Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Tredimensjonale inflammatorisk menneskelig vev ekvivalenter av Gingiva

doi: 10.3791/57157 Published: April 3, 2018

Summary

Målet med protokollen er å bygge en inflammatorisk menneskelige gingiva modell i vitro. Denne vev modellen dyrker co tre typer menneskelige celler, HaCaT keratinocytter, gingival fibroblaster og THP-1 makrofager, tredimensjonale vilkår. Denne modellen kan brukes til å undersøke periodontal sykdommer, som gingivitt og periodontitt.

Abstract

Periodontal sykdommer (som gingivitt og periodontitt) er de viktigste årsakene til tap av tenner hos voksne. Betennelse i gingiva er den grunnleggende physiopathology av periodontal sykdommen. Aktuelle eksperimentelle modeller av periodontal sykdommen er etablert i ulike typer dyr. Physiopathology dyr modeller er imidlertid forskjellig fra mennesker, gjør det vanskelig å analysere cellulære og molekylære mekanismer og evaluere nye medisiner for periodontal sykdommen. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å rekonstruere menneskelig inflammatorisk vev ekvivalenter av gingiva (iGTE) i vitro. Vi bygger først menneskelig vev ekvivalenter av gingiva (GTE) ved å bruke to typer menneskelige celler, inkludert menneskelige gingival fibroblaster (HGF) og menneskelig hud epidermal keratinocytter (HaCaT), under tredimensjonale forhold. Vi skaper en såret modell ved et vev-puncher til å slå et hull i GTE. Neste, menneskelige THP-1 monocytter blandet med kollagen gel er injisert inn i hullet i GTE. Ved adimistration av 10 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 72 h, THP-1 celler differensiert i makrofager til skjemaet inflammatorisk foci i GTE (iGTE) (IGTE også kan være stumilated med 2 µg/mL lipopolysaccharides (LPS) for 48 timer å starte betennelse ). IGTE er den første i vitro modellen av inflammatoriske gingiva menneskelige celler med en tredimensjonal arkitektur. IGTE gjenspeiler store patologiske forandringer (immunocytes aktivitetene, intracellulær interaksjon mellom fibryoblasts, epitelceller, monocytter og makrofager) i periodontal sykdommer. GTE, sårede GTE og iGTE kan brukes som allsidig verktøy for å studere sårheling, vev gjenfødelse, betennelse, celle-celle samhandling og skjermen potensielle medisiner for periodontal sykdommen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Periodontal sykdommer er den ledende årsaken til tap av tenner hos voksne. Gingivitt og periodontitt er de vanligste periodontal sykdommene. Begge presentere biofilm-mediert akutt eller kronisk inflammatorisk endringer i gingiva. Gingivitt er preget av akutt betennelse, mens periodontitt vanligvis presenterer som kronisk betennelse. På histologiske nivå utløse bakteriell komponenter aktivering av immunceller, som makrofager, lymfocytter, plasma celler og mastceller1,2. Disse immunceller, spesielt makrofager, samhandle med lokale celler (inkludert gingival epitelceller, fibroblaster, endotelceller og osteoblasts) som resulterer i inflammatoriske lesjoner i periodontale vev3,4. Eksperimentelle modeller av periodontal sykdommen er etablert i ulike typer av dyr, som rotter, hamstere, kaniner, oppspore, hjørnetann og primater. Physiopathology dyr modeller er imidlertid forskjellig fra mennesker, gjør det vanskelig å analysere cellulære og molekylære mekanismer og evaluere nye medisiner periodontal sykdommer5. Co dyrking av periodontal bakterier og monolayer menneskelig muntlig epitelceller er brukt til å undersøke mekanisme periodontal infeksjoner6. Likevel mangler monolayer kulturer av muntlig celler tredimensjonale (3D) mobilnettet arkitektur intakt vev; Derfor kan de etterligner i vitro situasjonen.

