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Developmental Biology

तीन आयामी भड़काऊ मानव ऊतक Gingiva के समकक्ष

doi: 10.3791/57157 Published: April 3, 2018

Summary

प्रोटोकॉल का लक्ष्य इन विट्रो मेंएक भड़काऊ मानव gingiva मॉडल का निर्माण करने के लिए है । यह ऊतक मॉडल सह तीन आयामी परिस्थितियों के तहत मानव कोशिकाओं, HaCaT keratinocytes, मसूड़ों fibroblasts, और THP-1 मैक्रोफेज, के तीन प्रकार की खेती । इस मॉडल ऐसे मसूड़े की सूजन और periodontitis के रूप में periodontal रोगों की जांच के लिए लागू किया जा सकता है ।

Abstract

Periodontal रोग (जैसे मसूड़े की सूजन और periodontitis) वयस्कों में दांत नुकसान के प्रमुख कारण हैं । gingiva में सूजन periodontal रोगों के बुनियादी physiopathology है । periodontal रोगों के वर्तमान प्रयोगात्मक मॉडल जानवरों के विभिन्न प्रकार में स्थापित किया गया है । हालांकि, पशु मॉडलों की physiopathology है कि मनुष्यों से अलग है, यह मुश्किल सेलुलर और आणविक तंत्र का विश्लेषण करने के लिए और periodontal रोगों के लिए नई दवाओं का मूल्यांकन करने के लिए बना । यहां, हम मानव भड़काऊ ऊतक gingiva के समकक्ष (iGTE) इन विट्रो मेंपुनर्निर्माण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम पहले मानव मसूड़ों fibroblasts (एचजीएफ) और मानव त्वचा एपिडर्मल keratinocytes (HaCaT), तीन आयामी परिस्थितियों के तहत सहित मनुष्य कोशिकाओं के दो प्रकार के उपयोग द्वारा gingiva (GTE) के मानव ऊतक समकक्ष का निर्माण । हम एक ऊतक पंच का उपयोग करके एक घाव मॉडल बनाने के लिए GTE में एक छेद पंच । अगले, मानव THP-1 कोलेजन जेल के साथ मिश्रित monocytes GTE में छेद में इंजेक्ट कर रहे हैं । के adimistration द्वारा 10 एनजी/एमएल phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) के लिए 72 ज, THP-1 कोशिकाओं मैक्रोफेज में भड़काऊ घावों फार्म करने के लिए GTE (iGTE) में विभेदित (iGTE भी हो सकता है stumilated के साथ 2 µ g/mL (lipopolysaccharides) के लिए 48 h सूजन शुरू करने के लिए ). IGTE एक तीन आयामी वास्तुकला के साथ मानव कोशिकाओं का उपयोग भड़काऊ gingiva के इन विट्रो मॉडल में पहला है । IGTE periodontal रोगों में प्रमुख रोग परिवर्तन (immunocytes activition, fibryoblasts, उपकला कोशिकाओं, monocytes और मैक्रोफेज के बीच intracellular बातचीत) को दर्शाता है । GTE, घायल GTE, और iGTE बहुमुखी उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है घाव भरने का अध्ययन, ऊतक पुनर्जनन, सूजन, सेल सेल संपर्क, और स्क्रीन periodontal रोगों के लिए संभावित दवाओं ।

