Трехмерные воспалительных тканей человека эквиваленты десны
Summary
Цель Протокола заключается в создании модели воспалительных человеческой десны в пробирке. Эта модель ткани совместно культивируют три типа клеток человека, HaCaT кератиноцитов, десневые фибробластов и THP-1 макрофагов, трехмерные условиях. Эта модель может применяться для расследования периодонтальных заболеваний, таких как гингивит и пародонтит.
Abstract
Болезни пародонта (таких как гингивит и пародонтит) являются ведущими причинами потери зубов у взрослых. Воспаление десен является основополагающим физиопатологические заболеваний пародонта. Текущие экспериментальные модели заболеваний пародонта были установлены в различных видов животных. Однако физиопатологические животных моделей отличается от людей, что делает его трудным для молекулярных и клеточных механизмов анализа и оценки новых лекарств для заболеваний пародонта. Здесь мы представляем подробный протокол для реконструкции воспалительных тканей человека эквиваленты десны (iGTE) в пробирке. Мы сначала построить эквиваленты человеческих тканей десны (ГТД), используя два типа клеток человека, включая десневой фибробластов (HGF) и эпидермальных кератиноцитов человеческой кожи (HaCaT), трехмерные условиях. Мы создаем модель раны с помощью ткани дырокол пробивать отверстие в GTE. Далее, человека THP-1 моноцитов, смешанного с коллагеном гель вводят в отверстие в GTE. По adimistration 10 нг/мл phorbol 12-миристат 13-ацетата (PMA) за 72 ч, THP-1 клетки дифференцированной в макрофагов в форме воспалительных очагов в GTE (iGTE) (IGTE также может быть stumilated с 2 мкг/мл липополисахаридов (LPS) для 48 h инициировать воспаление ). IGTE-первый в vitro модель воспалительных десны с использованием клеток человека с трехмерной архитектурой. IGTE отражает основные патологические изменения (immunocytes деятельность, внутриклеточных взаимодействий между fibryoblasts, эпителиальные клетки, моноциты и макрофаги) в заболеваний пародонта. GTE, раненых GTE и iGTE могут использоваться в качестве универсальных инструментов для изучения заживление ран, регенерации тканей, воспаление, ячейке взаимодействия и экран потенциальных лекарственных средств для заболеваний пародонта.
Introduction
Болезни пародонта являются основной причиной потери зубов у взрослых. Гингивит и пародонтит являются наиболее распространенных заболеваний пародонта. Оба представляют биопленки опосредованной острые или хронические воспалительные изменения в десны. Гингивит характеризуется острого воспаления, тогда как периодонтит обычно представляет как хроническое воспаление. На уровне гистологические бактериальных компоненты запуска активации иммунных клеток, таких как макрофагов, лимфоцитов, плазматические клетки и тучные клетки1,2. Эти клетки иммунной системы, особенно макрофаги, взаимодействуют с местными клеток (включая десневой эпителиальных клеток, фибробластов, эндотелиальных клеток и остеобласты) результате воспалительных поражений тканей пародонта3,4. Были созданы экспериментальные модели заболеваний пародонта в различных видов животных, таких как крысы, хомячки, кролики, хорьки, клыки и приматов. Однако физиопатологические животных моделей отличается от людей, что делает его трудным для молекулярных и клеточных механизмов анализа и оценки новых лекарств заболеваний пародонта5. Совместное выращивание периодонтальной бактерий и монослоя человека устной эпителиальных клеток был использован для изучения механизма пародонта инфекции6. Тем не менее однослойная культур устные клеток не хватает трехмерной (3D) сотовой архитектуры неповрежденной ткани; Таким образом они не могут имитировать ситуации в пробирке .
Здесь 3D воспалительных тканей человека эквиваленты десны (iGTE) созданы для представления заболеваний пародонта в пробирке. Эта 3D модель заболеваний пародонта занимает промежуточное положение между монослоя клеточных культур и животных моделей. Три типа клеток человека, включая HaCaT кератиноцитов, десневые фибробластов и THP-1 макрофаги, совместно культивируемых на гель коллагена и стимулируется воспалительных инициаторов построить iGTE. IGTE тесно имитирует условия в vivo дифференцировки клеток, клеток взаимодействия и активация макрофагов в десны. Эта модель имеет множество возможных применений для наркотиков скрининг и тестирование новых фармакологических подходов в заболеваниях пародонта, а также для анализа молекулярных и клеточных механизмов в заживление ран, воспаления и регенерации тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол основан на методы создания эквиваленты десневой ткани и подкожно-жировой эквиваленты, описанные в предыдущих докладах8,21,22. Хотя это простой и легкий метод, некоторые шаги требуют особого внимания. К примеру коллаген смес…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана в части японского общества для поощрения науки (JSP) субсидий для научных исследований (26861689 и 17 K 11813). Авторы хотели бы поблагодарить г-н Натаниел Грин для корректуры.
Materials
| Collagen type I-A | Nitta Gelatin Inc | For making dermis of GTE | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | Cell culture medium |
| Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm | Corning, Inc. | 353096 | For tissue culture |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Cell culture reagent |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31600034 | Cell culture medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Cell culture reagent |
| Tissue puncher | Shibata system service co., LTD | SP-703 | For punching holes in GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | Cell culture medium |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | For immunostaining |
| Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | For labeling nuclei |
| Fluorescence mount medium | Dako | For mounting samples after immunostaining | |
| Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] | abcam | ab17139 | For identifying epithelium |
| Scaning electron microscope | Hitachi, Ltd. | HITACHI S-4000 | For observing samples' surface topography and composition |
| Confocal laser scanning microscopy | LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. | LSM 700 | For observing samples' immunofluorescence staining |
| Anti-Cytokeratin 19 antibody | abcam | ab52625 | For identifying epithelium |
| Anti-vimentin antibody | abcam | ab92547 | For identifying fibroblasts and activated macrophages |
| Anti-TE-7 antibody | Millipore | CBL271 | For identifying fibroblasts in the dermis |
| Anti-CD68 antibody | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | For identifying macrophages |
| Human CD14 Antibody | R&D Systems | MAB3832-SP | For identifying macrophages |
| Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A11012 | For immunofluorescence staining |
| Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11001 | For immunofluorescence staining |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | For observing the sample's immunofluorescence staining | |
| THP-1 cells | Riken BRC cell bank | RCB1189 | For making iGTE |
| PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | For differentiatting THP-1 cells |
References
- Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
- Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage. Frontiers in Immunology. 3, 118 (2012).
- Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: The role of the macrophage. Expert reviews in molecular medicine. 13, e23 (2011).
- Mescher, A. L. Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration. Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental Animal Models in Periodontology: A Review. The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).
- Han, Y. W., et al. Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells. Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).
- Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Xiao, L., Miwa, N. Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment. Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease. J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).
- Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
- Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol. 8, 1 (2007).
- Shetty, S., Gokul, S. Keratinization and its disorders. Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).
- Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study. J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).
- Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).
- Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).
- Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).
- Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
- Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. Vimentin is secreted by activated macrophages. Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).
- Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system. Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).
- Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent. Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).