Her, opprettes 3D inflammatorisk menneskelig vev ekvivalenter av gingiva (iGTE) representerer periodontal sykdommer i vitro. Denne 3D-modell av periodontal sykdommen har en mellomliggende beliggenhet mellom monolayer cellekulturer og dyr modeller. Tre typer menneskelige celler, inkludert HaCaT keratinocytter, gingival fibroblaster og THP-1 makrofager, er co dyrket på kollagen gel, og stimulert av inflammatoriske initiativtakerne til å bygge iGTE. IGTE simulerer tett i vivo forhold til celledifferensiering, celle-celle samhandling og macrophage aktivering i gingiva. Denne modellen har mange mulige programmer for screening og teste nye farmakologiske tilnærminger i periodontal sykdommer og analysere cellulære og molekylære mekanismer i sårheling, betennelser og vev gjenfødelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokollen er utformet for å opprette menneskelig gingival vev ekvivalenter, gingival såret modeller og gingivitt modeller. Menneskelig hud epidermal keratinocytter (HaCaT) fotograferingen fra Professor Norbert E. Fusenig av Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Tyskland)7. Menneskelig gingival fibroblaster (HGFs) ble isolert fra gingival vev etter publisert tidligere protokoller8. Informert samtykke ble innhentet på forhånd, og studien ble godkjent i henhold til retningslinjer satt av de etiske komité i Nippon Dental University School of Life Dentistry på Tokyo (Autorisasjonsnummer: NDU-T2012-35). Protokollen trinn 1-3 skal utføres i celle kultur hette.

1. forberedelse av 3D menneskelig vev ekvivalenter av Gingiva (GTE) (figur 1A)

  1. Mix kollagen type en gel med 10% konsentrert MEM-alfa og 10% rekonstruksjon buffer (2,2 g NaHCO3 og 4.47 g HEPES i 100 mL 0,05 N NaOH) i en 15 mL steril tube av pipettering. Holde blandet kollagen løsningen på is inntil brukt.
  2. Plass 24-brønnen inserts (pore størrelse 3.0 µm) i en 24-vel plate.
  3. Fjern HGFs fra kultur overflaten med 0,25% trypsin-EDTA løsning. Suspendere cellene i 10 mL av kultur medium A (MEM-alfa + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Telle celler av en Bürker-Türk celle teller.
    1. Trekke ut ønsket antall celler (1-5 x105 celler/mL), og deretter virvel i 4 min 190 x g.
    2. Suspendere cellene i blandet kollagen løsningen. Holde blandingen på is til neste trinn.
  4. Legg til 0,5 mL av celle-kollagen blandingen (0,5-2.5 x 105 celler/vel) inn kultur innsatsen uten å produsere bobler. Inkuber blandingen for 10-30 min med en fuktet atmosfære med 5% CO2 på 37 ° C å tykne blandingen i en gel.
    Merk: Legg kollagen blandingen inn i sentrum av kultur sette å unngå ulike dannelsen av kollagen gel.
  5. Legg 1 mL av kultur medium i godt og 0,5 mL inn innsatsen. Inkuber kultur plate for 24 timer eller over natten i en fuktet atmosfære med 5% CO2 på 37 ° C.
  6. Fjerne HaCaT celler fra kultur overflaten med 0,25% trypsin-EDTA løsning. Suspendere cellene i 10 mL av middels B (DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX) og telle celler. Ekstra antallet celler (1-5 x 105 celler/mL) med en pipette, sentrifuge for 4 min på 190 x g. suspendere cellene i middels B.
  7. Fjerne mediet fra kultur skivene, som inneholder HGF-kollagen blandingen, av aspirasjon. Legg til 0,5 mL HaCaT celle suspensjon (0,5-2.5 x 105 celler/vel) på HGF-kollagen blandingen. Inkuber kulturer for 24 timer eller over natten.
    Merk: På dette tidspunkt, mediet i kulturen vel bør være middels A, mens mediet i kultur innsatsen bør være middels B.
  8. Erstatte kultur medium med KSR medium (co kultur medium) (MEM-alfa + 15% KnockOut Serum erstatning + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Legg 1 mL av kultur medium i kulturen godt og 0,5 mL inn kultur innsatsen. Inkuber kulturer for 24 48 h.
  9. Erstatte kultur medium med KSR medium + 1% FBS. Legg 1 mL i kulturen godt og 0,5 mL inn kultur innsatsen. Inkuber kulturer for 24 timer eller over natten.
  10. Erstatte kultur medium i kulturen med 0,7-1 mL KSR medium. Fjerne mediet helt fra kultur innsatsen (kultur overflaten bør utsettes til luft). Inkuber kulturer i 1-2 uker. Endre mediet i kulturen vel to ganger per uke.
    Merk: Ikke la det middels nivå stiger over kultur overflaten (det øverste laget består av keratinocytter). Alltid holde kultur overflaten tørr.

