotypical ve fonksiyonel analiz sağlar. Proteolitik Enzimatik sindirim protokolünü kullanarak, biz hemen sonra doku sindirim olmadan hücre aktivasyonu hücre izolasyon ve akım sitometrik karakterizasyonu için devam edebilirsiniz. Çok renkli Akış Sitometresi kullanarak ve fonksiyonel çalışmalar hücre düşük numaraları için adapte, biz tanımlamak ve DCs FRT. farklı sitelerdeki nadir kümelerine karakterize
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan denekler içeren çalışmalar Helsinki Bildirgesi içinde ifade edilen ilkelere göre yapılmıştır. Çalışmalar Dartmouth kolej Kurumsal değerlendirme Komitesi ve komite için koruma, insan denekler (CPHS) tarafından kabul edildi. Yazılı Onam hysterectomies Dartmouth Hitchcock Tıp Merkezi (Lübnan, NH) geçiren HIV-negatif kadın ameliyattan önce elde edildi. Eğitimli patologlar EM, CX ve ECX, patolojik lezyonlar içermez ve patoloji sitelerden uzak doku örnekleri seçilir. Kan örnekleri Dartmouth Hitchcock Tıp Merkezi işe gönüllü sağlıklı bağışçılardan elde edilmiştir. Kan Bağış anonim. Ameliyathane taze izole EM, CX ve ECX dokulardan patoloji yalıtım ve sınıflandırma önceki bizim laboratuvar ayrı, steril polipropilen borular içinde transfer etmek için transfer.
1. Enzimatik sindirim dokuların
Not: biyolojik Emanet dolabı iş ve steril malzemeler kullanabilirsiniz.
- Değiştirilmiş bir Hank'in dengeli tuz çözüm (1 x HBSS fenol red, 100 U/mL penisilin-streptomisin, 0.35 g/L NaHCO3ve 20 mM HEPES ile kullanarak HBSS) hazırlayın.
- Enzimatik kokteyl hazırlamak (değiştirilmiş HBSS, 450 U/mL collagenase IV, %0.01 [wt/vol] deoksiribonükleaz ben ve 2 mg/mL D-glikoz). Çözüm bir steril 0,22 µm filtreden geçmek. İdeal olarak, sindirim enzim kullanımı gününde hazırlamak, ancak depolama için-20 ° C'de dondurulmuş olması. Tekrarlanan dondurma ve çözme döngüleri kaçının.
- Değiştirilmiş HBSS ve 100 x 15 mm2 Petri kabına yerde dokuyla durulayın. Doku mevcut miktarına göre Petri kabına boyutu ve kullanılan enzim kokteyl hacmi ayarlayın (bkz. Adım 1.4.2 aşağıda).
Not: Dokulara bağlı olarak 1-10 g arasında değişen patoloji, elde edilen cerrahi örnek boyutu değişir. - Fiziksel işlem tek kullanımlık neşter ve Forseps ile:
- Sindirim enzim kokteyl yaklaşık 3 mL kesme iken kurutma önlemek için doku ekleyin.
- Forseps doku stabilize etmek ve sindirim enzim kokteyl maruz doku yüzey alanını artırmak için bir neşter ile bin dereden su getirmek için kullanın. Doku küçük parçalara (< 2 mm bir tarafta) kes. Tüm doku parçaları (5 mL/g doku) karşılamak için yeterli sindirim enzim kokteyl ekleyin. Kapağı üzerinde Petri kabına yerleştirin.
- %5 CO2 yaklaşık 80 rpm 45 dk. rotator hız iyice sindirim enzim kokteyl dökülmesini veya baloncuklar üreten olmadan karışımları olduğunu sağlamak için bir rotator 37 ° C'de kuluçkaya.
- Doku hazırlık ile ters bir ışık mikroskobu ile 4 X ve 10 X hedefleri görselleştirin.
Not: sindirim sonra küçük doku parçaları ve bir karma hücre süspansiyon görünür epitel bezleri de dahil olmak üzere mevcut olmalıdır ( şekil 1A' ya bakınız).
2. fiziksel ayırma tek hücre
- Steril bir ortamda, gergin 250 µm mesh sahibi ile 150 x 15 mm2 Petri kabına yerleştirin. Mesh yaklaşık 0.5 cm Petri kabına yüzeyi üzerinde olduğundan emin olun.
