Summary

Трехмерные воспалительных тканей человека эквиваленты десны

Published: April 03, 2018
doi:

Summary

Цель Протокола заключается в создании модели воспалительных человеческой десны в пробирке. Эта модель ткани совместно культивируют три типа клеток человека, HaCaT кератиноцитов, десневые фибробластов и THP-1 макрофагов, трехмерные условиях. Эта модель может применяться для расследования периодонтальных заболеваний, таких как гингивит и пародонтит.

Abstract

Болезни пародонта (таких как гингивит и пародонтит) являются ведущими причинами потери зубов у взрослых. Воспаление десен является основополагающим физиопатологические заболеваний пародонта. Текущие экспериментальные модели заболеваний пародонта были установлены в различных видов животных. Однако физиопатологические животных моделей отличается от людей, что делает его трудным для молекулярных и клеточных механизмов анализа и оценки новых лекарств для заболеваний пародонта. Здесь мы представляем подробный протокол для реконструкции воспалительных тканей человека эквиваленты десны (iGTE) в пробирке. Мы сначала построить эквиваленты человеческих тканей десны (ГТД), используя два типа клеток человека, включая десневой фибробластов (HGF) и эпидермальных кератиноцитов человеческой кожи (HaCaT), трехмерные условиях. Мы создаем модель раны с помощью ткани дырокол пробивать отверстие в GTE. Далее, человека THP-1 моноцитов, смешанного с коллагеном гель вводят в отверстие в GTE. По adimistration 10 нг/мл phorbol 12-миристат 13-ацетата (PMA) за 72 ч, THP-1 клетки дифференцированной в макрофагов в форме воспалительных очагов в GTE (iGTE) (IGTE также может быть stumilated с 2 мкг/мл липополисахаридов (LPS) для 48 h инициировать воспаление ). IGTE-первый в vitro модель воспалительных десны с использованием клеток человека с трехмерной архитектурой. IGTE отражает основные патологические изменения (immunocytes деятельность, внутриклеточных взаимодействий между fibryoblasts, эпителиальные клетки, моноциты и макрофаги) в заболеваний пародонта. GTE, раненых GTE и iGTE могут использоваться в качестве универсальных инструментов для изучения заживление ран, регенерации тканей, воспаление, ячейке взаимодействия и экран потенциальных лекарственных средств для заболеваний пародонта.

Introduction

Болезни пародонта являются основной причиной потери зубов у взрослых. Гингивит и пародонтит являются наиболее распространенных заболеваний пародонта. Оба представляют биопленки опосредованной острые или хронические воспалительные изменения в десны. Гингивит характеризуется острого воспаления, тогда как периодонтит обычно представляет как хроническое воспаление. На уровне гистологические бактериальных компоненты запуска активации иммунных клеток, таких как макрофагов, лимфоцитов, плазматические клетки и тучные клетки1,2. Эти клетки иммунной системы, особенно макрофаги, взаимодействуют с местными клеток (включая десневой эпителиальных клеток, фибробластов, эндотелиальных клеток и остеобласты) результате воспалительных поражений тканей пародонта3,4. Были созданы экспериментальные модели заболеваний пародонта в различных видов животных, таких как крысы, хомячки, кролики, хорьки, клыки и приматов. Однако физиопатологические животных моделей отличается от людей, что делает его трудным для молекулярных и клеточных механизмов анализа и оценки новых лекарств заболеваний пародонта5. Совместное выращивание периодонтальной бактерий и монослоя человека устной эпителиальных клеток был использован для изучения механизма пародонта инфекции6. Тем не менее однослойная культур устные клеток не хватает трехмерной (3D) сотовой архитектуры неповрежденной ткани; Таким образом они не могут имитировать ситуации в пробирке .

Здесь 3D воспалительных тканей человека эквиваленты десны (iGTE) созданы для представления заболеваний пародонта в пробирке. Эта 3D модель заболеваний пародонта занимает промежуточное положение между монослоя клеточных культур и животных моделей. Три типа клеток человека, включая HaCaT кератиноцитов, десневые фибробластов и THP-1 макрофаги, совместно культивируемых на гель коллагена и стимулируется воспалительных инициаторов построить iGTE. IGTE тесно имитирует условия в vivo дифференцировки клеток, клеток взаимодействия и активация макрофагов в десны. Эта модель имеет множество возможных применений для наркотиков скрининг и тестирование новых фармакологических подходов в заболеваниях пародонта, а также для анализа молекулярных и клеточных механизмов в заживление ран, воспаления и регенерации тканей.

Protocol

Этот протокол предназначен для создания человека десневой ткани эквиваленты, гингивального заживления и гингивит моделей. Кожа человека эпидермальных кератиноцитов (HaCaT) были любезно предоставил от профессор Норберт Fusenig E. Deutsches Krebsforschungszentrum (Хайдельберг, Германия)7. Десне?…

Representative Results

HaCaT ячеек типичные кератиноцитов морфология при фазово контрастной микроскопические наблюдения (рис. 2A). Сканер электрона микроскопических изображений (SEM) показал, что HaCaT клеток поверхности были охвачены многие микроворсинки. Межклеточные соединени?…

Discussion

Этот протокол основан на методы создания эквиваленты десневой ткани и подкожно-жировой эквиваленты, описанные в предыдущих докладах8,21,22. Хотя это простой и легкий метод, некоторые шаги требуют особого внимания. К примеру коллаген смес…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана в части японского общества для поощрения науки (JSP) субсидий для научных исследований (26861689 и 17 K 11813). Авторы хотели бы поблагодарить г-н Натаниел Грин для корректуры.

Materials

Collagen type I-A Nitta Gelatin Inc For making dermis of GTE
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 11900073 Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm Corning, Inc. 353096 For tissue culture
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Cell culture reagent
DMEM Thermo Fisher Scientific 31600034 Cell culture medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Cell culture reagent
Tissue puncher Shibata system service co., LTD SP-703 For punching holes in GTE
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 31800022 Cell culture medium
BSA Sigma-Aldrich A3294 For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) Thermo Fisher Scientific R37605 For labeling nuclei
Fluorescence mount medium Dako For mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] abcam ab17139 For identifying epithelium
Scaning electron microscope Hitachi, Ltd. HITACHI S-4000 For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopy LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. LSM 700 For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibody abcam ab52625 For identifying epithelium
Anti-vimentin antibody abcam ab92547 For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibody Millipore CBL271 For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibody Sigma-Aldrich SAB2700244 For identifying macrophages
Human CD14 Antibody R&D Systems MAB3832-SP For identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody Thermo Fisher Scientific A11012 For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11001 For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific For observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cells Riken BRC cell bank RCB1189 For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) Sigma-Aldrich P8139 For differentiatting THP-1 cells

References

  1. Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
  2. Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage. Frontiers in Immunology. 3, 118 (2012).
  3. Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: The role of the macrophage. Expert reviews in molecular medicine. 13, e23 (2011).
  4. Mescher, A. L. Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration. Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).
  5. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental Animal Models in Periodontology: A Review. The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).
  6. Han, Y. W., et al. Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells. Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).
  7. Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
  8. Xiao, L., Miwa, N. Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment. Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).
  9. Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  10. Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease. J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).
  11. Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
  12. Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol. 8, 1 (2007).
  13. Shetty, S., Gokul, S. Keratinization and its disorders. Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).
  14. Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study. J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).
  15. Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).
  16. Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).
  17. Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).
  18. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
  19. Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. Vimentin is secreted by activated macrophages. Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).
  20. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system. Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).
  21. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent. Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).

Play Video

Cite This Article
Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).

View Video