2. utarbeidelse av sårede GTE (figur 1B)

  1. Forberede en 1-3 mm diameter vev puncher. Steriliseres med en autoklav ved 121 ° C i 20 min.
  2. Presse vev puncher vinkelrett i GTE om 300 µm dyp, og slå et hull i vevet til å simulere et sår.
  3. I dette trinnet kan du bruke den sårede GTE for å undersøke sår helbredelse og vev gjenfødelse. Alternativt, fikse GTE med 10% formalin nøytral buffer løsning for å utføre histologiske analyse.

3. forberedelse av inflammatoriske GTE (iGTE) (figur 1B)

  1. Dyrke THP-1 celler i henhold til forrige rapport9.
  2. Mix kollagen type en gel med 10% konsentrert RPMI 1640, 10% rekonstruksjon buffer (2,2 g NaHCO3 og 4.47 g HEPES i 100 mL 0,05 N NaOH) og 10 ng/mL PMA. Holde blandet kollagen løsningen på is til bruk.
  3. Antall 1-2 x 106 THP-1 celler og sentrifuge for 4 min på 190 x g. suspendere cellene i 1 mL av blandet kollagen løsningen. Holde blandingen på is til neste trinn.
  4. Legg 10-30 µL THP-1-kollagen blandingen inn i såret området av GTE. Erstatte kultur medium til 0,7-1 mL KSR medium som inneholder 10 ng/mL av PMA.
  5. Inkuber blandingen i en fuktet atmosfære med 5% CO2 på 37 ° C 72 h.
  6. Bruke modellen for å undersøke Gingivitt eller periodontal sykdom (for eksempel legge til potensielle anti-inflammatorisk medisin til iGTE å se dens virkning på cytokin utgivelsen10). Eventuelt utelate 72 h PMA-behandling, legge 2 µg/mL av LPS i kulturen og ruge vevet i en fuktet atmosfære med 5% CO2 på 37 ° C for 48 h11,12.

4. fiksering og hele montere immunostai-GTE og iGTE kulturer

  1. Fiksering av kulturer.
    1. Fjerne kultur medium fra 24-vel plate. Vask vev 2 ganger med fosfat bufret saltvann (PBS).
    2. Legg 1 mL av 10% formalin nøytral buffer løsning på innsettingsknappen og 1 mL til kultur godt. La 24-vel platen i kjøleskap på 4 ° C over natten.
    3. Fjerne 10% formalin nøytral buffer løsning dagen.
    4. For hele mount immunostaining, vask vev 3 - 4 ganger med PBS etter fiksering.
    5. Hematoxylin og eosin (H & E) flekker og vanlige immunostai-, Fortsett med dehydrering, parafin innebygging og snitting.
      Merk: For hele mount immunostaining, dette trinnet kan utelates.
  2. Hele mount immunostaining
    Merk: Denne protokollen ble endret fra en referanse 13.
    1. Vask vev 3 x i PBS 0,5-1% Triton, 10-30 minutter hver gang.
    2. Inkuber vev to ganger for 30 min blokkerer buffer (PBS 1% Triton + 10% BSA), ved romtemperatur.
    3. Vask den vev 2 × i blokkering buffer, 5-10 minutter hver gang.
    4. Legge til 50 µL av primære antistoff løsning på nødvendige fortynning/konsentrasjonen skivene. Bruk en tynn plast plastfolie brytes som setter inn for å unngå uttørking vevet.
    5. Inkuber vevet i 1-2 dager på 4 ° C.
    6. Vask vev 3 ganger, i 30 min i PBS 1% Triton + 10% BSA. Vask igjen 3 ganger, i 5 min i PBS 1% Triton.
    7. Legge til 50 µL sekundære antistoff blokkerer buffer (PBS 1% Triton + 10% BSA) og 5 µL Hoechst 33342 løsning (NucBlue Live celle flekken) hvert sett inn. Bruk en tynn plast plastfolie brytes som setter inn for å unngå uttørking vevet.
    8. Inkuber for 1-2 dager på 4 ° C. Pakk 24-vel platen i våtserviett, og deretter sette det inn i en plast pack skal brukes gjennom inkubasjon.
    9. Vask vev 3 ganger, i 10 minutter på PBS 1% triton
    10. Bruk en skarp nål for å klippe membranen av kultur sette å få vevet. Plass membranen på et lysbilde.
      Merk: Vevet bør være på membranen.
    11. Legge til 2-3 dråper fluorescens mount medium. Dekk vev dekke glass og store på 4 ° C i mørket til analyse.
    12. Vis vev med en AC confocal mikroskopi (LSM) for laserskanning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HaCaT celler vises typisk keratinocyte morfologi under fase kontrast mikroskopiske observasjon (figur 2A). Skanner elektron mikroskop (SEM)-bildene viste at HaCaT celle overflater var dekket av mange microvilli. Intercellulære tilkoblinger mellom HaCaT celler var mediert av membran prosesser (figur 2B). HaCaT cellene uttrykte gingival epitel markør K8/1814, som angir at HaCaT celler er egnet for gingiva rekonstruksjon (figur 2C).