- Mesh ile değiştirilmiş HBSS 2 mL ıslak ve sindirilmiş doku mesh üzerine aktarın.
- 10 mL şırınga dalgıç düz yüzeyini kullanarak, nazikçe ama sıkıca, sindirilmiş kıyılmış doku mesh ile eziyet.
Dikkat: çok agresif taşlama, mesh zarar ve hücre ölüm artırmak. Bu adımı epitel hücreleri ve stromal hücreler (bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere) bağ dokusu ve mukus ayrı. - Doku parçaları iyice dağınık sonra mesh ve tutucu yükseltmesine 2-3 cm yukarıda Petri kabına ve durulama 3 mL ile değiştirilen ek hücreleri kurtarmak için HBSS.
- Hücre süspansiyon toplamak. 20 µm mesh sahibi ile bir Petri kabına ve ıslak değiştirilmiş HBSS 2 mL ile yerleştirin. Hücre süspansiyon tutan mesh mesh dökün 2-3 cm yukarıda Petri kabına ve durulama ile değiştirilmiş HBSS 6 mL.
Not: Bu adımı kafes geçmek tek hücrelerden üst korunur epitel sayfaları ayrı olacak. Akış yoluyla bağışıklık hücreleri ve stromal fibroblastlar içeren bir karma hücre askıya alınmasıdır. - Karma hücre süspansiyon ve 10 dk. aspiratı sıvı 500 x g, santrifüj toplamak ve Pelet yoğunluk gradient Santrifüjü için değiştirilmiş HBSS 4 ml resuspend.
- Karma hücre süspansiyon üzerinde 3 mL polysucrose çözüm ve 30 dk için 500 x g de oda sıcaklığında santrifüj fren yok ile katman. Beyaz bant polysucrose çözüm tepesinden toplamak ve PBS ile yıkayın.
Not: Bu kesir bağışıklık hücreleri zengindir ve bazı stromal fibroblastlar içeren zenginleştirilmiş karma hücre askıya alınmasıdır.
3. ölü hücre kaldırma
Not: ölü hücreleri (> %20) büyük bir yüzdesi yoğunluk gradient Santrifüjü sonra zenginleştirilmiş karma hücre süspansiyon varsa, manyetik boncuklar ile ölü hücre kaldırma önerilir. Ölü hücreleri olumlu manyetik boncuk seçim süreci ile girişime neden olabilir beri kaldırılması gerekir.
- Bir hemasitometre 10 X amacı ile hafif bir mikroskop kullanarak hücreleri saymak. Spin aşağı zenginleştirilmiş karma hücre süspansiyon (500 x g, 10 min, 4 ° C) tüm hücrelerde. Tamamen Aspire edin ve süpernatant atın. Ölü hücre kaldırma boncuk başına 1 x 107 toplam hücreleri (canlı ve ölü), üreticinin yönergelerine göre 100 µL ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- 30 µm filtre manyetik sütunun üstüne yerleştirin, hücre süspansiyon uygulamak ve manyetik sütunu boyunca düşmeye boncuk etiketli hücreleri sağlar.
- Ölü hücre kaldırma arabellek sütununda önerilen (3 mL) yıkayın. Canlı hücreleri içeren aracılığıyla akış-toplamak. Ölü hücre çıkarıldıktan sonra hücre Kurtarma aralığı şekil 1Badımında sunulur.
Not: Bu hücreler phenotypical çalışmalar (Bölüm 5) Boyama Akış Sitometresi gerçekleştirmek için kullanılabilir veya DC yalıtım (Bölüm 4) ile devam edin.
4. DC arıtma olumlu manyetik boncuk seçime göre
- Ölü hücre kaldırma (Adım 3.2), spin hücreleri aşağı, süpernatant kaldırmak ve 1 x 107 hücreleri (PBS, % 0.5 ısı inaktive insan AB serumu (HS), 2 mM EDTA) başına 80 µL manyetik seçimi arabellek hücre Pelet resuspend.