Introduction

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Periodontal रोग वयस्कों में दांत नुकसान का प्रमुख कारण हैं । मसूड़े की सूजन और periodontitis सबसे आम periodontal रोग हैं । दोनों वर्तमान फिल्म gingiva में तीव्र या जीर्ण भड़काऊ परिवर्तन मध्यस्थता । मसूड़े की सूजन तीव्र सूजन की विशेषता है, जबकि periodontitis आमतौर पर जीर्ण सूजन के रूप में प्रस्तुत करता है । ऊतकवैज्ञानिक स्तर पर, बैक्टीरियल घटक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सक्रियकरण ट्रिगर, जैसे मैक्रोफेज, लिम्फोसाइटों, प्लाज्मा कोशिकाओं, और मस्तूल कोशिकाओं1,2. इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं, विशेष रूप से मैक्रोफेज, (मसूड़ों उपकला कोशिकाओं, fibroblasts, endothelial कोशिकाओं, और osteoblasts सहित) periodontal ऊतक में भड़काऊ घावों में जिसके परिणामस्वरूप स्थानीय कोशिकाओं के साथ बातचीत3,4. periodontal रोगों के प्रयोगात्मक मॉडल जैसे चूहों, हंसटर, खरगोश, ferrets, कुत्ते, और रहनुमाओं के रूप में पशुओं के विभिन्न प्रकार में स्थापित किया गया है । हालांकि, पशु मॉडलों की physiopathology है कि मनुष्यों से अलग है, यह मुश्किल सेलुलर और आणविक तंत्र का विश्लेषण करने और periodontal रोगों की नई दवाओं का मूल्यांकन करने के लिए5। periodontal जीवाणुओं और monolayer मानव मौखिक उपकला कोशिकाओं की सह खेती periodontal संक्रमण के तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है6. फिर भी, मौखिक कोशिकाओं की monolayer संस्कृतियों बरकरार ऊतक के तीन आयामी (3 डी) सेलुलर वास्तुकला की कमी; इसलिए, वे इन विट्रो स्थिति में नकल नहीं कर सकते ।

यहां, 3 डी भड़काऊ मानव ऊतक gingiva के समकक्ष (iGTE) इन विट्रो मेंperiodontal रोगों का प्रतिनिधित्व करने के लिए स्थापित कर रहे हैं । periodontal रोगों के इस 3 डी मॉडल monolayer सेल संस्कृतियों और जानवरों के मॉडल के बीच एक मध्यवर्ती स्थिति में रह रहे हैं । HaCaT keratinocytes, मसूड़ों fibroblasts, और THP-1 मैक्रोफेज सहित मानव कोशिकाओं के तीन प्रकार, सह कोलेजन जेल पर खेती कर रहे हैं, और भड़काऊ सर्जक द्वारा उत्तेजित करने के लिए iGTE का निर्माण । IGTE बारीकी से सेल भेदभाव, सेल सेल संपर्क, और gingiva में मैक्रोफेज सक्रियण की vivo स्थितियों में simulates । इस मॉडल दवा स्क्रीनिंग के लिए कई संभव आवेदन किया है और periodontal रोगों में नए औषधीय दृष्टिकोण का परीक्षण, साथ ही साथ घाव भरने में सेलुलर और आणविक तंत्र का विश्लेषण करने के लिए, सूजन, और ऊतक पुनर्जनन.

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Protocol

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इस प्रोटोकॉल मानव मसूड़ों ऊतक समकक्ष, मसूड़ों घाव मॉडल, और मसूड़े की सूजन मॉडल बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है । ह्यूमन स्किन एपिडर्मल keratinocytes (HaCaT) को कृपया ड्यूश्स Fusenig (Krebsforschungszentrum, जर्मनी)7के प्रोफेसर Norbert ई. हीडलबर्ग से प्रदान किया गया । मानव मसूड़ों fibroblasts (HGFs) पूर्व में प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार मसूड़ों ऊतकों से पृथक किए गए थे8. सूचित सहमति पहले से प्राप्त किया गया था, और अध्ययन नैतिकता की समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों के अनुसार अनुमोदित किया गया था, निप्पॉन डेंटल यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ लाइफ दंत चिकित्सा टोक्यो में (प्राधिकरण संख्या: NDU-T2012-35). प्रोटोकॉल चरण 1 – 3 एक सेल कल्चर हुड में किया जाना चाहिए ।