Figur 3A viser en vellykket eksempel på GTE, og figur 3B viser et mislykket eksempel på GTE. Mislykket rettssaken (figur 3B) er forårsaket av kollagen gel blandingen ikke legges i midten av kultur sette. Figur 3 c viste at en såret modell av GTE gjøres ved punching et hull i vevet med et vev puncher. H & E flekker (figur 3D) og SEM bilder (figur 3E) viste at dager dyrking, ca 10-20 lag av HaCaT celler skjemaet epitel og kollagen gel-embedded HGF celler skjemaet lamina propria. I lamina propria av den rekonstruerte GTE, HGF celler utstilt karakteristiske morfologi av fibroblaster (figur 3F) og var omgitt av veldefinerte matriser av kollagen fibrene (Figur 3 g). Immunofluorescence flekker viste at vimentin og TE-7 (begge er dermal fibroblast markører15) er uttrykt i lamina propria av GTE (figur 4A og 4B). K19, en bestemt markør til junctional og lomme epitel i periodontitt16, er svakt i epitel i GTE (figur 4C), og er sterkt uttrykt i epitel i iGTE (Figur 4 d). Dataene foreslo at HaCaT celler kan skille ut viktige epitelceller i periodontitt, spesielt etter inflammatorisk stimulering av lamina propria.

Inflammatorisk gingival sykdommer, som gingivitt og periodontitt, er histologisk preget av tilstedeværelsen av lymfocytter og makrofager og føre til fibrose og vev nekrose17,18. I denne protokollen, ble THP-1 celler brukt som den inflammatoriske celler for iGTE. Som vist i figur 5, uten PMA-stimulering, presentert THP-1 celler en monocytic morfologi og de fleste av dem fløt i medium (figur 5A). Derimot etter å bli utsatt for PMA 10 ng/mL 72 h, mer enn 50% av THP-1 celler differensiert i macrophage-lignende celler og overholdt på kultur overflaten (figur 5B). I likhet med HaCaT og HGF celler8, THP-1 vokste godt inside kollagen gel i co kultur medium (KSR medium) og differensiert i macrophage-lignende celler etter PMA-behandling (figur 5C). Immunostaining viste at adhered THP-1 cellene uttrykt CD68 (en markør makrofager19) (figur 5 d) og CD14 (en markør av makrofager) (figur 6). For å danne iGTE, var THP-1 monocytter innebygd i kollagen gel og injisert i hullet simulere et sår (figur 5E). På 72 h etter PMA (10 ng/mL)-stimulering, THP-1 celler differensiert i makrofager (figur 5F) i hullet simulere et sår og uttrykt CD68 (figur 5G), som angir kan skjemaet inflammatorisk foci i den sårede GTE.

Hele mount immunohistochemistry (figur 6) viste at THP-1 celler i hullet simulere et sår ikke bare uttrykte CD14 (en markør av makrofager), men også uttrykt vimentin samt fibroblaster kanten av hullet. Vimentin er uttrykt ved aktiv makrofager20. Data bekreftet at THP-1 makrofager er funksjonelle.