- DC nüfus pozitif seçim için üreticinin yönergelerini (20 µL manyetik boncuklar başına 1 x 107 hücreleri) göre CD1a veya CD14 manyetik boncuklar ekleyin. 4° c de 15 dakika kuluçkaya
- Manyetik seçimi arabellek hücrelerle yıkama, spin aşağı ve arabellek tamamen kaldırın. En az 500 µL manyetik seçimi arabelleği hücrelerde resuspend.
- Mıknatıs için sütun ekleyin ve 30 µm filtre üst kısmında kalan herhangi bir hücre kümeleri korumak için sütun ekleyin. Filtre ve sütun olarak tavsiye manyetik seçimi arabelleği ile yıkayın.
- Hücre süspansiyon sütun için geçerlidir. 3 kez manyetik seçimi arabellek ile yıkayın.
- Sütun bir 15 mL tüp transfer manyetik seçimi arabellek 5 mL ekleyin ve pistonu sütun Seçili hücrelerden serbest bırakmak için geçerlidir.
- Saflık artırmak için yeni bir sütun kullanarak kurtarılan hücrelerle adımları 4.4-4,6 yineleyin. Manyetik boncuk seçimden sonra hücre Kurtarma aralığı şekil 1 ciçinde sunulur.
5. hücre saflık değerlendirilmesi: Akış Sitometresi ve mikroskopi
- Antikor: Akış Sitometresi için boyama
- 1 x 100 µL 106 hücrelerde resuspend % 20 içeren PBS, ısı-Fc reseptörü engellemek ve buz üzerinde 10 min için kuluçkaya HS inaktive olur.
- İstenen fluorescently antikorlar ve ölü hücreleri tanımlanması için reaktif etiketli ekleyin (örneğin, Bölüm 6.5 bakın). Floresans eksi bir (FMO) denetimleri kapıları kurmak ve tek leke denetimleri için tazminat hazırlamak için tazminat boncuk kullanmak için ayarlayın. Antikorların kullanılan örnek Tablo 1' de verilmiştir. Işıktan korunan 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya.
- Manyetik seçimi arabelleğinin 2 mL hücrelerle yıkayın.
Not: EDTA varlığı akış sitometrik çözümlemesi için topaklanma hücre oluşumunu önlemek önemlidir. Spin aşağı ve süpernatant atın. - Hücreleri % 2 paraformaldehyde çözüm tüp başına 100 µL ekleyerek düzeltmek.
- Örneklerinde bir Akış Sitometresi10,11tarafından analiz.
- Sütun (örneğin, cytospin) spin ve Morfoloji analiz etmek için boyama Giemsa kullanın:
- Manyetik seçimi arabelleği 200 µL hücrelerde resuspend.
- Bir spin sütun ve 5 min için spin yük. Tamamen kurumasını slayt izin.
- Slayt Slayt deiyonize su ile %100 metanol 2 dk. durulama için daldırma tarafından tamir ve kuru hava sağlar.
- Bir standart Wrights-Giemsa boyama gerçekleştirmek. Eozin hücrelerle kapak ve 10 dakikadır kuluçkaya, deiyonize su ile yıkayın ve kurumaya bırakın. Wrights Geimsa leke hücrelerle kapak, 1 dk. için kuluçkaya, deiyonize suyla durulayın ve kuru hava.
- Hazırlıklar bir ters mikroskopla (şekil 2A, 40 X hedef) inceleyin.
6. allojeneik stimülasyon tahlil DC hücre işlevi değerlendirmek için
- Dondurulmuş periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) çözme
- Hücre kültür medya % 10 ile sıcak HS ile 37 ° c
- PBMCs kadar donmuş hücre medya az miktarda cryotube içinde kalır 37 ° C su banyosu cryotube koyarak çözülme. Steril bir ortamda 10 mL % 10 ile Önceden ısıtılmış hücre kültür ortamının cryotube içeriğini aktarmak HS 15mL tüp içinde.
- Santrifüj kapasitesi ~ 500 x g 7 dakika süreyle medyayı çıkarın, pelet dağıtmak, PBMCs 10 ml %10 HS ve santrifüj ile hücre kültür ortamının resuspend hücreleri.
- Yıkama adım üçüncü kez tekrarlayın. Hücreleri saymak.
