Summary

3 차원 선 동적인 인간 조직 Gingiva 등가물

Published: April 03, 2018
doi:

Summary

프로토콜의 목적은 염증 인간의 gingiva 모델 시험관을 구축 하는 것입니다. 이 조직 모델 공동 세 가지 유형의 인간 세포, HaCaT keratinocytes, gingival fibroblasts 및 THP 1 대 식 세포, 3 차원 조건 하에서 양성. 치은 염 및 치 주 염 등 치 주 질환을 조사 하는 것이 모델을 적용할 수 있습니다.

Abstract

치 주 질환 (치은 염 등 치 주 염)는 성인에서 치아 손실의 주요 원인. Gingiva에 염증 치 주 질환의 근본적인 physiopathology입니다. 치 주 질환의 현재 실험 모델 동물의 다양 한 종류에 설립 되었습니다. 그러나, 동물 모델의 physiopathology는 인간의 세포 및 분자 메커니즘을 분석 하 고 치 주 질환에 대 한 새로운 의약품을 평가 하기가 어렵습니다 다릅니다. 여기, 우리 인간의 염증 성 조직 등가물 gingiva (iGTE) 체 외에서의 재구성에 대 한 자세한 프로토콜 제시. 우리는 먼저 인간의 gingival 섬유 아 세포 (HGF) 등 3 차원 조건 하에서 인간의 피부 상피 keratinocytes (HaCaT), 인간 세포의 두 종류를 이용 하 여 gingiva (GTE)의 인간의 조직에 해당 빌드. 우리는 GTE에 구멍을 펀치 조직 주먹을 사용 하 여 상처 모델을 만듭니다. 다음, 인간의 THP 1 monocytes 콜라겐 젤과 혼합는 GTE에 구멍에 주입 됩니다. 10 ng/mL phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 72 h에 대 한 adimistration에 의해 THP-1 셀 GTE (iGTE)에서 양식 염증 foci 하 대 식 세포로 분화 (IGTE 또한 일 수 있다 stumilated lipopolysaccharides (LPS)의 2 µ g/mL와 염증을 시작 하 48 h에 대 한 ). IGTE 3 차원 구조와 인간 세포를 사용 하 여 염증 gingiva의 첫 번째 시험관에 모델입니다. IGTE 치 주 질환에 주요 학적 변화 (immunocytes activition, fibryoblasts, 상피 세포, monocytes 그리고 대 식 세포 중에서 세포 상호 작용)을 반영 한다. 치 주 질환에 대 한 상처 치유 공부를 다양 한 도구, 조직 재생, 염증, 세포 세포 상호 작용, 및 화면 잠재적인 약으로 GTE, 부상된 GTE, 및 iGTE을 사용할 수 있습니다.

Introduction

치 주 질환 성인에서 치아 손실의 주요 원인입니다. 치은 염 및 치 주 염 가장 일반적인 치 주 질병이 있습니다. 둘 다 gingiva에 biofilm 중재 급성 또는 만성 염증 성 변화를 제시. 치은 염 치 주 염이 만성 염증으로 일반적으로 선물 하는 반면 급성 염증, 특징 이다. 조직학 수준에 세균성 구성 요소는 대 식 세포, 림프 톨, 플라스마 세포, 돛대 세포1,2등 면역 세포의 활성화를 트리거합니다. 이러한 면역 세포 특히 대 식 세포, 지방 세포 (gingival 상피 세포, 섬유 아 세포, 내 피 세포, 및 osteoblasts 포함)와 상호 작용 결과로 치 주 조직3,4에 염증 성 병 변. 치 주 질환의 실험 모델 동물, 쥐, 등의 다양 한 종류에서 설립 되어 햄스터, 토끼, 흰 족제비, 개, 그리고 대주교. 그러나, 동물 모델의 physiopathology는 인간의 세포 및 분자 메커니즘을 분석 하 고 치 주 질환5의 새로운 의약품을 평가 하기가 어렵습니다 다릅니다. 치 주 박테리아와 단층 인간 구강 상피 세포의 공동 경작은 치 주 감염6의 메커니즘을 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 구강 세포의 단층 문화 부족 그대로 조직;의 3 차원 (3D) 셀룰러 아키텍처 따라서, 그들은 체 외에 상황을 모방 수 없습니다.