Figure 1
Figur 1: eksperimentell design. Eksperimentelle oppsett av 3D menneskelig vev ekvivalenter av gingiva (GTE) (A) og provoserende GTE (iGTE) (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: karakterisering av HaCaT keratinocytter. (A) kontrast mikroskopiske bildet av HaCaT celler i kultur. Skala bar = 50 µm. (B) SEM bilde av HaCaT celler. (C) Immunohistochemical farging av HaCaT celler for gingival tarmepitelet markør K8/18. Green, K8/18. Blå, DAPI. Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: karakterisering av 3D menneskelig vev ekvivalenter av gingiva (GTE). (A) eksempel på en vellykket GTE i kultur. Vevet er i kultur innsatsen. (B) eksempel på en mislykket GTE: del av GTE er atskilt fra vevet og forutinntatt mot veggen (rød pil). (C) såret GTE: gul pil som angir en hullet av vev puncher. (D) H & E farging av GTE dyrket i 19 dager (14 dager luft eksponering). Skala bar = 50 µm. (E) SEM bilde av en loddrett del av GTE dyrket i 19 dager. (F) kontrast mikroskopiske bildet av HGF celler i kollagen gel som dannet lamina propria av GTE. Skala bar = 25 µm. (G) SEM bilde av massiv kollagenfibre rundt HGF celler i lamina propria av GTE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: uttrykk for vimentin, TE-7 og K19 i GTE. Immunofluorescence farging av GTE lamina propria markører vimentin (A og B) og TE-7 (B) i GTE og epidermis markør K19 i GTE (C) og iGTE (D). Rød, vimentin og K19. Grønn TE-7. Blå, DAPI. E, overhuden; LP, lamina propria. Skala bar = 50 µm (A, C og D), 20 µm (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: karakterisering av THP-1 celler. (A) udifferensierte THP-1 celler i kultur. Skala bar = 15 µm. (B) differensiert THP-1 makrofager. Skala bar = 15 µm. (C) THP-1 celler innebygd i kollagen gel i KSR medium og behandlet med PMA for 24 h. skala bar = 50 µm. (D) Immunohistochemical farging av THP-1 makrofager for macrophage markør CD68. Rød, CD68. Blå, DAPI. Skala bar = 5 µm. (E) THP-1-kollagen blanding i såret hullet av HGE begynnelsen av PMA behandling. Skala bar = 25 µm. (F) THP-1 celler differensiert i makrofager (røde piler) på 72 h etter PMA behandling. Skala bar = 25 µm. (G) THP-1 cellene uttrykte macrophage markør CD68. Gul prikkelinje angir området av sårede hullet i H & E. skala bar = 100 µm. rød, CD68. Blå, hoechst 33342. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: karakterisering av iGTE. Hele mount immunohistochemistry for CD14 (grønn) og vimentin (rød) ble utført på iGTE. Z-serien bilder (C) tatt gjennom iGTE (416 µm totalt. Kontrollpanel 1 er den første delen LSM skannet panelet 25 er sist. Intervallet er ca 16.64 µm mellom deler). Representativt delen (A) (nr. 17 av Z-serien bildene), orthophoto og 3D-bilde av Z-stack (B) presentert 3D fordelingen av CD14 - og vimentin-positiv THP-1 makrofager i hullet simulere et sår i iGTE. Skanning plasseringen av LSM i iGTE angis i (D) og venstre øverst i (A). Skala bar = 50 µm. gul prikkete linjer angir området sårede hullet i iGTE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokollen er basert på metoder for å lage gingival vev ekvivalenter og underhud fettvev ekvivalenter beskrevet av tidligere rapporter8,21,22. Selv om dette er en enkel og lett, krever noen trinnene spesiell oppmerksomhet. For eksempel bør kollagen blandingen holdes på is til bruk for å unngå gel formasjonen i løsningen. Når du legger kollagen blandingen inn kultur innsatsen, kontroller at løsningen ble injisert i sentrum av innsatsen for å unngå danner en partisk gel (som i figur 3B). Punching hull i GTE tar ferdigheter. Vev puncher ikke kan noen ganger plukke opp vev Hvis vevet er for vått. Et vev biopsi system eller et par pinsett ville være nyttig; imidlertid endres dimensjonene på såret plasseringen mye. Det er også mulig å bruke en sprøyte med skarpe nålen for å injisere THP-1 celle-kollagen blandingen uten punching et hull (Kontroller at gel ikke tette nålen).