- Saf T-hücre seçimi:
- Bir negatif seçim manyetik antikor hücre seçimi kiti üreticinin protokole göre saf T-hücreleri belirlemek için kullanın.
- Yalıtım sonra CD45RA ve CCR7 antikorları kullanarak saflık denetleyin.
Not: > %99 saf T-hücreleri tipik Saflık derecesi var.
- Saf T-Hücre proliferasyonu boya boyama:
- Hücre çoğalması boya, boya ışığa maruz kalma korumak, 2 x çözümünün 600 µL hazırlayın.
- Saf T-hücreleri 2 yıkama x PBS ile. 500 µL PBS hücrelerde resuspend.
- Yavaşça vortexing Biyogüvenlik kabini, hücrelerde nükleer silahların yayılmasına karşı boya 500 µL saf T-hücreleri ekleyin.
- 37° c de 10 dakika için hücreleri kuluçkaya
- 5 mL % 10 ile hücre kültür medya ekleyerek hücre etiketleme durdurmak hücrelere HS. Işıktan korunan 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.
- Senaryo Özeti santrifüj kapasitesi ~ 500 x g 7 dk, medya Aspire edin ve 4 ° C % 10 ile hücre kültür ortamının hücrelerde resuspend HS. İki kez daha 3 yıkar toplam için yineleyin. Bir aliquot önce son Santrifüjü saymak için hücre al.
Not: Normal olarak, % 5 ve ilk PBMC hücre sayısı % 15 arasında son saf T-hücre sayı aralığı olacaktır. - Hücre kültür medya % 10 ile hücrelerle resuspend istenen hücre konsantrasyonu, HS.
- DC allojeneik saf T hücreli ortak kültür:
- 01: 15'de izole DCs ve saf T-hücreleri bir 96-şey, yuvarlak alt plaka, plaka T-hücreleri DC'lere oranı. DCs aralıkları arasında 3000 ve 5000 hücre/iyi için en uygun numarası sağlamak.
- Plaka santrifüj kapasitesi ~ 500 x g hücreleri iyi merkezinde yer alan olduğundan emin olmak 3 dakika. Hücre hücre iletişim yapılmasına uygun sinyal için önemlidir.
- 37 ° C'de için 6 gün kuluçkaya. Nükleer silahların yayılmasına karşı mikroskobu (şekil 3A) ile gerçekleştiği sırada wells görünür hücreleri, küme izlemek.
- Akış Sitometresi nükleer silahların yayılmasına karşı değerlendirmek için boyama:
- 6 gün sonra hücreleri Akış Sitometresi tarafından incelenebilir. Akış Sitometresi için ortak kültür leke.
- Sarı canlılığı boya PBS (maksimum emisyon 572 nm) 2 x çözeltisi hazırlamak.
Not: PBS kullanmadan serum önemli, serum proteinler boya ile müdahale). - Senaryo Özeti ile plaka santrifüj kapasitesi ~ 500 x g 5 min için.
- 100 µL süpernatant ile kaldırın.
Not: Bu noktada toplamak ve süpernatant çözünür faktörler ayrı analiz için saklayın. - Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın: PBS 150 µL/kuyu eklemek, santrifüj kapasitesi ~ 500 x g 5 min için bir pipet ile süpernatant ile 150 µL kaldırın. Her kuyuya kalan süpernatant ile 50 µL olduğundan emin olun.
- 2 x canlılığı boya 50 µL her şey için ekleyin. Oda sıcaklığında ışıktan korunan 10 min için kuluçkaya.
- Kuluçka sırasında istenen antikor işaretleri ana karışımı hazırlayın. Örneğin: CD3 APC/Cy7, CD4 PE, CD8 FITC, vb
- Her şey için antikor karışımı ekleyin. Oda sıcaklığında ışıktan korunan 10 min için kuluçkaya.
- Hücreler 2 yıkama x PBS + %2 HS: PBS + %2 150 µL/iyi eklemek HS. Santrifüj kapasitesi ~ 500 x g 5 dk. 150 kaldırmak µL süpernatant bir pipet ile için.
- Hücreleri 100 µL/de %2 para-formaldehit ekleyerek düzeltmek. Gerekirse: Polipropilen Akış Sitometresi tüpler için hücreleri ve medya aktarma. Tüpler 4 ° C'de muhafaza ve akış sitometrik çözümlemesi kadar gelen ışık, korumalı.
- Akış Sitometresi tüplerde okunur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A' gösterildiği gibi aşağıdaki doku sindirim, epitel sayfaları ve bezleri serbest bırakılması görülebilir; Enzimatik sindirim başarıyla tamamlandığını belirten pozitif bir denetimdir. DCs doku gram başına kurtarıldı ve toplam hücrelerin sayısını da şekil 1B ve şekil 1 c, sırasıyla gösterilir. Bağışıklık hücreleri stromal hücre yoğunluğu Santrifüjü12,13önce % 5-30 arasında temsil eder. Şekil 2 Morfoloji (şekil 2A) ve saflık (şekil 2B, C) izole DC'lerin gösterir. İki tur seçimi iletişim kuralında belirtilen şekilde gerçekleştirildiğinde, beklenen saflık 85-%92 (şekil 2C) arasında değişmektedir. Kurtarılan hücre sayısı değişkendir ve ilk doku boyutu ve donör çeşitliliğine bağlıdır. İzole hücrelerin karakterizasyonu açıklanan13olmuştur. Şekil 3 DC işlevselliğini değerlendirmek için bir temsilci allojeneik stimülasyon tahlil göstermektedir. Şekil 3A nükleer silahların yayılmasına karşı oluşan ve şekil 3B nükleer silahların yayılmasına karşı miktar Akış Sitometresi tarafından gösterir görünür karakteristik T-Hücre kümeleri gösterir. Viral yakalama veya sitokin ve Kemokin üretimi gibi diğer fonksiyonel deneyleri-ebilmek da var olmak gerçekleştirilen13. Şekil 4 ayrı FRT anatomik bölmeleri farklı DCs nüfus zenginleştirilmiş karma hücre süspansiyonlar (şekil 4A) akış sitometrik analizinde sonra tanımlamak için gating stratejisini gösterir. Titrasyon antikorlar ve negatif denetimlerin önemlidir, DCs ve makrofajlar yüksek autofluorescence görüntü olarak. FMO denetimler şekil 4B' gösterilir. Şekil 4 c CD1c +, CD207 + veya CD103 + DCs gibi belirli alt DC kümeleri tanımlama konusunda örnekler gösterir.
Şekil 1: doku işleme ve hücre kullanılabilirlik. (A)temsilcisi görüntü epitel sayfaları ve doku sindirim sonra yayımlanan bezleri. Hücrelerin toplam sayısı (B) aralığı kurtarıldı sonra doku işleme ve her FRT yerde ölü hücre kaldırma: endometrium (EM), endocerviks (CX) ve ectocervix (ECX). Her nokta farklı bir konu hücreleri temsil eder. (C) numarası DCs doku gram başına manyetik boncuk yalıtım sonra kurtarıldı. B ve C13adapte olmuşlardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: morfoloji ve saflık izole hücre. (A)dendritik Morfoloji Giemsa boyama takip mikroskobu tarafından belirlenen izole hücre. (B) ifade fenotipik işaretlerinin önce ve sonra boncuk yalıtım, Akış Sitometresi tarafından belirlendiği gibi. (C) temsilcisi saflık CD1a + ve CD14 + boncuk yalıtım sonra elde edilen. 13uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil. (A)temsilcisi mikroskobu görüntüleri T-hücre oluşumu yayılması sırasında küme: faz kontrast (solda), nükleer silahların yayılmasına karşı boya boyama (orta) ve (sağda) yerleşimi. (B) temsilcisi örnek indüksiyon co kültürünü sonra yayılması endometrium CD1a + ya da CD14 + DCs izole ve allojeneik saf donmuş PBMCs. B T-hücreleri elde13uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: DCs Phenotypical karakterizasyonu zenginleştirilmiş içinde karışık hücre kullanılamaz hale FRT. (A)DCs kimliği karma hücre süspansiyon için strateji geçişi. Her kapı nüfus çok renkli parsellerde sonraki panelinde gösterilir. Kontur araziler CD11c + CD11b + ve CD11c + CD11b-gates, sırasıyla gösterir. Onları çözümleme dışı bırakmak için aynı kanalı kullanarak istenmeyen hücrelerini tanımlamak işaretleri Boyanabilen; Örneğin, ölü hücreleri, CD3 + ve CD19 + hücreler. (B) FMO uygun gates kurmak için denetim yapar. DC alt kümeleri gating stratejisi aşağıdaki (C) ayrımcılık. Kontur araziler çok renkli araziler yerine hücre sayıları düşük10yaşındayken nüfusunun dağılımı daha doğru bir şekilde temsil etmek üzere seçilmiştir. Doku DCs nadir nüfus olduğu gibi düşük hücre sayıları gating strateji, sonunda bekleniyor. 13uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Hücre işaretçisi | Fluorochrome | Klon | Konsantrasyon | Örnek başına antikor miktarı |
| Arabellek (100 µl) içinde | ||||
| CD45 | vioblue450 | HI30 | 1.0 µg/5µl | 0.4 µg |
| CD11b | PE | ICRF44 | 1.0 µg/5µl | 0.4 µg |
| CD11c | PerCp/Cy5.5 | Bu15 | 200 µg/ml | 0.4 µg |
| CCR5 | PE-Cy7 | 2D 7 | 0,25 µg/5µl | 0.1 µg |
| CCR7 | PE-Cy7 | REA108 | 99 µg/ml | 0.2 µg |
| HLA-DR | BV-570 | L243 | 100 µg/ml | 0.2 µg |
| HLA-DR | FITC | AC122 | 82.5 µg/ml | 0,16 µg |
| CD3 | APC | UCHT1 | 16 µg/ml | 0,03 µg |
| CD3 | viogreen | REA614 | 137 µg/ml | 0,27 µg |
| CD163 | APC | GSS/61 | 80 µg/ml | 0,16 µg |
| CD207 | APC | 1OE2 | 200 µg/ml | 0.4 µg |
| CD1a | FITC | HI149 | 0,5 µg/5µl | 0.2 µg |
| CD1a | AF-700 | HI149 | 0,5 mg/ml | 1.0 µg |
| CD103 | PE-Cy7 | B-Ly7 | 0,25 µg/5µl | 0.1 µg |
| CD83 | PE | HB15e | 0,25 µg/5µl | 0.1 µg |
| CD14 | APC-yangın | 63D 3 | 400 µg/ml | 0.8 µg |
| CD209 | FITC, PE, APC | 120507 | 1,25 µg/0.25 ml | 0,01 µg |
| Zombi sarı canlılığı boya | ||||
| 7AAD | 0.1 mg/ml | 0.2ug |
Tablo 1: Örnek Akış Sitometresi tarafından FRT DCs karakterizasyonu için antikorların.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mukozal DCs şiddetle doku3girdiğinizde hangi onların fenotip ve işlev değişiklikleri doku çevre tarafından etkilenmiş bir nadir hücre nüfus vardır. Kan türetilmiş DCs çok kullanışlı bir model vardır, onlar tamamen dokularda bulunan DC nüfus çeşitliliği temsil etmemektedir. Bu nedenle, Mukozal DCs benzersiz özellikleri anlamak için birincil hücre dokuları yalıtım gereklidir. Yalıtım DC'lerin FRT farklı anatomik sitelerden DC işlevi vitro çalışma ve DC alt kümeleri ve anatomik mekanlar arasında karşılaştırmak için bir fırsat sunuyor.
Burada biz DCs arıtma insan FRT dokuların fonksiyonel özellikleri vitro değerlendirilmesi için üzerinden sağlayan bir protokol sağlar. DCs Mukozal sitelerinde düşük sayılarda bulduğumda doku hücre hazırlık yoğunluk gradient Santrifüjü ve hücre yalıtım manyetik boncuklar ile önce ölü hücre kaldırma zenginleştirmek için bir protokol geliştirdik. Boncuk yalıtım ile müdahale edecek ölü hücreleri doğru kaldırılması, anahtardır. Bu teknik yüksek saflıkta olumlu izole hücre (≈ % 90), zaman (4-6 h) nispeten kısa bir miktarda sağlar ve ezelî belgili tanımlık lüzum gecede kuluçka, vitro hücre kültürü veya yalıtım önce geçiş için her biri-ebilmek harekete geçirmek DCs ve fenotipik özellikleri değiştirin. Bizim iletişim kuralı hücre aktivasyonu, up-yönetmelik olgunlaşma işaretleri (CD86, HLA-DR, CD83)13eksikliği tarafından ölçülen tetiklemez. Diğer bir avantajı hemen hücre izolasyon ve doku sindirim14takip phenotypical analiz için veren ve yüzey işaretleyicileri ayırmak değil bir sigara proteolitik Enzimatik sindirim, kullanmaktır.