1.3 डी मानव ऊतक Gingiva (GTE) (चित्र 1a) के समकक्ष की तैयारी

  1. मिश्रण कोलेजन प्रकार मैं-10% केंद्रित मेम-अल्फा और 10% पुनर्निर्माण बफर के साथ एक जेल (2.2 g NaHCO3 और ४.४७ g HEPES की 100 मिलीलीटर 0.05 N NaOH में) एक 15 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में pipetting द्वारा । बर्फ पर मिश्रित कोलेजन हल रखें जब तक इस्तेमाल किया ।
  2. प्लेस 24-अच्छी तरह से संस्कृति आवेषण (ताकना आकार 3.0 µm) में एक 24 अच्छी तरह से थाली ।
  3. 0.25% trypsin-EDTA समाधान का उपयोग कर संस्कृति की सतह से HGFs निकालें । संस्कृति के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित मध्यम A (मेम-अल्फा + 20% FBS + 1% GlutaMAX) । Bürker-तुर्क कक्ष काउंटर द्वारा कक्षों की गणना करना.
    1. कोशिकाओं की वांछित मात्रा निकालें (1-5 x105 कोशिकाओं/एमएल), तो 190 x जी में 4 मिनट के लिए केंद्रापसारक
    2. मिश्रित कोलेजन समाधान में कोशिकाओं को निलंबित । अगले कदम तक मिश्रण को बर्फ पर रखें ।
  4. सेल के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें-कोलेजन मिश्रण (0.5-2.5 x 105 कोशिकाओं/अच्छी तरह से) संस्कृति डालने में किसी भी बुलबुले के उत्पादन के बिना । 10-30 मिनट के लिए एक humidified वातावरण में 5% सह के साथ मिश्रण की मशीन 37 डिग्री सेल्सियस पर2 एक जेल में मिश्रण coagulate ।
    नोट: संस्कृति डालने के केंद्र में कोलेजन मिश्रण जोड़ें कोलेजन जेल के असमान गठन से बचने के लिए ।
  5. संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर में अच्छी तरह से और डालने में 0.5 मिलीलीटर जोड़ें । 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2 के साथ एक humidified वातावरण में 24 घंटे या रात भर के लिए संस्कृति प्लेट की मशीन ।
  6. 0.25% trypsin-EDTA समाधान का उपयोग करके culture सरफ़ेस से HaCaT कक्षों को निकालें । (DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX) मध्यम बी के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित और कोशिकाओं की गिनती । कोशिकाओं की जरूरत मात्रा (1-5 x 105 कोशिकाओं/एमएल) एक पिपेट के साथ निकालने के लिए, 190 x जी पर 4 मिनट के लिए केंद्रापसारक मध्यम बी में कोशिकाओं को निलंबित ।
  7. संस्कृति आवेषण, जो एचजीएफ-कोलेजन मिश्रण, आकांक्षा से होते है से मध्यम निकालें । एचजीएफ-कोलेजन मिश्रण के शीर्ष पर HaCaT सेल निलंबन (0.5-2.5 x 105 कोशिकाओं की 0.5 मिलीलीटर जोड़ें/ 24 ज या रात भर के लिए संस्कृतियों की मशीन ।
    नोट: इस समय बिंदु पर, संस्कृति में मध्यम अच्छी तरह से मध्यम होना चाहिए, जबकि संस्कृति डालने में मध्यम बी मध्यम होना चाहिए.
  8. संस्कृति माध्यम को KSR मीडियम से बदलें (सह संस्कृति माध्यम) (मेम-अल्फा + 15% नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट + 1% GlutaMAX) + 5% FBS । संस्कृति में कल्चरल मीडियम के 1 एमएल को अच्छी तरह से जोड़ें और कल्चरल डालने में 0.5 एमएल लगाएं । 24-48 एच के लिए संस्कृतियों की मशीन ।
  9. संस्कृति माध्यम को KSR मीडियम से बदलें + 1% FBS । संस्कृति में अच्छी तरह से और 0.5 मिलीलीटर में 1 मिलीलीटर जोड़ें । 24 ज या रात भर के लिए संस्कृतियों की मशीन ।
  10. संस्कृति माध्यम को संस्कृति में अच्छी तरह 0.7 – 1 मिलीलीटर KSR माध्यम से प्रतिस्थापित करें । माध्यम को पूरी तरह से कल्चरल insert से निकालें (कल्चरल सरफेस को हवा से उजागर किया जाना चाहिए). 1-2 सप्ताह के लिए संस्कृतियों की मशीन । संस्कृति में माध्यम को अच्छी तरह से दो बार प्रति सप्ताह बदलें ।
    नोट: (ऊपर परत keratinocytes से बना) संस्कृति सतह से ऊपर मध्यम स्तर वृद्धि न दें । हमेशा संस्कृति सतह सूखी रखो ।

2. घायल GTE की तैयारी (चित्र 1b)

  1. एक 1 – 3 मिमी व्यास ऊतक पंच तैयार करते हैं । यह 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर एक आटोक्लेव के साथ निष्फल ।
  2. GTE में के बारे में 300 µm गहरी ऊतक घूंसे सीधा पुश, और एक घाव अनुकरण करने के लिए ऊतक में एक छेद पंच ।
  3. इस कदम पर, घाव भरने और ऊतक पुनर्जनन की जांच के लिए घायल GTE का उपयोग करें । वैकल्पिक रूप से, ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण करने के लिए 10% formalin तटस्थ बफ़र समाधान का उपयोग कर GTE फिक्स ।

3. भड़काऊ GTE (iGTE) (चित्र 1b) की तैयारी

  1. पिछली रिपोर्ट9के अनुसार THP-1 कक्षों की खेती करें ।
  2. मिश्रण कोलेजन प्रकार I-एक जेल 10% केंद्रित RPMI १६४०, 10% पुनर्निर्माण बफर के साथ (2.2 g NaHCO3 और ४.४७ g HEPES में 100 मिलीलीटर 0.05 N NaOH) और 10 एनजी/एमएल पमा । बर्फ पर मिश्रित कोलेजन समाधान रखें जब तक उपयोग करें ।
  3. 1 गिनती-2 एक्स 106 THP-1 कोशिकाओं और 190 x जी में 4 मिनट के लिए केंद्रापसारक मिश्रित कोलेजन समाधान के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित । अगले कदम तक मिश्रण को बर्फ पर रखें ।
  4. जोड़ें 10 – 30 µ l THP-1-GTE के घायल क्षेत्र में कोलेजन मिश्रण. संस्कृति माध्यम को 0.7 – 1 मिलीलीटर KSR मध्यम से प्रतिस्थापित करें जिसमे पमा के 10 एनजी/
  5. 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% कं2 के साथ एक humidified वातावरण में मिश्रण की मशीन ।
  6. मसूड़े की सूजन या periodontal रोग की जांच के लिए मॉडल का प्रयोग करें (उदाहरण के लिए, iGTE के लिए संभावित विरोधी भड़काऊ दवा जोड़ने के लिए cytokine रिलीज10पर इसके प्रभाव को देखने के लिए) । वैकल्पिक रूप से, छोड़ 72 ज पमा-उपचार, संस्कृति में 2 µ जी/एलपीएस के एमएल जोड़ें, और 5% कं2 के साथ एक humidified वातावरण में ऊतक मशीन 37 ° c 48 ज11,12के लिए ।

4. निर्धारण और GTE और iGTE संस्कृतियों के पूरे माउंट Immunostaining

  1. संस्कृतियों का निर्धारण ।
    1. कल्चरल मीडियम को 24 वेल प्लेट से हटा लें । ऊतकों को धो लें 2 बार फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ ।
    2. संमिलित करने के लिए 10% formalin तटस्थ बफर समाधान और संस्कृति को अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर की 1 मिलीलीटर जोड़ें । रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रिज में 24 अच्छी तरह से थाली छोड़ दें ।
    3. 10% formalin तटस्थ बफर समाधान अगले दिन निकालें ।
    4. पूरे माउंट immunostaining के लिए, निर्धारण के बाद, पंजाबियों के साथ 3-4 बार ऊतकों को धो लें ।
    5. hematoxylin और eosin के लिए (एच एंड ई) धुंधला और नियमित रूप से immunostaining, निर्जलीकरण, आयल embedding, और अनुभाग के साथ आगे बढ़ें ।
      नोट: पूरे माउंट immunostaining के लिए, यह चरण छोड़ा जा सकता है ।
  2. पूरे माउंट immunostaining
    नोट: यह प्रोटोकॉल संदर्भ 13 में से एक से संशोधित किया गया था ।
    1. पंजाब में 0.5-1% ट्राइटन, 10-30 मिनट के ऊतकों को धो लें ।
    2. बफर अवरुद्ध में 30 मिनट के लिए दो बार ऊतकों की मशीन (पंजाब 1% ट्राइटन + 10% BSA), कमरे के तापमान पर ।
    3. ऊतकों को धो 2 बफर अवरुद्ध में ×, 5-10 मिनट हर बार ।
    4. आवश्यक कमजोर पड़ने पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 50 µ एल जोड़ें/ ऊतक बाहर सुखाने से बचने के लिए आवेषण लपेट करने के लिए एक पतली प्लास्टिक पकड़ फिल्म का प्रयोग करें ।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 से 2 दिनों के लिए ऊतक की मशीन ।
    6. ऊतकों को धोकर 3 बार, पंजाब में 30 मिनट के लिए 1% ट्राइटन + 10% BSA । फिर से 3 बार धो लें, 1% ट्राइटन में 5 मिनट के लिए ।
    7. बफ़र अवरुद्ध करने में द्वितीयक एंटीबॉडी के 50 µ l जोड़ें (पंजाबियों 1% ट्राइटन + 10% BSA) और 5 µ l के Hoechst ३३३४२ समाधान (NucBlue लाइव सेल दाग) प्रत्येक डालने के लिए । ऊतक बाहर सुखाने से बचने के लिए आवेषण लपेट करने के लिए एक पतली प्लास्टिक पकड़ फिल्म का प्रयोग करें ।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 से 2 दिनों के लिए मशीन । एक गीले कागज तौलिया में 24 अच्छी तरह से थाली लपेटें, और फिर यह एक प्लास्टिक पैक में डाल करने के लिए मशीन भर में इस्तेमाल किया जाएगा ।
    9. ऊतकों को धोकर 3 बार, 10 मिनट के लिए पंजाब में 1% ट्राइटन
    10. ऊतक प्राप्त करने के लिए संस्कृति डालने की झिल्ली में कटौती करने के लिए एक तेज सुई का प्रयोग करें । झिल्ली को स्लाइड पर रखें ।
      नोट: ऊतक झिल्ली पर होना चाहिए ।
    11. प्रतिदीप्ति माउंट मध्यम के 2-3 बूंदें जोड़ें । कवर ग्लास के साथ ऊतक कवर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर अंधेरे में विश्लेषण तक ।
    12. एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (LSM) के साथ ऊतकों को देखें ।

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Representative Results

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HaCaT कक्षों में चरण-कंट्रास्ट सूक्ष्म अवलोकन (चित्र 2a) के अंतर्गत विशिष्ट keratinocyte आकृतियां प्रदर्शित की गई हैं । स्कैनर इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म (SEM) छवियों से पता चला है कि HaCaT सेल सतहों कई microvilli द्वारा कवर किया गया । HaCaT कोशिकाओं के बीच सेलुलर कनेक्शन झिल्ली प्रक्रियाओं द्वारा मध्यस्थता की गई (चित्र बीसी) । HaCaT कोशिकाओं मसूड़ों उपकला मार्कर K8/1814व्यक्त की है कि HaCaT कोशिकाओं gingiva पुनर्निर्माण (चित्रा 2c) के लिए उपयुक्त हैं ।

चित्रा 3 ए GTE का एक सफल उदाहरण से पता चलता है, और चित्र बी GTE के एक असफल उदाहरण से पता चलता है । असफल परीक्षण (चित्र बी) कोलेजन जेल मिश्रण के कारण होता है संस्कृति डालने के केंद्र में नहीं जोड़ा जा रहा है । चित्रा 3 सी से पता चला है कि GTE के एक घाव मॉडल एक ऊतक पंच के साथ ऊतक में एक छेद छिद्रण द्वारा बनाया जा सकता है । एच एंड ई धुंधला (चित्रा 3 डी) और SEM छवियां (चित्रा 3E) का प्रदर्शन किया है कि खेती के 19 दिनों में, के बारे में 10-HaCaT कोशिकाओं फार्म उपकला के 20 परतों, और कोलेजन जेल-एचजीएफ कोशिकाओं के रूप लेमिना propria एंबेडेड । खंगाला GTE के लेमिना propria में, एचजीएफ कोशिकाओं fibroblasts (चित्रा 3F) की विशेषता आकृति विज्ञान का प्रदर्शन, और कोलेजन फाइबर की अच्छी तरह से परिभाषित arrays (चित्रा 3 जी) से घिरे थे । इम्यूनोफ्लोरेसेंस के दाग से पता चला कि vimentin और ते-7 (उन दोनों का अधययन fibroblast मार्कर15) propria (फिगर 4a और GTE) के लेमिना 4B में व्यक्त किया जाता है । K19, periodontitis में जंक्शनीय और पॉकेट उपकला के लिए एक विशिष्ट मार्कर16, कमजोर GTE (चित्रा 4c) की उपकला में व्यक्त की है, और दृढ़ता से iGTE (चित्रा 4d) की उपकला में व्यक्त की है. डेटा HaCaT कोशिकाओं periodontitis में प्रमुख उपकला कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं कि सुझाव दिया, विशेष रूप से लेमिना propria की भड़काऊ उत्तेजना के बाद.

सूजन मसूड़ों रोग, मसूड़े की सूजन और periodontitis के रूप में, histologically लिम्फोसाइटों और मैक्रोफेज की उपस्थिति की विशेषता है, और फाइब्रोसिस और ऊतक परिगलन17,18में परिणाम । इस प्रोटोकॉल में, THP-1 कक्षों iGTE के लिए भड़काऊ कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया गया । के रूप में चित्रा 5में दिखाया गया है, पमा-उत्तेजना के बिना, THP-1 कोशिकाओं एक monocytic आकृति विज्ञान प्रस्तुत किया और उनमें से ज्यादातर मध्यम (चित्रा 5) में मंगाई । इसके विपरीत, THP-1 कोशिकाओं के 50% से अधिक मैक्रोफेज-की तरह कोशिकाओं में विभेदित और संस्कृति की सतह (चित्रा 5B) पर पालन के लिए पमा 10 एनजी/ HaCaT और एचजीएफ कोशिकाओं के समान8, THP-1 कोशिकाओं सह संस्कृति माध्यम (KSR माध्यम) में कोलेजन जेल के अंदर अच्छी तरह से वृद्धि हुई है, और पमा-उपचार (चित्रा मैक्रोफेज) के बाद 5C की तरह कोशिकाओं में विभेदित । Immunostaining से पता चला कि पालने THP-1 कोशिकाओं CD68 (एक मार्कर के मैक्रोफेज19) (चित्रा 5d) और CD14 (मैक्रोफेज के एक और मार्कर) (चित्रा 6) व्यक्त की है । iGTE फार्म करने के लिए, THP-1 monocytes कोलेजन जेल में एंबेडेड और एक घाव (चित्रा 5E) अनुकरण छेद में इंजेक्शन थे । पर 72 ज पमा (10 एनजी/एमएल)-उत्तेजना, THP-1 कोशिकाओं मैक्रोफेज में विभेदित (चित्रा 5F) एक घाव का अनुकरण छेद के अंदर और CD68 व्यक्त (चित्रा5), यह दर्शाता है कि वे घाव GTE में भड़काऊ घावों के रूप में सक्षम हैं ।

पूरे माउंट immunohistochemistry (चित्रा 6) से पता चला है कि THP-1 एक घाव का अनुकरण छेद में कोशिकाओं न केवल CD14 व्यक्त (मैक्रोफेज का एक और मार्कर), लेकिन यह भी व्यक्त की vimentin के रूप में के रूप में अच्छी तरह से छेद के किनारे में fibroblasts । Vimentin सक्रिय मैक्रोफेज20द्वारा व्यक्त किया जाता है । डेटा ने पुष्टि की कि THP-1 मैक्रोफेज कार्यशील हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक डिजाइन. gingiva (GTE) () और भड़काऊ GTE (iGTE) (बी) के 3 डी मानव ऊतक समकक्ष के प्रयोगात्मक सेटअप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: HaCaT keratinocytes के लक्षण वर्णन. () चरण-संस्कृति में HaCaT कोशिकाओं के विपरीत सूक्ष्म छवि । स्केल बार = 50 µm. (B) HaCaT कक्षों की छवि SEM । () मसूड़ों उपकला कोशिका मार्कर K8 के लिए HaCaT कोशिकाओं के दाग Immunohistochemical/ ग्रीन, K8 १८/ नीला, DAPI । स्केल बार = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: gingiva (GTE) के 3 डी मानव ऊतक समकक्ष के लक्षण वर्णन । () संस्कृति में एक सफल GTE का उदाहरण. टिशू कल्चर डालने के बीच में होता है । (B) किसी विफल GTE का उदाहरण: GTE का भाग ऊतक से अलग होता है और दीवार (लाल तीर) की ओर पक्षपाती होता है । () घायल GTE: पीला तीर एक ऊतक पंच द्वारा छिद्रित छेद इंगित करता है । () एच और ई GTE के धुंधला 19 दिनों (14 दिन एयर एक्सपोजर) के लिए खेती की । स्केल बार = 50 µm. () GTE की एक ऊर्ध्वाधर अनुभाग की SEM छवि 19 दिनों के लिए खेती की । () चरण-कंट्रास्ट कोलेजन जेल में एचजीएफ कोशिकाओं के विपरीत सूक्ष्म छवि है कि GTE के लेमिना propria का गठन किया । स्केल बार = 25 µm. (G) GTE के लेमिना propria में एचजीएफ कोशिकाओं के आसपास बड़े पैमाने पर कोलेजन तंतुओं की SEM छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: vimentin की अभिव्यक्ति, ते-7 और GTE में K19. vimentin में लेमिना propria मार्करों GTE (A और b) और TE-7 (b) के लिए GTE का इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग, और एपिडर्मिस (C) और K19 (D) में GTE मार्कर iGTE । लाल, vimentin और K19 । हरा, ते-7 । नीला, DAPI । ई, एपिडर्मिस; एल. पी., लेमिना propria. स्केल बार = 50 µm (A, C and D), 20 µm (B). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: THP-1 कोशिकाओं के लक्षण वर्णन. () संस्कृति में विभेदित THP-१ कोशिकाएँ. स्केल बार = 15 µm. (B) विभेदित THP-1 मैक्रोफेज । स्केल बार = 15 µm. () THP-1 कोशिकाओं KSR मध्यम में कोलेजन जेल में एंबेडेड और 24 घंटे के लिए पमा के साथ इलाज किया गया = 50 µm. () Immunohistochemical के दाग THP के लिए 1 मैक्रोफेज मार्कर मैक्रोफेज । लाल, CD68 । नीला, DAPI । स्केल बार = 5 µm. (E) THP-1-HGE के घायल छिद्र में कोलेजन का मिश्रण पमा उपचार की शुरुआत में । स्केल बार = 25 µm. () THP-1 कक्ष मैक्रोफेज (लाल तीरों) में विभेदित 72 h पर पमा उपचार के बाद । स्केल बार = 25 µm. (G) THP-1 कक्षों में मैक्रोफेज मार्कर CD68 व्यक्त किया गया । पीला डैश्ड रेखा एच एंड ई. स्केल बार में जख्मी छेद के क्षेत्र को इंगित करता है = 100 µm. लाल, CD68 । नीला, hoechst ३३३४२. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: iGTE के लक्षण वर्णन. CD14 (हरा) और vimentin (लाल) के लिए पूरे माउंट immunohistochemistry iGTE पर प्रदर्शन किया गया । Z-श्रृंखला छवियां (C) iGTE के माध्यम से कैप्चर किया गया (कुल में 416 µm । 1 पैनल पहला खंड स्कैन LSM है, और 25 पैनल पिछले है । अंतराल के बारे में १६.६४ µm वर्गों के बीच है) । प्रतिनिधि धारा (A) (z-श्रृंखला छवियों के नहीं 17), orthophoto और जेड के 3d छवि-पोट () CD14 के 3 डी वितरण-और vimentin पॉजिटिव THP-1 मैक्रोफेज में एक घाव का अनुकरण करते हुए छेद में प्रस्तुत iGTE । iGTE में LSM की स्कैनिंग की स्थिति (D) और बाएं शीर्ष कोने (A) में दर्शाई गई है । स्केल बार = 50 µm. पीली डॉटेड रेखाएं iGTE में जख्मी छेद के क्षेत्र को इंगित करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल पिछले रिपोर्ट8,21,22द्वारा वर्णित मसूड़ों ऊतक समकक्ष और चमड़े के नीचे वसा-ऊतक समकक्ष बनाने के तरीकों पर आधारित है । हालांकि यह एक सरल और आसान तरीका है, कुछ कदम विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, कोलेजन मिश्रण बर्फ पर रखा जाना चाहिए जब तक उपयोग के समाधान में जेल गठन से बचने के लिए । जब संस्कृति डालने में कोलेजन मिश्रण जोड़ने, सुनिश्चित करें कि समाधान डालने के केंद्र में इंजेक्शन के लिए एक पक्षपाती जेल बनाने से बचने के ( चित्र बीमें की तरह) । GTE में एक छेद घूंसा भी कौशल लेता है । ऊतक पंच ऊतक कभी नहीं उठा अगर ऊतक बहुत गीला है सकते हैं । एक ऊतक बायोप्सी प्रणाली या संदंश की एक जोड़ी मददगार होगा; हालांकि, घायल स्थान के आयाम काफी बदल जाएगा । यह भी एक छेद छिद्रण बिना THP-1 सेल कोलेजन मिश्रण इंजेक्षन करने के लिए तेज सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग करने के लिए संभव है (सुनिश्चित करें कि जेल सुई रोकना नहीं है).

इस विधि की सीमा है कि यह पूरी तरह से मसूड़े की सूजन और periodontitis की जटिल जैविक घटना का प्रतिनिधित्व करने में असमर्थ है, क्योंकि iGTE रक्त वाहिकाओं, न्यूरॉन कोशिकाओं, और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अभाव है, और सूजन के कारण नहीं है मेजबान-फिल्म बातचीत । हालांकि, यह केवल इन विट्रो मसूड़े की सूजन ऊतक मानव कोशिकाओं है कि आंशिक रूप से भड़काऊ gingiva की विकृति प्रस्तुत द्वारा बनाई गई मॉडल है । मॉडल के लिए और अधिक वास्तविक मसूड़े की सूजन और periodontal रोग के समान हो सकता है 1) सह-खेती GTE के साथ मेजबान-फिल्म बातचीत बनाने के लिए या iGTE में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं उत्तेजक एलपीएस का उपयोग करके (बाहरी झिल्ली में यौगिकों ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया और एक मजबूत सूजन सर्जक के रूप में हम प्रोटोकॉल में सुझाव दिया), 2) gingiva दांत परिसरों और देख कैसे gingiva में सूजन को प्रभावित करता है के रूप में कोलेजन-एचजीएफ समाधान बोने का तरीका कठिन ऊतक, और 3) का उपयोग कर GTE और iGTE के एपिडर्मिस बनाने के लिए मानव मसूड़ों उपकला कोशिकाओं.

यहां प्रस्तुत तरीकों के साथ, GTE और iGTE संस्कृतियों बहुमुखी उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है घाव भरने का अध्ययन, ऊतक पुनर्जनन, सूजन, सेल सेल संपर्क, और मसूड़े की सूजन और periodontal रोग के लिए संभावित दवाओं स्क्रीन ।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं की ।

Acknowledgments

इस काम के हिस्से में विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया (JSPS) अनुदान में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता (२६८६१६८९ और 17K11813) । लेखकों को ठीक करने के लिए श्री Nathaniel ग्रीन शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I-A Nitta Gelatin Inc For making dermis of GTE
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 11900073 Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm Corning, Inc. 353096 For tissue culture
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Cell culture reagent
DMEM Thermo Fisher Scientific 31600034 Cell culture medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Cell culture reagent
Tissue puncher Shibata system service co., LTD SP-703 For punching holes in GTE
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 31800022 Cell culture medium
BSA Sigma-Aldrich A3294 For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) Thermo Fisher Scientific R37605 For labeling nuclei
Fluorescence mount medium Dako For mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] abcam ab17139 For identifying epithelium
Scaning electron microscope Hitachi, Ltd. HITACHI S-4000 For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopy LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. LSM 700 For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibody abcam ab52625 For identifying epithelium
Anti-vimentin antibody abcam ab92547 For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibody Millipore CBL271 For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibody Sigma-Aldrich SAB2700244 For identifying macrophages
Human CD14 Antibody R&D Systems MAB3832-SP For identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody Thermo Fisher Scientific A11012 For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11001 For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific For observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cells Riken BRC cell bank RCB1189 For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) Sigma-Aldrich P8139 For differentiatting THP-1 cells

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References

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तीन आयामी भड़काऊ मानव ऊतक Gingiva के समकक्ष
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Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).More

Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).

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