여기, 3D 염증 인간의 조직 등가물 gingiva (iGTE)의 생체 외에서치 주 질환을 대표 설정 됩니다. 치 주 질환의이 3D 모델 단층 세포 배양 및 동물 모델 사이의 중간 위치를 차지 하고있다. 세 가지 유형의 HaCaT keratinocytes, gingival fibroblasts 및 THP-1 세포를 포함 하 여 인간 셀 공동 콜라겐 젤에 재배 있으며 iGTE 구축 염증 초기자에 의해 자극. IGTE는 밀접 하 게 세포 분화, 세포 세포 상호 작용 및 gingiva에 대 식 세포 활성화의 비보에 조건을 시뮬레이션합니다. 이 모델은 마약 검사 및 치 주 질환, 새로운 약리학 접근을 테스트 뿐만 아니라 상처 치유, 염증, 및 조직 재생에 세포질이 고 분자 메커니즘 분석을 위한 많은 가능한 응용.

Protocol

이 프로토콜은 인간의 gingival 조직 등가물, gingival 상처 모델 및 치은 염 모델을 만들 하도록 설계 되었습니다. 인간의 피부 상피 keratinocytes (HaCaT) 교수 노 버트 E. Fusenig 독일 Krebsforschungszentrum (하이 델 베르크, 독일)7의에서 친절 하 게 제공 되었다. 인간의 gingival 섬유 아 세포 (HGFs)8이전 게시 된 프로토콜 따라 gingival 조직에서 분리 했다. 미리 동의 얻어와 연구 윤…

Representative Results

HaCaT 세포 단계 대조 현미경 관찰 (그림 2A)에서 전형적인 keratinocyte 형태 표시. 전자 현미경 (SEM) 이미지 스캐너 HaCaT 세포 표면 많은 microvilli에 의해 덮여 있었다 보였다. HaCaT 세포 사이의 세포 연결 막 프로세스 (그림 2B)에 의해 중재 했다. HaCaT 세포 gingival 상피 마커 K8/1814, HaCaT 세포 적합 gingiva 재건 (<strong class="…

Discussion

이 프로토콜 gingival 조직 등가물 및 이전 보고서8,,2122에 의해 설명 된 피하 지방 조직 등가물을 만드는 방법을 기반으로 합니다. 이 간단 하 고 쉬운 방법 이지만, 일부 단계 특별 한 주의가 필요 합니다. 예를 들어 콜라겐 혼합 솔루션에서 젤 형성을 피하기 위해 사용 될 때까지 얼음에 유지 되어야 한다. 문화 삽입으로 콜라겐 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품 지원 부분에서 일본 사회에 의해 과학 진흥 (JSP) 선진적인 과학 연구 (26861689 및 17 K 11813) 한다. 저자 나 다니엘 그린 씨 교정 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Collagen type I-A Nitta Gelatin Inc For making dermis of GTE
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 11900073 Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm Corning, Inc. 353096 For tissue culture
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Cell culture reagent
DMEM Thermo Fisher Scientific 31600034 Cell culture medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Cell culture reagent
Tissue puncher Shibata system service co., LTD SP-703 For punching holes in GTE
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 31800022 Cell culture medium
BSA Sigma-Aldrich A3294 For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) Thermo Fisher Scientific R37605 For labeling nuclei
Fluorescence mount medium Dako For mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] abcam ab17139 For identifying epithelium
Scaning electron microscope Hitachi, Ltd. HITACHI S-4000 For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopy LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. LSM 700 For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibody abcam ab52625 For identifying epithelium
Anti-vimentin antibody abcam ab92547 For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibody Millipore CBL271 For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibody Sigma-Aldrich SAB2700244 For identifying macrophages
Human CD14 Antibody R&D Systems MAB3832-SP For identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody Thermo Fisher Scientific A11012 For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11001 For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific For observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cells Riken BRC cell bank RCB1189 For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) Sigma-Aldrich P8139 For differentiatting THP-1 cells

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Cite This Article
Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).

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