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Neuroscience

मध्य ंयूरॉन Axons में अध्ययन Varicosity गठन और वसूली के लिए एक Microbiomechanical प्रणाली

Published: April 30, 2018 doi: 10.3791/57202
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2
1Molecular, Cellular, and Developmental Biology Program, The Ohio State University, 2Department of Biological Chemistry and Pharmacology, The Ohio State University, 3Biogen

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक, दबाव द्रव दृष्टिकोण तेजी से और प्रतिवर्ती varicosities के ंयूरॉंस में प्रेरण ।

Abstract

Axonal varicosities axons की शाफ्ट के साथ विविधता के एक उच्च डिग्री के साथ बढ़े हुए संरचनाओं हैं । वे न केवल neurodegenerative रोगों या चोटों के साथ दिमाग में मौजूद हैं, लेकिन यह भी सामान्य मस्तिष्क में. यहां, हम एक नव स्थापित micromechanical प्रणाली का वर्णन तेजी से, मज़बूती से, और reversibly axonal varicosities प्रेरित, हमें varicosity गठन और विषम प्रोटीन संरचना शासी तंत्र को समझने की अनुमति । इस प्रणाली के एक उपंयास का प्रतिनिधित्व करता है ंयूरॉंस के विभिंन उपसेलुलर डिब्बों पर संपीड़न और कतरनी तनाव के प्रभाव का मूल्यांकन करने का मतलब है, अंय इन विट्रो प्रणालियों है कि मुख्य रूप से खींच के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित अंय से अलग । महत्वपूर्ण बात, हमारी प्रणाली की अनूठी विशेषताओं के कारण, हम हाल ही में एक उपंयास दिखा कि दबाव द्रव के आवेदन तेजी से और reversibly एक क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनल के सक्रियकरण के माध्यम से axonal varicosities प्रेरित कर सकते है खोज की है । हमारे यांत्रिक प्रणाली दवा छिड़काव, लाइव सेल इमेजिंग, कैल्शियम इमेजिंग, और पैच दबाना रिकॉर्डिंग के साथ संयोजन में आसानी से उपयोग किया जा सकता है । इसलिए, इस विधि mechanosensitive आयन चैनलों, axonal परिवहन विनियमन, axonal cytoskeleton गतिशीलता, कैल्शियम संकेतन, और दर्दनाक मस्तिष्क चोट से संबंधित रूपात्मक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए अपनाया जा सकता है ।

Introduction

Varicosity गठन, या सूजन/मनके, axons के साथ, कई विकारों या केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की चोटों में मनाया neurodegeneration की एक प्रमुख विशेषता है, कई स्केलेरोसिस सहित, अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, और दर्दनाक मस्तिष्क चोट1,2. कार्रवाई संभावित प्रसार और synaptic संचरण3पर axonal varicosities के महत्वपूर्ण शारीरिक प्रभावों के बावजूद, कैसे varicosities उत्पन्न कर रहे हैं अज्ञात रहता है. हाल ही में, एक नए स्थापित microbiomechanical हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस पर कुतर से, हमने पाया है कि यांत्रिक उत्तेजनाओं अत्यधिक पेचीदा सुविधाओं के साथ इन ंयूरॉंस में varicosities प्रेरित कर सकते है का उपयोग कर । पहले, varicosity प्रेरण तीव्र है (< 10 s) और यह प्रक्रिया अनपेक्षित रूप से प्रतिवर्ती है । दूसरा, varicosity दीक्षा दबाव puffing की ताकत पर निर्भर करता है: उच्च दबाव, तेजी से दीक्षा । तीसरा, varicosity दीक्षा न्यूरॉन उम्र पर निर्भर करता है । छोटे न्यूरॉन्स के axons अधिक यांत्रिक तनाव के लिए उत्तरदायी दिखाई देते हैं, पुराने न्यूरॉन्स की तुलना में. चौथा, हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के axons साथ varicosities फार्म, जबकि dendrites और इन न्यूरॉन्स के प्रारंभिक axon क्षेत्रों में एक ही puffing हालत के तहत कोई परिवर्तन प्रदर्शित. इस प्रकार, हमारे अध्ययन के एक उपंयास सुविधा का पता चला ंयूरॉन ध्रुवीयता । इन विट्रो प्रणाली के साथ इन निष्कर्षों को शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं । हल्के दर्दनाक मस्तिष्क चोट (mTBI) के लिए एक vivo में मॉडल का उपयोग कर, हम axonal varicosities एक बहु में विकसित किया गया है कि चूहों के तुरंत बाद बंद खोपड़ी प्रभाव के somatosensory प्रांतस्था में फोकल फैशन, हमारे इन विट्रो के साथ संगत परिणाम4. यह हमारे धुंधला और mTBI चूहों की इमेजिंग केवल एक यांत्रिक प्रभाव के दौरान vivo के समय में चूक इमेजिंग के प्रदर्शन के बाद से न्यूरॉन रूपात्मक परिवर्तन की एक तस्वीर शॉट प्रदान करते हैं कि ध्यान दें करने के लिए महत्वपूर्ण है अभी भी संभव नहीं है.

इस द्रव-puffing प्रणाली हमें न केवल अद्वितीय यांत्रिक तनाव प्रेरित varicosity गठन के साथ जुड़े सुविधाओं पर कब्जा करने की अनुमति दी है, लेकिन यह भी अंतर्निहित तंत्र का निर्धारण करने के लिए । विभिंन extracellular समाधान, ब्लॉकर्स और mechanosensitive आयन चैनलों के विभिंन उंमीदवारों के सलामी बल्लेबाजों का परीक्षण करके, और सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, हम पहचान की है कि क्षणिक रिसेप्टर संभावित कटियन चैनल उपपरिवार वी सदस्य 4 (TRPV4) चैनल है कि Ca के लिए पारगंय है2 + और ना+ और puffing द्वारा सक्रिय axonal varicosity गठन4के दौरान प्रारंभिक यांत्रिक तनाव का पता लगाने के लिए मुख्य रूप से जिंमेदार है । यह आगे एक सिरना नॉकआउट दृष्टिकोण के साथ की पुष्टि की थी । एक साथ लिया, इस नए परख प्रणाली हम हिप्पोकैम्पस ंयूरॉन संस्कृति के साथ विकसित की है, केंद्रीय ंयूरॉंस के micromechanical गुणों का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक मूल्यवान है, विशेष रूप से अंय तकनीकों के साथ संयोजन में ।

इस micromechanical प्रणाली हम स्थापित किया है अद्वितीय है और कई प्रमुख पहलुओं में पहले से मौजूद प्रणालियों से अलग है । सबसे पहले, इस प्रणाली में, न्यूरॉन्स संपीड़न और बाल काटना के रूपों में विमान यांत्रिक तनाव से बाहर का अनुभव. यांत्रिक प्रभाव के दौरान, न्यूरॉन प्रक्रियाओं coverslip सतह से जुड़े रहते हैं और कदम नहीं है. यह अंय प्रयोगात्मक प्रणालियों से अलग है कि मुख्य रूप से झुकने और में विमान खींच (या तनाव), उदाहरण के लिए, चलती तार की तरह बंडल axons के झुकाव5,6 या खींच axons पर हो micropatterned चैनल और स्ट्रेची झिल्ली7,8. इसके अलावा, हालांकि axonal varicosities भी हमारे द्रव-puffing प्रणाली में की तरह इन परख में प्रेरित किया जा सकता है, इन सेटिंग्स में इस प्रक्रिया में अधिक समय लगता है (से 10 मिनट के लिए कई घंटे6,7,8) और प्रकट होता है अपरिवर्तनीय. अंत में, हमारी प्रणाली स्थानीय द्रव puffing का उपयोग varicosity गठन की स्थानिक सुविधाओं की परीक्षा की अनुमति देता है (उदा, dendrites, वृक्ष spins, सोमा, axonal प्रारंभिक क्षेत्रों, axonal टर्मिनलों), इसके लौकिक सुविधाओं के अलावा । इस प्रणाली का प्रयोग, हम axonal varicosity गठन, विशेष रूप से तेजी से शुरुआत, धीमी गति से reversibility, और axon-dendrite ध्रुवीयता के कई अप्रत्याशित और अनूठी विशेषताओं की खोज की ।

प्रणाली है कि हम इस पत्र में चर्चा आणविक और कोशिका जीवविज्ञान की कई तकनीकों के साथ संगत है । उदाहरण के लिए, यांत्रिक तनाव के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए न्यूरॉन आकृति विज्ञान और समारोह पर, यह myelin coculture के साथ इस्तेमाल किया जा सकता, फ्लोरोसेंट अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) के समय चूक इमेजिंग, कैल्शियम इमेजिंग, और पैच दबाना रिकॉर्डिंग । इस पत्र में, हम प्रणाली के मुख्य घटकों पर ध्यान केंद्रित । हिप्पोकैम्पस ंयूरॉन संस्कृति, द्रव-puffing सेटअप, उच्च संकल्प समय चूक axonal परिवहन के लिए इमेजिंग, और कैल्शियम इमेजिंग कदम-दर-कदम नीचे सचित्र हैं ।

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Protocol

सभी तरीकों नीचे वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और ओहियो राज्य विश्वविद्यालय के उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

१. Coverslip तयारी

  1. ७०% नाइट्रिक एसिड युक्त एक ग्लास चोंच में 12 मिमी या 25 मिमी coverslips के एक या अधिक बक्से रखें और रात भर कमरे के तापमान पर coverslips की मशीन लगाएं ।
    नोट: एक ही यूरिन में 25 एमएम coverslips को 12 एमएम coverslips के रूप में न धोएं । उन्हें अलग से धोना बेहतर है ।
  2. सभी coverslips को ddH2O के २.५ l से भरे 4 एल यूरिन में ट्रांसफर करें और coverslips युक्त चोंच को 1 ज के लिए १०० आरपीएम पर हिलाएं । मिलाने के दौरान यूरिन को होल्ड करने के लिए रबर बैंड का प्रयोग करें । ताजा २.५ एल ddH के साथ कुल्ला दोहराएं2O चार बार ।
  3. ट्रांसफर को मेटल कवर के साथ सूखी कुप्पी तक जरुर coverslips । 6 घंटे के लिए २२५ ° c पर एक ओवन में coverslips सेंकना और उंहें कमरे के तापमान को शांत करने की अनुमति ।
    नोट: 25 एमएम coverslip को तोड़ने की आशंका है । एक और सूखी हवा के द्वारा एक अलग coverslips एक, तो एक ओवन में उंहें सेंकना ।
  4. उपयोग जब तक एक निष्फल प्लास्टिक कंटेनर में कमरे के तापमान पर सूखे और साफ coverslips की दुकान ।
  5. कोट coverslips निंनानुसार:
    1. एक केंद्रापसारक ट्यूब में ताजा कोटिंग समाधान तैयार करें ।
    2. एक में एक coverslip प्लेस 24 अच्छी तरह से (या 6 अच्छी तरह से) की थाली । प्लेस 30 (या १००) coverslip कोटिंग समाधान (1 टेबल) के µ एल पर एक 12 मिमी (या 25 मिमी) coverslip और भंवर । अच्छी तरह से बाँझ फॉस्फेट-खारा (पंजाबियों, टिशू कल्चर ग्रेड) के 1 मिलीलीटर जोड़ें । इन प्लेटों या तो तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या एक सप्ताह तक के लिए बाँझ पंजाब में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
    3. विच्छेदन के दिन, पंजाबियों को हटा दें । एयर-ड्राई और 2-4 एच के लिए यूवी लाइट (30W) के नीचे प्लेटें लगाएं ।
      नोट: पिछले कदम पर एक सेल संस्कृति लामिना प्रवाह हूड में यूवी प्रकाश के साथ पूरा किया जाना चाहिए । हुड का दरवाजा थोड़ा coverslips सुखाने के लिए हवा के प्रवाह की अनुमति के लिए उठाया जाना चाहिए ।

2. विच्छेदन, पृथक्करण, और हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के गर्भवती माउस से संस्कृति/

  1. संस्कृति के लिए हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की विच्छेदन और पृथक्करण
    1. गल को छेड़ो एंजाइम समाधान (3 मिलीग्राम/एमएल SLDS में 23, तालिका 1) और पूर्व गर्म चढ़ाना मीडिया (तालिका 2) ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
    2. काटना हिप्पोकैम्पस और SLDS के साथ कुल्ला, पिछले प्रकाशन14में वर्णित विधियों के अनुसार ।
      नोट: चार hippocampi १ २४-well या एक 6 अच्छी तरह से थाली के लिए पर्याप्त कोशिकाओं प्रदान करते हैं ।
    3. SLDS निकालें, को चिढ़ाने एंजाइम समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें, और ३७ ° c, 5% सह 15 मिनट के लिए2 पर नमूना मशीन ।
    4. हिप्पोकैम्पस explants को दो बार चढ़ाना मध्यम की 5-10 मिलीलीटर से धोएं । मध्यम चढ़ाना के 5 मिलीलीटर जोड़ें । अलग कर देना हिप्पोकैम्पस एक छोटे से एक 1 मिलीलीटर प्लास्टिक टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग कर भंवर पैदा करके एकल कोशिकाओं में explants । पिपेट ऊपर और नीचे के बारे में ४० बार, ऑक्सीजन बुलबुले के गठन से परहेज, जब तक समाधान बादल बन जाता है और explant के कोई बड़े टुकड़े रह जाते हैं ।
      नोट: कुछ मीडिया को बहाकर ले जाने के दौरान याद रखें, हिप्पोकैम्पस explants पूरी प्रक्रिया के दौरान मध् यम में जलमग्न रहना चाहिए ।
    5. 3 मिनट के लिए १,१२५ x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । supernatant को मीडिया में जलमग्न कक्षों के साथ निकालें । चढ़ाना मीडिया के १४५ मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड । एक 24-अच्छी तरह से प्लेट के लिए सेल सस्पेंशन की 1 एमएल/अच्छी तरह से जोड़ें (एक 6-अच्छी प्लेट के लिए 3 मिलीलीटर/
      नोट: चढ़ाना मीडिया के १४५ मिलीलीटर एक सेल निलंबन है कि एक कम सेल घनत्व है उत्पादन के लिए प्रयोग किया जाता है । यह मात्रा ६ २४ में कोशिकाओं के चढ़ाना-अच्छी तरह से प्लेटें, आठ 6 अच्छी तरह से प्लेटें, या 24-या 6 के विभिंन संयोजनों की अनुमति होगी अच्छी तरह से प्रयोग के आधार पर प्लेटें आयोजित किया जाना है । 24-खैर प्लेट के प्रत्येक कुआं के बारे में 3 x 104 कोशिकाओं9होगा ।
    6. ३७ ° c, 5% CO2 में 2-4 h के लिए चढ़ाना मीडिया में कोशिकाओं की मशीन, तो सभी चढ़ाना मीडिया को हटाने और यह ताजा रखरखाव मीडिया के साथ बदल जाते हैं ।
    7. 2 दिनों के बाद ( इन विट्रो में2 दिन, 2DIV), 2 µ एम आरा के साथ मीडिया के आधे की जगह-सी (arabinosylcytosine) रखरखाव मीडिया में भंग जो fibroblasts, endothelial, और glial कोशिकाओं के विकास को रोकता है । दो दिनों के लिए आरा-सी के लिए कोशिकाओं को उजागर करने के बाद, ताजा रखरखाव मीडिया के साथ मीडिया की जगह ।
  2. कक्ष आकृति विज्ञान के दृश्य के लिए अभिकर्मक
    नोट: Transfect हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP), mCherry, आदि के लिए व्यक्तिगत ंयूरॉंस की आकृति विज्ञान रोशन के फ्लोरोसेंट के निर्माण के साथ कोशिकाओं ।
    1. शेयर से निर्माण पतला (1 µ g/µ एल) Opti में-मेम मीडिया (µ के ५० Opti एल में निर्माण के ०.८ µ जी-मेम मीडिया) और भंवर । एक अच्छी तरह के लिए 1 निर्माण कमजोर पड़ने तैयार ।
      नोट: एक 24-खैर प्लेट Opti के ५० µ एल में निर्माण के ०.८ µ जी की आवश्यकता है-मेम मीडिया । एक 6-खैर प्लेट १५० µ एल Opti-मेम मीडिया में निर्माण के २.४ µ जी की आवश्यकता है ।
    2. पतला liposome-Opti में मध्यस्थता अभिकर्मक एजेंट-मेम मीडिया (अभिकर्मक के ५० µ एल में Opti रिएजेंट के १.५ µ एल-मेम मीडिया) और भंवर । एक अच्छी तरह के लिए 1 अभिकर्मक कमजोर पड़ने तैयार ।
      नोट: एक 24-well थाली Opti-मेम मीडिया के ५० µ एल में अभिकर्मक रिएजेंट के १.५ µ एल की आवश्यकता है । एक 6-खैर प्लेट Opti-मेम मीडिया के १५० µ एल में अभिकर्मक रिएजेंट के ४.५ µ एल की आवश्यकता है ।
    3. एक 1:1 मिश्रण (१०० µ एल) तैयार Opti में निर्माण की-मेम मीडिया और अभिकर्मक Opti में एजेंट-मेम मीडिया और भंवर । 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण की मशीन ।
      नोट: प्रति अच्छी तरह से, वहां के बारे में होना चाहिए १०० µ का निर्माण युक्त समाधान के एल, अभिकर्मक एजेंट, और Opti-मेम मीडिया अगर एक 24 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग कर (6 के लिए ३०० µ एल अच्छी तरह से थाली) ।
    4. मीडिया के आधे निकालें (24 अच्छी तरह से थाली के लिए ५०० µ एल, 6 के लिए १.५ मिलीलीटर-अच्छी तरह से प्लेट) एक अच्छी तरह से और एक स्वच्छ शंकु ट्यूब में इस मीडिया हस्तांतरण । इस ट्यूब मशीन में रखो । उसके बाद १०० µ एल मिक्सचर (step 2.2.3) को वेल में बचे हुए मीडिया में डालें । कोशिकाओं को ३७ ° c में 20-30 मिनट के लिए मशीन की अनुमति दें ।
    5. मशीन (step 2.2.4) के दौरान, शंकु ट्यूब (step 2.2.4) में मीडिया के लिए ताजा अनुरक्षण मीडिया की एक मात्रा जोड़ें । एक ही मशीन में मिश्रण प्लेस (३७ ° c और 5% सह2).
    6. मशीन के बाद, सभी कुओं से अभिकर्मक समाधान युक्त मीडिया को हटा दें और इसे शंकु ट्यूब (step 2.2.5) में पुराने और ताजा रखरखाव मीडिया के 1:1 मिश्रण के साथ बदलें ।
      नोट: निर्माण के आकार के आधार पर, कोशिकाओं 12 ज के भीतर व्यक्त शुरू हो सकता है; बड़ा निर्माण के लिए, 3-4 दिन की जरूरत हो सकती है पहले निर्माण की चोटी अभिव्यक्ति तक पहुंच गया है ।

3. कश पिपेट तंत्र की स्थापना

नोट: इस सेट अप करने के लिए पांच बुनियादी घटक हैं: ग्लास पिपेट, टयूबिंग, सिरिंज, micromanipulator, और बफर (है हांक) । किसी भी बफर कि शारीरिक रूप से प्रासंगिक नमक सांद्रता है इस सेट अप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. एक borosilicate पिपेट खींचो के आसपास ४५-µm व्यास खोलने टिप एक micropipette खींचने और तालिका 3में विनिर्देशों का उपयोग कर ।
    नोट: यह पाया गया कि ४५ µm प्रयोगात्मक शर्तों के तहत पिपेट खोलने के व्यास के लिए एक उपयुक्त आकार है । उद्घाटन के आकार में मामूली बदलाव काफी परिणाम को प्रभावित नहीं करना चाहिए । यह महत्वपूर्ण है कि इस नंबर से बड़ा प्रस्थान अभी भी varicosity प्रेरण के लिए सिरिंज कि टयूबिंग के माध्यम से पिपेट से जुड़ा हुआ है की ऊंचाई का समायोजन करके काम करना चाहिए, लेकिन यह दबाव मूल्य के reअंशांकन की आवश्यकता होगी ।
  2. पिपेट के संयुक्त राष्ट्र-खींच अंत पतली रबर टयूबिंग में डालें ।
    नोट: टयूबिंग दीवार पतली और तरल प्रतिरोध को कम करने के लिए कठोर होना चाहिए, सुनिश्चित करना है कि सिरिंज की ऊंचाई सीधे नगण्य प्रतिरोध के साथ पिपेट के माध्यम से बहने द्रव के दबाव के लिए आनुपातिक है. टयूबिंग अब लंबाई में के बारे में ०.६ मीटर की तुलना में आगे प्रतिरोध को कम करने के लिए होना चाहिए ।
  3. एक 10 मिलीलीटर प्लास्टिक एक बारी-सक्षम वाल्व के साथ एक संबंधक के माध्यम से सिरिंज के लिए टयूबिंग के दूसरे छोर से कनेक्ट करें ।
    नोट: प्लास्टिक सिरिंज के लिए एक स्थिर, औसत दर्जे का ऊंचाई पर आयोजित की पिपेट से बह ग्रहण दबाव के लिए एक सटीक उपाय सुनिश्चित करने की जरूरत है । १९० mm की ऊंचाई का उपयोग किया गया था, क्योंकि यह ंयूनतम दबाव प्रदान करता है, लेकिन मज़बूती से axons में varicosities लाती है । अंय ऊंचाई मान भी इस्तेमाल किया जा सकता है अगर दबाव कोशिकाओं coverslip सतह से अलग करने के लिए कारण । यह प्रयोग में एक ही सेटिंग का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है ।
  4. पिपेट को micromanipulator के पेंच टॉप में डालने के लिए पिपेट जगह पर रखें । पेंच धातु, फ्लैट सबसे ऊपर micromanipulator हाथ से जुड़ी पेंच इतना है कि यह संयुक्त राष्ट्र धारण बस ऊपर जहां रबर टयूबिंग संलग्न है पिपेट के अंत खींच लिया । पिपेट को न्यूरॉन युक्त coverslips की सतह के साथ एक ४५ ° कोण पर कोण ।
    नोट: micromanipulator का निर्माण किया जाना चाहिए ताकि पिपेट रबर टयूबिंग कसना के बिना आयोजित किया जा सकता है । micromanipulator x, y, और z दिशाओं में पिपेट की गति की अनुमति चाहिए सही यह कोशिकाओं की सीमा के भीतर की स्थिति । एक ग्राफिक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपकरण की एक तस्वीर नीचे प्रदान की जाती है (चित्रा 1).
  5. एक प्रतिदीप्ति फिल्टर पर मुड़ें, एपर्चर खुला है, और एक फ्लोरोसेंट जगह सुनिश्चित उद्देश्य के माध्यम से आ रहा देखा जा सकता है । micromanipulator का प्रयोग, एक स्थिति में पिपेट कदम है कि लाइनों फ्लोरोसेंट जगह के साथ टिप और कम सिर्फ सेल संस्कृति डिश (३५ मिमी x 10 मिमी) की ऊंचाई से ऊपर की स्थिति में पिपेट । एक बार जब यह स्थिति में है, संचरित प्रकाश पर बारी और बंद प्रतिदीप्ति ।
  6. चिमटी का उपयोग करना, सेल संस्कृति थाली से कोशिका संस्कृति प्लेट से एक coverslip (पिपेट की ओर का सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ) कक्ष के तापमान पर है हांक बफर के बारे में 2 मिलीलीटर युक्त जोड़ें ।
  7. क्षेत्र पर coverslip युक्त संस्कृति पकवान प्लेस ।
  8. ठीक फोकस घुंडी और 20X उद्देश्य का उपयोग करना, चार पूर्ण कोशिकाओं के ऊपर बदल जाता है के बारे में एक विमान पर ध्यान केंद्रित (के बारे में ०.४ mm) । पिपेट टिप ताकि यह ध्यान केंद्रित है और केंद्र में, बाएं विमान के रूप में आंख के माध्यम से देखा के हाथ की ओर की स्थिति के लिए micromanipulator का उपयोग करें ।
    नोट: Dendrites अनुमानों कि कोशिका शरीर वे से शुरू के रूप में एक ही फ्रेम में होना चाहिए रहे हैं । axonal varicosities प्रेरित करने के लिए, एक सेल शरीर से औसत दर्जे का और बाहर axons के लिए अब अनुमानों का पालन करना चाहिए ।

4. एक खिंचाव-झिल्ली प्रणाली का उपयोग पिपेट के दबाव को जांचना

  1. सेटअप एक microfabricated सिलिकॉन झिल्ली (व्यास में ५०० µm और ५० µm मोटी) युक्त एक प्रणाली पर ऊपर वर्णित के रूप में सटीक एक ही मापदंडों के साथ puffing पिपेट तंत्र और झिल्ली की सतह पर माइक्रोस्कोप ध्यान केंद्रित ।
    नोट: इस प्रणाली के छोटे दबाव मूल्यों को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया था और सिस्टम का एक स्पष्टीकरण10से पहले प्रकाशित किया गया है । यह माप केवल puffing की सटीक एक ही सेटिंग उपयोग किया जाता है, तो प्रयोगों के लिए एक बार किया जाना चाहिए ।
  2. microdots के arrays पर माइक्रोस्कोप ध्यान केंद्रित (4 व्यास में µm और 10 µm अलावा, के रूप में केंद्रों के बीच मापा) । बंद करो वाल्व बारी और द्रव पिपेट से बाहर प्रवाह करने के लिए अनुमति देते हैं । एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ तरल पदार्थ के दबाव के जवाब में झिल्ली के विक्षेपन की जांच करें ।
  3. झिल्ली के विक्षेपन के साथ जुड़े इसी दबाव का निर्धारण करने के लिए एक रैखिक मॉडल का उपयोग.
    नोट: जबकि हाल के एक अध्ययन में पाया गया है कि डब्ल्यू के एक विक्षेपन =-३.१४३ ± ०.६९ µm १९० mm सिरिंज की ऊंचाई के लिए प्राप्त किया गया था, इस के दबाव का उत्पादन ०.२५ ± ०.०६ एनएन/µm2 वर्तमान पिपेट सेटअप से, जो शारीरिक और रोग रेंज के भीतर है, हालांकि सिरिंज की ऊँचाई एकमात्र निर्धारक नहीं है. अंय कारकों न्यूरॉन्स पर सटीक दबाव मूल्य के रूप में अच्छी तरह से प्रभाव, पिपेट खोलने, स्थिति (दूरी और पिपेट टिप के कोण) कोशिकाओं के सापेक्ष सहित, और यहां तक कि4टयूबिंग का लचीलापन,10।

5. कश लगाने के लिए प्रेरित Varicosities

  1. एक बार पिपेट स्थिति में है, एक हवाई जहाज है कि ब्याज की एक क्षेत्र शामिल है पर माइक्रोस्कोप ध्यान केंद्रित । स्थिति कोशिकाओं और इमेजिंग क्षेत्र के बाएं आधे में प्रक्रियाओं (कैमरे के लाइव कैप्चर द्वारा देखा) puffing क्षेत्र के भीतर है, जबकि सही आधा puffing क्षेत्र के बाहर है ।
    नोट: axons और न्यूरॉन्स की dendrites की व्यापक वृद्धि के कारण, यह संभावना नहीं है कि एक ंयूरॉन के सभी प्रक्रियाओं को एक ही puffing क्षेत्र के भीतर हैं । यह वास्तव में इस प्रणाली है, जो puffing के स्थानीय प्रभाव की परीक्षा की अनुमति देता है की एक लाभ है । varicosities के लिए प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि puffing के दो प्रकार के होते हैं: लंबी अवधि के कश और नाड़ी puffing ।
  2. Puffing
    1. लम्बी अवधी कश
      1. ऊंचाई पर सिरिंज की स्थिति, coverslip से युक्त १९० मिमी ऊपर कल्चरल न्यूरॉन्स4. एक अनुकूलित जोखिम समय स्पष्ट न्यूरॉन आकृति विज्ञान खुलासा के साथ ब्याज के क्षेत्र की समय चूक इमेजिंग शुरू करो । आधार रेखा के रूप में एक 2 s अंतराल (30 s कुल) पर कम से 15 फ़्रेम कैप्चर । प्रयोग के आधार पर अंतराल समायोजित किया जा सकता है । 16 फ्रेम में, सिरिंज की बारी-सक्षम बंद वाल्व खोलने के लिए और द्रव ७५ फ्रेम (१५० s) के लिए प्रवाह करने के लिए अनुमति देते हैं । ७५ फ्रेम में, वाल्व बंद इतना है कि द्रव प्रवाह बंद हो जाता है । वीडियो कैप्चर रोकें ।
        नोट: यह axonal varicosities न्यूरॉन्स में प्रेरित करना चाहिए 7-9 DIV 5-10 s के भीतर, जबकि पुराने ंयूरॉंस लंबे समय लेने के लिए varicosities फार्म ।
    2. नाड़ी (2 s duration) कश
      1. उचित ऊंचाई पर सिरिंज की स्थिति (१९० mm) । समय-चूक इमेजिंग शुरू करें और एक 2 s अंतराल पर कम से 15 फ्रेम (30 s) पर कब्जा । 16 फ्रेम में, सिरिंज के वाल्व खोलने के लिए और तरल पदार्थ को प्रवाह करने के लिए अनुमति देते हैं, तो 2 एस इंतजार के बाद वाल्व बंद (परीक्षण किया जा करने के लिए आवृत्ति के आधार पर) वाल्व फिर से खोलने से पहले. दोहराएं खोलने और वाल्व के समापन द्रव दालों बनाने के लिए, और 150-300 एस की कुल अवधि के लिए जारी रखें समय चूक इमेजिंग 20 मिनट के लिए वसूली मंच पर कब्जा करने के लिए जारी रखें ।
        नोट: जब अंतराल 10 s से अधिक है, दालों काफी कम varicosities पैदा करते हैं । एक 20 एस अंतराल पर, कोई varicosities दालों से प्रेरित किया जा सकता है4. विश्वसनीय, सुसंगत varicosity गठन प्राप्त करने के लिए, यह सिरिंज की ऊंचाई १९० mm के आसपास होना चाहिए की सलाह दी है । सिरिंज की ऊंचाई और द्रव दबाव एक बिंदु है जहां कोशिकाओं coverslip सतह से अलग शुरू करने के लिए नहीं उठाया जाना चाहिए.
    3. उपयोग के एक दिन पहले, सेट अप (पिपेट, टयूबिंग, और सिरिंज) के बारे में 10 मिलीलीटर ७०% से ऊपर बह द्वारा सेट अप साफ । इथेनॉल धोने के बाद, प्रवाह है हांक बफर के 10 मिलीलीटर (या वांछित बफर) के माध्यम से स्थापित करने के लिए प्रधानमंत्री उस दिन के उपयोग के लिए प्रणाली । दिन के लिए प्रयोग खत्म करने के बाद, सेट साफ के रूप में पहले इथेनॉल के साथ वर्णित करने के लिए दूषित पदार्थों के विकास को रोकने के लिए रातोंरात ।

6. तारीफ के तरीके

नोट: puffing परख विभिंन तकनीकों है कि परिचय अनुभाग में चर्चा कर रहे है की एक किस्म के साथ जोड़ा जा सकता है । यहां, ध्यान मूल तकनीक है कि सबसे अधिक बार एक साथ कश परख, उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति डीकॉक इमेजिंग, कैल्शियम इमेजिंग, और वसूली परख सहित, के साथ प्रयोग किया जाता है पर है । ये नीचे चर्चा कर रहे हैं ।

  1. नीचे प्रोटोकॉल का पालन करके उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट समय चूक इमेजिंग आचरण
    1. एक 100X तेल लेंस के साथ ंयूरॉंस के भीतर फ्लोरोसेंट-टैग प्रोटीन के आंदोलन को ट्रैक । न्यूरॉन्स उचित सीडीएनए निर्माण के साथ transfected हैं. 2 s अंतराल के साथ १५० फ़्रेम (कुल ३०० s) के लिए कैप्चर ।
      नोट: कभी-कभार, एकाधिक-रंग समय-चूक इमेजिंग एक साथ एक से अधिक फ्लोरोसेंट-टैग किए गए प्रोटीन के आंदोलन की छवि के लिए किया जाता है ।
    2. कोई kymograph या तो वीडियो कैप्चरिंग सॉफ़्टवेयर के माध्यम से या ImageJ (NIH) के माध्यम से जनरेट करें ।
      नोट: गति और यात्रा की दिशात्मकता kymograph का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है । * पर कब्जा कर लिया क्षेत्र से सोमा झूठ दिशा नोट करने के लिए सुनिश्चित करें. सोमा की ओर यात्रा प्रतिगामी है, जबकि axonal टिप को सोमा से दूर यात्रा anterograde है ।
    3. इस प्रक्रिया को दोहराएं निंनलिखित puffing, या एक kymograph कश परख के दौरान छवि पर कब्जा का उपयोग कर बनाया जा सकता है ।
      नोट: mitochondria और synaptic प्रोटीन के axonal परिवहन पर puffing के प्रभाव हाल ही में एक पेपर4में दिखाया गया ।
  2. कैल्शियम इमेजिंग
    1. जोड़ें 1 µ एल (एक 24 के लिए अच्छी तरह से प्लेट) या 3 µ एल (एक 6 के लिए अच्छी तरह से प्लेट) 5 मिमी Fluo की-4 हूं संस्कृति मीडिया के लिए एक अच्छी तरह से और ३७ ° c में 30 मिनट के लिए मशीन ।
    2. 1 मिलीलीटर हांक के बफर के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें ।
      नोट: लोड न्यूरॉन्स एक FITC फिल्टर सेट के माध्यम से हरी प्रतिदीप्ति फेंकना. Loci सेल के भीतर प्रशंसनीय कैल्शियम के क्षेत्रों निरूपित । जब puffing के साथ संयुक्त, तीव्रता में वृद्धि (आंतरिक कैल्शियम के स्तर में वृद्धि) देखा जा सकता है ।
  3. Varicosity रिकवरी
    नोट: तुरंत एक puffing प्रयोग के बाद, एक 20 मिनट वसूली प्रयोग किया जा सकता है ।
    1. एक 4 एस अंतराल के साथ ३०० फ्रेम (१,२०० s) के लिए छवियों पर कब्जा ।
      ध्यान दें: एक कोशिका transfected घुलनशील YFP/mCherry/GFP के साथ एक मध्यम स्तर दिखाना चाहिए (से कम ५०%) की वसूली इमेजिंग सत्र के अंत तक । Axonal वसूली कारकों की एक संख्या पर निर्भर करता है, जैसे कि कल्चरल न्यूरॉन्स के विकासात्मक चरण4. यह भी उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट इमेजिंग और कैल्शियम इमेजिंग ऊपर वर्णित के साथ संयुक्त किया जा सकता है ।

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Representative Results

puffing से पहले, axons आम तौर पर थोड़ा varicosity गठन दिखाओ । हमारे मानक दबाव (१९० mmH2O ऊंचाई) के साथ puffing के बाद, axons कई varicosities की तरह मनका विकसित करने के लिए शुरू करते हैं । varicosities के गठन आंशिक रूप से प्रतिवर्ती है, के रूप में अपने पूर्व के लिए लौट axon के क्षेत्रों द्वारा दिखाया गया है एक 10 मिनट वसूली अवधि के बाद राज्य (चित्रा 2a-B) । वसूली की एक लंबी अवधि के बाद (> 20 मिनट), कुछ axons पूरी तरह से ठीक हो । puffing पिपेट के साथ ही मंच के ऊपर १९० मिमी पर सिरिंज की सटीक स्थिति के उपइष्टतम स्थिति तेजी से varicosities उत्पन्न नहीं हो सकता है. इष्टतम शर्तों युवा न्यूरॉन्स के axons में varicosity गठन में परिणाम चाहिए (लगभग 7 DIV) के बारे में 5 एस में4.

Figure 1
चित्र 1 : योजनाबद्ध और कश तंत्र की तस्वीर । (क) समग्र माइक्रोस्कोप सेट अप दिखा तस्वीरें. (ख) पिपेट ग्लास micromanipulator द्वारा आयोजित की और रबर टयूबिंग से जुड़े दिखा तंत्र puffing । (ग) प्राथमिक हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस के विमान में ध्यान के साथ चरण कंट्रास्ट छवियां नीचे दाईं ओर पिपेट की छाया दिखा । (घ) सेल विमान के बाहर पिपेट टिप puffing पर ध्यान केंद्रित । (ई) varicosities उत्प्रेरण के लिए दूरी और परिकलित दबावों की योजनाबद्धता । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : varicosity गठन के प्रतिनिधि छवियां निंनलिखित puffing । (क) 7DIV की इमेजिंग, GFP transfected माउस हिप्पोकैम्पस एक axon पूर्व दिखा ंयूरॉंस और बाद कश के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक 10 मिनट वसूली अवधि के बाद । (ख) (क) में न्यूरॉन की समय-चूक इमेजिंग की Kymograph. लाल तीर varicosities संकेत करता है कि निंनलिखित का गठन किया है १५० एस के १९० mmH2हे puffing (30 एस में शुरुआत) । स्केल बार = 15 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Coverslip कोटिंग समाधान
७८० µ l एसिटिक acid17 mM स्टॉक: ५० µ एल एसिटिक एसिड में ५० एमएल के एच2ओ
२०० µ l पाली-डी-lysine (०.५ mg/एमएल स्टॉक)
20 µ l चूहा पूंछ कोलेजन (3 मिलीग्राम/
कुल मात्रा लेपित किया जा करने के लिए coverslips की संख्या के आधार पर निर्धारित होता है ।

तालिका 1: Coverslip कोटिंग समाधान. coverslip कोटिंग coverslips के लिए प्रसंस्कृत कोशिकाओं का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया समाधान तैयार करने के लिए नुस्खा प्रदान करता है ।

1x टुकड़ा विच्छेदन समाधान (SLDS), फ़िल्टर्ड, पीएच = ७.४, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
1 L ddH२हे
८२ एमएम ना2तो4
30 एमएम K2सू4
10 एमएम HEPES (मुक्त अम्ल)
10 एमएम D-ग्लूकोज
5 मिमी MgCl2
०.००% Phenol लाल (ऐच्छिक)
चढ़ाना मीडिया (प्रधानमंत्री, फ़िल्टर, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर)
४३९ एमएल मेम है अर्ल साल्ट
५० एमएल FBS
११.२५ एमएल 20% D-ग्लूकोज
5 मिलीलीटर सोडियम पाइरूवेट (१०० मिमी,)
६२.५ µ l L-glutamine (२०० मिमी)
5 मिलीलीटर पेनिसिलिन/Streptomycin (P/S, 100x)
रखरखाव मीडिया (मिमी, फिल्टर, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर)
४८४ एमएल Neurobasal
10 मिलीलीटर B27 50x पूरण
१.२५ एमएल L-glutamine (२०० मिमी)
5 मिलीलीटर 100x पी एस/
सभी समाधान ०.२ mm ताकना आकार के साथ एक फिल्टर का उपयोग कर निष्फल रहे हैं ।

तालिका 2: सेल संस्कृति मीडिया व्यंजनों । प्राथमिक हिप्पोकैम्पस ंयूरॉन कोशिकाओं के संवर्धन में उपयोग मीडिया तैयार करने के लिए व्यंजनों प्रदान करता है ।

है हांक बफर (फ़िल्टर, पीएच = ७.४, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
१५० एमएम Nacl
4 मिमी KCl
१.२ एमएम MgCl2
1 मिमी CaCl2
10 मिलीग्राम/एमएल D-ग्लूकोज
20 एमएम HEPES

तालिका 3: है हांक बफर नुस्खा । कश प्रोटोकॉल में और लाइव सेल इमेजिंग के दौरान उपयोग बफर तैयार करने के लिए नुस्खा प्रदान करता है ।

पिपेट खींच पैरामीटर
गर्मी खींच वेग देरी दबाव रैंप
५०१ 0 15 1 ५०० ५३०

तालिका 4: पिपेट pulling पैरामीटर्स. पैरामीटर पिपेट खींचने पर सेट करने के लिए एक खोलने कि व्यास में लगभग ४५ µm है प्राप्त करने के लिए प्रदान करता है ।

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Discussion

इस microbiomechanical परख की प्रक्रिया सीधे आगे है । यह विश्वसनीय परिणाम का उत्पादन होगा, अगर सभी अपने कदम ध्यान से किया जाता है । वहां कई महत्वपूर्ण कदम है कि, अगर अनुचित तरीके से प्रदर्शन किया, सफल डेटा संग्रह में बाधा होगी रहे हैं । महत्वपूर्ण कदम puffing उत्तेजना के वास्तविक आवेदन के ऊपर शुरू करते हैं । सावधान विच्छेदन, संवर्धन, और प्राथमिक ंयूरॉन संस्कृति की देखभाल सर्वोपरि हैं । यदि प्रसंस्कृत ंयूरॉंस स्वस्थ नहीं हैं, वे लगातार प्रतिक्रिया नहीं है, क्योंकि वे पहले से ही तनाव के लिए प्रधानमंत्री हो सकता है । संस्कृति के बहाव, प्रारंभिक सेट अप और puffing तंत्र के अंशांकन अनुरूप दबाव प्रदान करने के लिए, कि varicosities प्रेरित लेकिन coverslip सतह से कोशिकाओं की टुकड़ी का कारण नहीं होगा, धैर्य के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए । सेट अप के सटीक अंशांकन पिपेट कॉलेस्ट्रॉल, टयूबिंग, या वाल्व मुद्दों के कारण 1 ज लग सकता है । यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि द्रव पिपेट से बाहर बहती डिश में कोशिकाओं को रखने और पिपेट टिप स्थिति के साथ आगे बढ़ने से पहले ंयूनतम प्रतिरोध के साथ । जहां तक सेट अप करने के लिए संशोधनों का संबंध है, एक छिड़काव के साथ puffing उपकरण जोड़ी कर सकते हैं, पैच clamping, और किसी भी अंय माइक्रोस्कोप आधारित साधन, ज्यादातर शारीरिक अंतरिक्ष पर मुक्त माइक्रोस्कोप के पक्षों पर निर्भर है ।

इस प्रणाली के दो आंतरिक सीमाएं है कि ध्यान देने की जरूरत है । सेट अप लगातार कोशिकाओं को puffing द्रव के माध्यम से प्रसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के axons में प्रतिवर्ती varicosities के गठन की शुरुआत कर सकते हैं. हालांकि, यह ध्यान दें कि एक ही puffing क्षेत्र के भीतर ंयूरॉंस पर सटीक दबाव मूल्यों समान नहीं है महत्वपूर्ण है । तरल पदार्थ दबाव है कि कोशिकाओं को प्रभावित करता है, एक microfabricated सिलिकॉन झिल्ली से दबाव लोड माप के आधार पर गणना4,10, puffing क्षेत्र के केंद्र में औसत दबाव का प्रतिनिधित्व करता है । इस प्रकार, सटीक puffing दबाव puffing क्षेत्र के केंद्र में सबसे अधिक है और क्षेत्र के किनारे के आसपास सबसे कम है । हमने दिखाया है कि दबाव ताकत शुरुआत, आकार, और varicosities प्रेरित की संख्या के साथ संबद्ध4। उच्च दबाव तेजी से शुरू होने के परिणामस्वरूप, बड़ा है, और अधिक प्रचुर मात्रा में varicosities4। हमारे हाल के अध्ययनों में, हम puffing पिपेट की नोक पर एक ंयूनतम दबाव (१९० mmHg) का इस्तेमाल किया है कि अभी भी मज़बूती से सबसे axons4में varicosities प्रेरित कर सकते हैं । इस हालत के तहत, युवा ंयूरॉंस के लिए varicosity शुरुआत आम तौर पर 5 एस के बारे में है । यह ध्यान रखें कि सटीक एक ही puffing प्रणाली के साथ, शुरुआत के समय के मूल्य भिंन हो सकते हैं, जो न केवल न्यूरॉन प्रकार, उम्र, और सेलुलर डिब्बे पर निर्भर करता है, लेकिन यह भी puffing क्षेत्र में ंयूरॉन की स्थिति से प्रभावित किया जा सकता है महत्वपूर्ण है । कश दबाव ंयूरॉंस द्वारा प्राप्त की भिंनता के बावजूद, इस परख प्रणाली अभी भी केंद्रीय ंयूरॉंस पर यांत्रिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय साधन प्रदान करता है, और पैदावार अत्यधिक सुसंगत और reproducible प्रयोगात्मक परिणाम ।

व्यवस्था की दूसरी सीमा इसके कॉलेस्ट्रॉल मुद्दा है. शारीरिक रूप से प्रासंगिक दबाव प्राप्त करने के लिए, पिपेट के उद्घाटन, ४५ माइक्रोन के आसपास छोटा है । हालांकि, छोटे खोलने के लिए प्लास्टिक टयूबिंग और पिपेट टिप में मलबे से मलबे के साथ रोकना आदत स्पष्ट रूप से माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है । यह सेट prepping समय की मात्रा बढ़ जाती है, एक पिपेट रोकना की स्थिति में । इसलिए, सिरिंज, टयूबिंग, और पिपेट में रखे जाने से पहले सभी समाधानों को सावधानीपूर्वक फ़िल्टर किया जाता है. यह भी शुरू और दिन के अंत में ७०% इथेनॉल के साथ puffing प्रणाली धोने महत्वपूर्ण है, फ़िल्टर्ड है हांक बफर के साथ धोने के बाद । संभावित कॉलेस्ट्रॉल समस्या को हल करने के लिए, हम कई पिपेट खींचने की कोशिश कर सुझाव देते हैं । यह पुष्टि करने के लिए आवश्यक है कि समाधान वास्तव में प्रयोग शुरू करने से पहले दृश्य के माध्यम से पिपेट से बाहर फूला हुआ है । एक बार एक अच्छा puffing प्रणाली की स्थापना की है, यह आमतौर पर दिन के बाकी के लिए पिछले कर सकते हैं ।

इस यांत्रिक परख, न्यूरॉन संस्कृति के साथ संयुक्त, मध्य ंयूरॉन mechanosensation नकल उतार शारीरिक और/या pathophysiological शर्तों के अध्ययन के लिए एक अनूठा अवसर प्रस्तुत करता है । इस प्रणाली हमें संपीड़न के प्रभाव और न्यूरॉन्स पर बाल काटना की जांच करने के लिए अनुमति देता है । इसके विपरीत, अन्य प्रणालियों5,6,7खींच में विमान की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया. इस puffing क्षेत्रों के केंद्र में न्यूरॉन्स द्वारा प्राप्त औसत दबाव ०.२५ ± ०.०६ एनएन/µm2 हमारे सिस्टम4में है । इस दबाव कोशिकाओं पर लागू करने के लिए तुलनीय हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के लोचदार मापांक के रूप में पहले से ही बल माइक्रोस्कोपी और थोक rheology स्कैनिंग उपयोग मापा, ऑप्टिकली प्रेरित विकृति की पहचान करने के लिए13,14, साथ ही इन विट्रो में neurite अग्रणी किनारों के विकास में परिवर्तन करने के लिए इस्तेमाल किया दबाव, बल माइक्रोस्कोप स्कैनिंग द्वारा मापा (०.२७ ± ०.०४ एनएन µm)16. यह दबाव है कि स्वाभाविक रूप से एक E11 भ्रूण में mesenchymal कोशिकाओं द्वारा उत्पंन किया जा सकता है दबाव से अधिक नहीं है, के रूप में यांत्रिक विशिष्ट फ्लोरोसेंट कोशिका के आकार का उपयोग कर मापा तेल microdroplets (१.६ ± ०.८ एनएन/µm)2,14।

इस प्रणाली को पहले से ही सफलतापूर्वक कैल्शियम इमेजिंग, पैच clamping, इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोप, और सेलुलर विश्लेषण के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया है एक बंद खोपड़ी mTBI माउस मॉडल4। परख भी माइक्रोस्कोप के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है आधारित प्रयोगों, photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली के रूप में (frap है), प्रोटीन की जांच करने के लिए बारी-varicosities के भीतर खत्म हो, साथ ही साथ अध्ययन झल्लाहट अगर प्रोटीन प्रोटीन बातचीत बदल रहे है varicosity गठन के दौरान । मूलतः, किसी भी विधि है कि एक खुर्दबीन और एक जीवित सेल इमेजिंग सेट अप का उपयोग किया जा सकता है इस कश परख के साथ जोड़ा जा सकता है । इस परख की बहुमुखी प्रतिभा micromechanical तनाव से ंयूरॉन आकृति विज्ञान और कार्यों पर विभिंन प्रभाव अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने में अत्यधिक मूल्यवान है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

सभी पशु प्रयोग स्वास्थ्य पशु उपयोग दिशानिर्देश के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार आयोजित किया गया है । यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01NS093073 और R21AA024873) सी. गुजरात से अनुदान द्वारा हिस्से में समर्थन किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mm coverslips  Warner Instruments  64-0702 for 24-well plate 
25 mm coverslips  Fisher Scientific  12-545-102  for 6-well plate 
Acetic acid Fisher Scientific  A38-212
Poly-D-lysine Sigma  P6407
Rat tail collagen  Roche  11 179 179 001 
10X PBS  National Diagnostics  CL-253
Na2SO4 Fisher Scientific  S373-500
K2SO4 Fisher Scientific  P304-500
HEPES  Fisher Scientific  BP410-500
D-glucose  Fisher Scientific  D16-500
MgCl2 Fisher Scientific  BP214-500
NaOH Fisher Scientific  SS255-1
Protease enzyme  Sigma  P4032
FBS Gibco  26140
Sodium pyruvate  Gibco  11360-070
L-glutamine  Gibco  25030081
Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) Gibco  15140122
MEM Earle's Salts  Gibco  11090
B27 supplement  Gibco  17504-044
Neurobasal  Gibco  21103-049
Arabinosylcytosine (Ara-C) Sigma  147-94-4
Opti-MEM media  Gibco  31985-070
Lipofectamine 2000 Invitrogen  1854313 transfection reagent 
Borosilicate rods  World Precision Instruments Inc.  PG52151-4 for puffing pipette 
rubber tubing  Fisher Scientific  14-169-1A
10cc plastic syringe and plunger Becton Dickinson 
micromanipulator  Sutter Instruments 
NaCl  Fisher Scientific  S640-3
KCl  Fisher Scientific  BP366-500
CaCl2 Fisher Scientific  C70-500
Cell culture dish (35 mm x 10 mm) Corning  3294
Fluo-4 AM Molecular Probes F14201 for calcium imaging 
Mito-YFP construct  Takara Bio Inc.  for cell transfection 
YFP-N1 construct  Takara Bio Inc.  for cell transfection 
Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller  Sutter Instruments 
Eclipse TE2000-U Mcroscope  Nikon
Plan Fluor ELWD 20x lens   Nikon 062933 objective 
Apo TIRF 100x/1.49 oil lens  Nikon MRD01991 objective 

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References

  1. Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat. Med. 17, 495-499 (2011).
  2. Yang, J., et al. Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin. Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).
  3. Debanne, D. Information processing in the axon. Nat. Rev. Neurosci. 5, 304-316 (2004).
  4. Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation. J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).
  5. Chung, R. S., et al. Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy. J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).
  6. Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury. Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).
  7. Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).
  8. Donkin, J. J., Vink, R. Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments. Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).
  9. Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).
  10. Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis. J. Micromech. Microeng. 23, 015002 (2013).
  11. Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
  12. Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
  13. Franze, K., et al. Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact. Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).
  14. Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).

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मध्य ंयूरॉन Axons में अध्ययन Varicosity गठन और वसूली के लिए एक Microbiomechanical प्रणाली
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Servello, D., Gu, Y., Gu, C. A… More

Servello, D., Gu, Y., Gu, C. A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons. J. Vis. Exp. (134), e57202, doi:10.3791/57202 (2018).

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