Manyetik sütunları tıkanması önlemek için bir tek hücre süspansiyon nesil bu iletişim kuralı için önemlidir. Bunu sağlamak için ölü hücreleri manyetik hücre seçimi, manyetik sütunlar üzerinde kullanılmak üzere filtreler gerek önce kaldırılması ve dokulara 3 g daha büyük iki sütun arasında bölünmüş olmalıdır. İlk turda arıtma sonra ikinci bir sütun anahtar yüksek hücre saflık için kullanmaktır.
Yalıtım yönteminin bir sınırlama genellikle dokuların iyi hücre kurtarma için 1 g küçük izin vermeyen doğal düşük DCs FRT dokularda sayısıdır. Bu şartlar altında ancak, phenotypical analizleri hala zenginleştirilmiş hücre süspansiyon karışık kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu yüzey işaretleyicileri ayırmak değil ve hücre fenotip hemen analiz için doku sindirim14sonrası sağlayan kullanılan, proteolitik sindirim yöntemi nedeniyle mümkündür. Ayrıca, hastanın yaşı kurtarılan hücreleri etkileyen bir faktör olabilir.
Bu iletişim kuralını kullanan, daha önce CD1a + yalıtım CD14 + seçim13daha phenotypically daha homojen bir nüfus sağladığını göstermiştir; Ancak, CD1a + DCs CX ve ECX kurtarmak zordur. CD14 da makrofajlar üzerinde ifade edilebilir olsa da, FRT CD14 izole nüfus DCs, DC işaretleri ve yeteneklerini allojeneik saf T-hücreleri, hangi bir DCs13hallmark fonksiyonudur uyarmak için ortak ifadeye dayalı zengindir + bulduk.
Kurtarılan DCs sayısı genellikle düşük olduğundan (< 100.000 toplam hücreleri), fonksiyonel çalışmalar düşük hücre sayıları için optimize edilmiş olması gerekir. İşte sadece 3000 DCs/iyi ile gerçekleştirilen bir allojeneik stimülasyon tahlil optimizasyonu göstermektedir. Diğer işlevi çalışmalar hormonal yanıt, sitokin ve HIV-stimülasyon ve HIV-yakalama üzerine antimikrobiyal peptid üretiminde FRT DCs13de dahil olmak üzere bu hücrelerle taşıdı. DCs izole ve kaplama sonra hücre canlılığı bu saatten sonra azaldıkça deneyleri s, 24 saat içinde yapılmalıdır.
Bu iletişim kuralı farklı DC alt kümelerini yalıtmak için adapte edilebilir veya manyetik boncuklar ve istenmeyen hücre tipleri kaldırmak için birleştirme sıralı pozitif ve negatif boncuk seçimi için uygun veri işaretleyicilerini seçerek diğer hücre tipleri birleştiğinde. Bir uyarı, her turda seçim ile bazı hücrelerin yüzdesi kaybolacak olduğunu, FRT DCs yalıtımı için hangi zaten nadirdir ve doku boyutu genellikle küçüktür, birden fazla mermi seçimi farklı işaretleri (ve gerekli değil yıkama) ilişkili tercih edilmez. Ayrıca, bu iletişim kuralı diğer bağışıklık hücreleri ya da DCs diğer dokulara14,15yalıtmak için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa yoktur
Acknowledgments
NIH tarafından desteklenen çalışma AI102838 ve AI117739 (CRW) verir. Richard Rossoll teknik yardım için teşekkür ederiz. Akış sitometrik analiz DartLab, Dartmouthsupported (P30CA023108-37) tarafından ve (P30GM103415-15) paylaşılan kaynak gerçekleştirilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