Begrensning av denne metoden er ikke perfekt representerer de komplekse biologiske fenomenene gingivitt og periodontitt, fordi iGTE mangler blodkar, neuronal celler og andre immunceller, og betennelse skyldes ikke den Host-biofilm interaksjoner. Det er imidlertid bare i vitro gingivitt vev modellen laget av menneskelige celler som delvis presenterer patologi inflammatorisk gingiva. Modellen kan endres for å være mer lik den virkelige gingivitt og periodontal sykdom av 1) co dyrke GTE med biofilm opprette vert-biofilm interaksjoner eller stimulere inflammatorisk svar i iGTE ved hjelp av LPS (forbindelser i den ytre membranen av Gram-negative bakterier og en sterk inflammatorisk initiativtaker som vi antydet i protokollen), 2) seeding kollagen-HGF løsningen på utdraget tenner til skjemaet gingiva-tann komplekser og observere hvordan betennelser i gingiva påvirker vanskelig vev og 3) bruker menneskelige gingival epitelceller å danne epidermis GTE og iGTE.

Med metodene presenteres her, kan GTE og iGTE kulturer brukes som allsidig verktøy for å studere sårheling, vev gjenfødelse, betennelse, celle-celle samhandling og skjermen potensielle medisiner for gingivitt og periodontal sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklære noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet var støttes delvis av Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning (26861689 og 17 K 11813). Forfatterne vil gjerne takke Mr. Nathaniel Green for korrekturlesing.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I-A Nitta Gelatin Inc For making dermis of GTE
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 11900073 Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm Corning, Inc. 353096 For tissue culture
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Cell culture reagent
DMEM Thermo Fisher Scientific 31600034 Cell culture medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Cell culture reagent
Tissue puncher Shibata system service co., LTD SP-703 For punching holes in GTE
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 31800022 Cell culture medium
BSA Sigma-Aldrich A3294 For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) Thermo Fisher Scientific R37605 For labeling nuclei
Fluorescence mount medium Dako For mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] abcam ab17139 For identifying epithelium
Scaning electron microscope Hitachi, Ltd. HITACHI S-4000 For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopy LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. LSM 700 For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibody abcam ab52625 For identifying epithelium
Anti-vimentin antibody abcam ab92547 For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibody Millipore CBL271 For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibody Sigma-Aldrich SAB2700244 For identifying macrophages
Human CD14 Antibody R&D Systems MAB3832-SP For identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody Thermo Fisher Scientific A11012 For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11001 For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific For observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cells Riken BRC cell bank RCB1189 For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) Sigma-Aldrich P8139 For differentiatting THP-1 cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64, (1), 57-80 (2014).
  2. Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage. Frontiers in Immunology. 3, 118 (2012).
  3. Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: The role of the macrophage. Expert reviews in molecular medicine. 13, e23 (2011).
  4. Mescher, A. L. Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration. Regeneration. 4, (2), 39-53 (2017).
  5. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental Animal Models in Periodontology: A Review. The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).
  6. Han, Y. W., et al. Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells. Infection and Immunity. 68, (6), 3140-3146 (2000).
  7. Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106, (3), 761-771 (1988).
  8. Xiao, L., Miwa, N. Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment. Hum Cell. 30, (2), 72-87 (2017).
  9. Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26, (2), 171-176 (1980).
  10. Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease. J Periodontal Res. 44, (1), 21-27 (2009).
  11. Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56, (1), 45-50 (2007).
  12. Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol. 8, 1 (2007).
  13. Abcam. Whole mount fluorescent immunohistochemistry. Available from: http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2017).
  14. Shetty, S., Gokul, S. Keratinization and its disorders. Oman Med J. 27, (5), 348-357 (2012).
  15. Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study. J Clin Periodontol. 10, (4), 364-369 (1983).
  16. Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. J Periodontol. 78, (11), 2197-2202 (2007).
  17. Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochem. 56, (4), 347-358 (2008).
  18. Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37, (2), 257-270 (1974).
  19. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81, (6), 1607-1613 (1993).
  20. Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. Vimentin is secreted by activated macrophages. Nat Cell Biol. 5, (1), 59-63 (2003).
  21. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system. Biomaterials. 31, (23), 5976-5985 (2010).
  22. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent. Free Radic Biol Med. 51, (7), 1376-1389 (2011).
Tredimensjonale inflammatorisk menneskelig vev ekvivalenter av Gingiva
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).More

Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter