Summary
Denne protokollen beskriver en fysiologisk relevant, trykksatt væske tilnærming for rask og reversibel induksjon av varicosities i neurons.
Abstract
Axonal varicosities er forstørret strukturer langs skaft av axons med en høy grad av heterogenitet. De finnes ikke bare i hjernen med nevrodegenerative sykdommer eller skader, men også i normal hjernen. Her beskriver vi en nyopprettede micromechanical systemet raskt, pålitelig og reversibel indusere axonal varicosities, tillater oss å forstå mekanismene som styrer varicosity formasjon og heterogene protein komposisjon. Dette systemet representerer en roman betyr å evaluere effekten av komprimering og skjær stress på forskjellige subcellular deler av neurons, forskjellig fra andre i vitro systemer som hovedsakelig fokuserer på effekten av strekking. Viktigere, på grunn av de unike funksjonene til systemet gjort vi nylig et romanen funn viser at programmet trykksatt væske kan raskt og reversibel induserer axonal varicosities gjennom aktivering av en forbigående reseptor potensielle kanal. Biomekaniske systemet kan benyttes enkelt i kombinasjon med narkotika perfusjon, levende celle bildebehandling, kalsium bildebehandling og patch klemme opptak. Denne metoden kan derfor vedtas for å studere mechanosensitive ionekanaler, axonal transport regulering, axonal cytoskjelett dynamics, kalsium signalering og morfologiske endringer relatert til traumatisk hjerneskade.
Introduction
Varicosity formasjon eller hevelse/beading, langs axons, er et fremtredende trekk ved neurodegeneration observert i mange lidelser eller skader av det sentrale nervesystemet, inkludert multippel sklerose, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, og traumatisk hjernen skade1,2. Til tross for betydelige fysiologiske virkningene av axonal varicosities på handlingen potensial forplantning og synaptic overføring3er hvor varicosities genereres ukjent. Nylig fant bruker en nyopprettede microbiomechanical analysen på kulturperler hippocampus neurons fra gnagere, vi at mekanisk stimuli kan indusere varicosities i disse neurons med svært spennende funksjoner. Først varicosity induksjon er rask (< 10 s) og denne prosessen er uventet reversibel. Andre varicosity innvielsen avhenger av styrken puffing Press: Jo høyere trykket, jo raskere oppstart. Tredje varicosity innvielsen, avhenger av neuronal alder. Axons yngre neurons vises mer mottagelig for mekanisk stress, sammenlignet med de eldre neurons. Fjerde, viser skjemaet varicosities langs axons hippocampus neurons, mens dendrites og første axon segmenter av disse neurons ingen endring under forutsetning av samme puffing. Dermed avdekket vår studie en roman trekk av neuronal polaritet. Disse funnene med i vitro systemet er fysiologisk relevante. Bruker en i vivo modell for mild traumatisk hjerneskade (mTBI), viste vi at axonal varicosities utviklet i Multi-Focal mote i somatosensory cortex av mus umiddelbart etter Lukk-skallen innvirkning, forenlig med våre i vitro resultater4. Det er viktig å merke seg at vårt flekker og bildebehandling av mTBI mus bare gir snap shot av nevrale morfologiske forandringer, siden utfører i vivo tidsinnstilt bildebehandling av neuronal morfologi under en mekanisk effekt er fortsatt ikke mulig.
Væske-damper systemet tillot oss ikke bare å fange unike funksjoner knyttet til mekanisk stress-indusert varicosity formasjonen, men også å bestemme den underliggende mekanismen. Ved å teste ulike ekstracellulære løsninger, stopper og openers forskjellige kandidater mechanosensitive ionekanaler og mobilnettet elektrofysiologi, identifisert vi at forbigående reseptor potensielle kasjon kanal gruppe V medlem 4 (TRPV4) kanal som er permeabel Ca2 + og Na+ og aktivert ved puffing er hovedsakelig ansvarlig for å oppdage første mekanisk stress under axonal varicosity formasjon4. Dette ble ytterligere bekreftet med siRNA knockout tilnærming. Tatt sammen dette nye analysen systemet vi har utviklet med hippocampus Nevron kultur, er svært verdifull for å studere micromechanical egenskapene til sentrale neurons, spesielt i kombinasjon med andre teknikker.
Micromechanical systemet har vi etablert er unik og forskjellig fra tidligere eksisterende systemene i flere viktige aspekter. Først i dette systemet oppleve neurons ut-av-plane mekanisk stress i form av komprimering og skråstilling. Under den mekaniske påkjenninger, neuronal prosesser være knyttet til dekkglassvæske overflaten og flytte ikke. Dette er forskjellig fra andre eksperimentelle systemer som hovedsakelig involvert bøying og strekking i flyet (eller spenning), for eksempel nedbøyning av medfølgende axons som flytte strenger5,6 eller strekke axons dyrket på micropatterned kanaler og elastisk membraner7,8. Videre, selv om axonal varicosities kan også bli indusert i disse analyser som i væske-damper systemet, prosessen i disse innstillingene tar mye mer tid (fra 10 minutter til flere timer6,7,8) og vises irreversible. Til slutt systemet bruker lokale væske puffing tillater undersøkelse av romlige funksjonene til varicosity dannelse (f.eks., dendrites, dendrittiske spines, soma, axonal første segmenter, axonal terminaler), foruten dens timelige funksjoner. Bruke dette systemet, oppdaget vi flere uventede og unike funksjoner i axonal varicosity formasjon, spesielt raskt innsettende, langsom Reversibilitet og axon-dendrite polaritet.
Systemet som vi diskutere i dette papiret er kompatibel med mange teknikker av molekylære og cellen biologi. For eksempel for å studere effekten av mekanisk stress på neuronal morfologi og funksjon, kan det brukes sammen med myelin coculture, time-lapse imaging fluorescerende resonans energioverføring (bånd) og total intern refleksjon fluorescens (TIRF), kalsium bildebehandling, og oppdateringen klemme opptak. I dette papiret fokusere vi på de viktigste komponentene i systemet. Hippocampus Nevron kultur, væske-damper oppsett, høyoppløselig tidsinnstilt bildebehandling axonal transport og kalsium imaging illustrert trinnvise nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet nedenfor har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Ohio State University.
1. dekkglassvæske forberedelse
- Plasser én eller flere bokser av 12 mm eller 25 mm coverslips i et glass beaker med 70% salpetersyre og ruge coverslips i romtemperatur over natten.
Merk: Ikke vask 25 mm coverslips i samme begeret som 12 mm coverslips. Det er bedre å vaske dem separat. - Overføre alle coverslips til en 4 liters kanne fylt med 2.5 L ddH2O og riste begeret inneholder coverslips 1t 100 RPM. Bruke gummi band til å holde begeret under risting. Gjenta skylling med fersk 2.5 L ddH2O fire ganger.
- Overføre renset coverslips til en tørr kolbe med et metall cover. Stekes coverslips i en ovn ved 225 ° C i 6 h og la dem avkjøles til romtemperatur.
NOTE 25 mm dekkglassvæske er utsatt for å bryte. Skille coverslips ettall lufttørke, og stek dem i en ovn. - Lagre det tørket og renset coverslips ved romtemperatur i en sterilisert plastbeholder før bruk.
-
Pels i coverslips som følger:
- Forberede frisk belegg løsningen i en sentrifuge rør.
- Plass hver dekkglassvæske i en brønn av en 24-godt (eller 6-vel) plate. Plass 30 (eller 100) µL dekkglassvæske belegg løsning (tabell 1) på en 12 mm (eller 25 mm) dekkglassvæske og virvel. Legge til 1 mL steril fosfat-bufret saltoppløsning (PBS, vev kultur klasse) i brønnen. Disse platene kan enten brukes umiddelbart eller lagret på 4 ° C i sterilt PBS for opptil en uke.
- Ved disseksjon, fjerne PBS. Air-Dry og plasser platene under UV-lys (30W) for 2-4 h.
Merk: Det siste trinnet skal fullføres med UV-lampen i celle kultur laminær strømning hette. Døren til panseret skal løftes litt for å tillate luftstrøm for tørking av coverslips.
2. disseksjon, dissosiasjon og kultur av hippocampus Neurons fra gravid mus/rotten
-
Disseksjon og av hippocampus neurons for kultur
- Tine protease enzym løsning (3 mg/mL protease 23 i SLDER, tabell 1) og pre varme plating media (tabell 2) på 37 ° C.
- Dissekere hippocampus og skyll med SLDER, ifølge metodene som er beskrevet i forrige publikasjonen14.
Merk: Fire hippocampi gi nok celler for en 24-brønn eller en 6-vel plate. - Fjerne SLDER legge 2 mL protease enzym løsning og ruge prøven ved 37 ° C, 5% CO2 i 15 min.
- Vask hippocampus explants med 5-10 mL plating middels to ganger. Legge til 5 mL plating medium. Distansere hippocampus explants i enkeltceller ved å generere en liten virvelen med en pipette med 1-mL plast tips. Pipetter opp og ned om lag 40 ganger, unngå dannelse av oksygen bobler, til løsningen blir skyet og ingen store deler av explant forbli.
Merk: Husk å la noen medier under vasker, hippocampus explants bør være neddykket i medium under hele prosessen. - Sentrifuge cellene 1125 x g for 3 min. Fjern nedbryting med celler neddykket i media. Resuspend cellene i 145 mL plating media. Legge til 1 mL/godt av cellen suspensjon i en 24-vel plate (3 mL/vel til en 6-vel plate).
Merk: 145 mL plating media brukes til å produsere en celle suspensjon som har en lav celle tetthet. Dette volumet vil tillate at belegget av celler i seks 24-vel plater, åtte 6-vel plater eller ulike kombinasjoner av 24 - eller 6-godt plater avhengig av eksperimentene gjennomføres. Hver brønn av 24-og platen har ca 3 x 104 celler9. - Inkuber cellene i plating media ved 37 ° C, 5% CO2 for 2-4 h, og Fjern alle plating medier og erstatte den med ferske vedlikehold media.
- Etter 2 dager (2 dager i vitro, 2DIV), erstatte halvparten av media med 2 µM Ara-C (arabinosylcytosine) oppløst i vedlikehold media som hemmer veksten av fibroblaster, endothelial og glial celler. Etter utsette celler til Ara-C for to dager, erstatte media med fersk vedlikehold media.
-
Hva for visualisering av celle morfologi
Merk: Transfect cellene med fluorescerende konstruksjoner av grønne fluorescerende protein (GFP), gul fluorescerende protein (YFP), mCherry, etc. å belyse morfologi av individuelle neurons.- Fortynne konstruksjoner fra lager (1 µg/µL) i Opti-MEM media (0,8 µg av Konstruer i 50 µL Opti-MEM medier) og vortex. Forberede 1 konstruere fortynning for hver brønn.
Merk: En 24-vel plate krever 0,8 µg av konstruere i 50 µL Opti-MEM medier. En 6-vel plate krever 2,4 µg av konstruksjon i 150 µL Opti-MEM medier. - Fortynne liposome-mediert transfection reagens Opti-MEM media (1,5 µL av transfection reagensen i 50 µL Opti-MEM medier) og vortex. Forberede 1 transfection fortynning for hver brønn.
Merk: En 24-vel plate krever 1,5 µL av transfection reagensen i 50 µL Opti-MEM medier. En 6-vel plate krever 4,5 µL av transfection reagensen i 150 µL Opti-MEM medier. - Forbered en 1:1 blanding (100 µL) av Konstruer i Opti-Mem media og hva reagens i Opti-MEM media og vortex. Inkuber blandingen ved romtemperatur for 20 min.
Merk: Per Vel, bør det være ca 100 µL av løsningen inneholder konstruksjon, hva reagens og Opti-MEM media hvis bruker en 24-vel plate (300 µL for 6-vel plate). - Ta halvparten av media (500 µL for 24-vel plate, 1,5 mL for 6-vel plate) fra hver brønn og overføre dette mediet til en ren konisk rør. Holde dette røret i inkubator. Deretter legge til 100 µL blandingen (trinn 2.2.3) gjenværende media i brønnen. At cellene å ruge på 37 ° C i 20-30 min.
- Under incubation (trinn 2.2.4), legge til en mengde frisk vedlikehold media media i konisk røret (trinn 2.2.4). Sett blandingen i samme inkubator (37 ° C og 5% CO2).
- Etter inkubasjon, Fjern alle medier som inneholder Hva løsningen fra brønnene og erstatte den med 1:1 blanding av gammel og ny vedlikehold media i konisk tube (trinn 2.2.5).
Merk: Avhengig av sammensetningene, cellene kan begynne uttrykke innen 12 timer; for større konstruksjoner kreves 3-4 dager før toppen uttrykket av sammensetningene er nådd.
- Fortynne konstruksjoner fra lager (1 µg/µL) i Opti-MEM media (0,8 µg av Konstruer i 50 µL Opti-MEM medier) og vortex. Forberede 1 konstruere fortynning for hver brønn.
3. sette opp Puffing Pipette apparatet
Merk: Det finnes fem grunnleggende komponenter i dette oppsettet: glass pipette, slangen, sprøyten, micromanipulator og bufferen (Hank's). En buffer som er fysiologisk relevante salt konsentrasjoner kan brukes i dette oppsettet.
- Dra en borosilicate pipette å ha rundt 45-µm-diameter åpning tips bruke en brønnene avtrekker og spesifikasjonene i tabell 3.
Merk: Det ble funnet at 45 µm er en størrelse diameteren på pipette åpning under eksperimentelle forhold. Små variasjoner i åpningen størrelsen skal ikke påvirke resultatene. Det er viktig å merke seg at større avganger fra dette nummeret skal fortsatt fungere for varicosity induksjon ved å justere høyden på sprøyten som er knyttet til pipette via rør, men dette vil kreve rekalibrering press verdien. - Un trakk nederst på pipette inn tynn gummi tubing.
Merk: Rør veggen bør være tynn og å minimere væske motstanden, slik at høyden på sprøyten er direkte proporsjonal med presset av væske som strømmer gjennom pipette ubetydelig motstand. Slangen skal ikke lenger enn ca 0.6 m lengde ytterligere redusere motstand. - Koble den andre enden av slangen til et 10-mL plastsprøyte gjennom en kobling med en turn-stand ventil.
Merk: Plastsprøyte må holdes i en konstant, målbare høyde å sikre et nøyaktig mål antatt trykket strømmer fra pipette. En høyde på 190 mm ble utnyttet, siden dette gir minimal trykk men pålitelig induserer varicosities i axons. Andre høydeverdier kan også brukes hvis trykket føre cellene koble fra dekkglassvæske overflaten. Det anbefales å bruke innstillingen samme gjennom hele eksperimentet. - Pipette inn skruen øverst micromanipulator å holde pipette på plass. Skru metall, flat toppet skruen knyttet til micromanipulator armen slik at den holder un trakk slutten av pipette like over hvor gummi slangen er festet. Vinkel Pipetter i 45° vinkel med overflaten av Nevron inneholder coverslips.
Merk: Micromanipulator bør være konstruert slik at pipette kan holdes uten constricting gummi slangen. Micromanipulator må tillate bevegelse Pipetter i x, y og z instruksjonene nøyaktig posisjon det innenfor cellene. Grafikk som et fotografi av apparatet nedenfor (figur 1). - Slå på et fluorescens filter, åpne blenderåpningen og sikre en lysrør stedet kan sees som kommer gjennom målet. Bruker micromanipulator, Flytt Pipetter i en posisjon som linjer opp spissen med lysrør stedet og senke Pipetter i en posisjon rett over høyden av celle kultur parabol (35 mm x 10 mm). Når det er i posisjon, slå på lyset og deaktivere fluorescens.
- Ved hjelp av pinsett, legge til en dekkglassvæske (med celler vendt opp mot pipette) fra celle kultur plate i celle kultur parabol med ca 2 mL av Hank's buffer ved romtemperatur.
- Plass kultur parabol med dekkglassvæske på området.
- Ved hjelp av finskruen knotten og 20 X mål, Fokuser på et fly fire full svinger over cellene (ca 0,4 mm). Bruk micromanipulator for å plassere pipette tipset slik at det er fokusert og i midten, venstre side av flyet sett gjennom øye-stykker.
Merk: Dendrites er anslag som skal i samme ramme som celle kroppen de stammer fra. For å indusere axonal varicosities, bør man følge lenger anslag fra celle kroppen til mediale og distale axons.
4. kalibrere presset av Pipette bruker et elastisk-membran-System
- Setup puffing pipette apparatet med nøyaktig samme parametere som beskrevet ovenfor over et system som inneholder en microfabricated silikon membran (500 µm i diameter) og 50 µm tykk og fokusere mikroskopet på overflaten av membranen.
Merk: Dette systemet ble utviklet for å måle små trykket verdier og en forklaring på systemet har blitt publisert før10. Målingen bare må gjøres en gang for puffing eksperimenter hvis den nøyaktig samme innstillingen av damper. - Fokusere mikroskopet på matriser av microdots (4 µm i diameter) og 10 µm hverandre, målt mellom sentre. Slå stopp ventilen og la væske strømme ut av pipette. Undersøke nedbøyning av membranen som svar på væsketrykk med AC confocal mikroskop.
- Bruke en lineær modell for å finne tilsvarende presset tilknyttet utslag av membranen.
Merk: Mens en nylig studie fant at en avbøyning m =-3.143 ± 0.69 µm ble innhentet 190 mm sprøyte høyde, dette produsert et trykk på 0,25 ± 0,06 nN/µm2 fra gjeldende pipette oppsett, som er innenfor de fysiologiske og patologiske, skjønt den sprøyte høyde er ikke den eneste Determinanten. Andre faktorer som påvirker nøyaktig press verdien på neurons, inkludert pipette åpning, posisjonering (avstand og vinkel) pipette tips cellene, og med fleksibiliteten til rør4,10.
5. puffing å indusere Varicosities
- Når pipette er i posisjon, fokusere mikroskopet på flyet som inneholder et område av interesse. Plasser celler og prosesser i den venstre halvdelen av tenkelig feltet (sett av bo fange av kameraet) i puffing området, mens den høyre halvdelen er utenfor puffing området.
Merk: Omfattende utvekst av axons og dendrites av neurons er det usannsynlig at alle prosessene av en Nevron er innenfor samme puffing område. Dette er faktisk en fordel med dette systemet, som tillater undersøkelse av lokale effekten av damper. Det finnes to typer av damper som kan benyttes for å indusere varicosities: langvarig damper og puls puffing. -
Damper
- Langvarig puffing
- Plasser sprøyten på høyden, 190 mm over dekkglassvæske som inneholder kulturperler neurons4. Begynne tidsinnstilt bildebehandling av området med en optimalisert eksponeringstid avsløre klart neuronal morfologi. Ta minst 15 rammer med 2 s mellomrom (30 s totalt) som grunnlinjen. Intervallet kan bli justert basert på eksperimentet. Ramme 16, åpne tur-stand stopp ventilen av og la væske til å flyte 75 rammer (150 s). På ramme 75, deaktivere ventilen slik at væske strømme stopper. Stoppe videoopptak.
Merk: Dette bør indusere axonal varicosities i nevronene 7-9 DIV innen 5-10 s, mens eldre neurons ta lengre til skjemaet varicosities.
- Plasser sprøyten på høyden, 190 mm over dekkglassvæske som inneholder kulturperler neurons4. Begynne tidsinnstilt bildebehandling av området med en optimalisert eksponeringstid avsløre klart neuronal morfologi. Ta minst 15 rammer med 2 s mellomrom (30 s totalt) som grunnlinjen. Intervallet kan bli justert basert på eksperimentet. Ramme 16, åpne tur-stand stopp ventilen av og la væske til å flyte 75 rammer (150 s). På ramme 75, deaktivere ventilen slik at væske strømme stopper. Stoppe videoopptak.
- Puls (2 s varighet) puffing
- Plasser sprøyten på riktig høyde (190 mm). Begynne tidsinnstilt bildebehandling og ta minst 15 rammer (30 s) med 2 s intervaller. På ramme 16, åpner ventilen av tillater væske til å flyte, og lukke ventilen etter 2 s. Vent 5-20 s (avhengig av hvor ofte skal testes) før du åpner ventilen igjen. Gjenta åpning og lukking av ventilen for å opprette væske pulser og fortsette for en total periode på 150-300 s. Fortsett time-lapse imaging for 20 min å fange utvinning scenen.
Merk: Når intervallet er lengre enn 10 s, pulser indusere drastisk mindre varicosities. Med 20 s mellomrom, kan ingen varicosities indusert ved pulser4. For å få pålitelig, konsekvent varicosity formasjon, anbefales det sprøyte høyden skal være rundt 190 mm. sprøyte høyde og væsketrykk bør ikke heves til et punkt der celler begynne frakobling fra dekkglassvæske overflaten.
- Plasser sprøyten på riktig høyde (190 mm). Begynne tidsinnstilt bildebehandling og ta minst 15 rammer (30 s) med 2 s intervaller. På ramme 16, åpner ventilen av tillater væske til å flyte, og lukke ventilen etter 2 s. Vent 5-20 s (avhengig av hvor ofte skal testes) før du åpner ventilen igjen. Gjenta åpning og lukking av ventilen for å opprette væske pulser og fortsette for en total periode på 150-300 s. Fortsett time-lapse imaging for 20 min å fange utvinning scenen.
- Før en dag bruk, rengjør oppsett (pipette, rør og sprøyte) ved strømmer om 10 mL 70% etanol gjennom oppsettet. Etter etanol vask, strømme 10 mL av Hank's buffer (eller ønsket buffer) gjennom oppsettet Prime systemet for dagens bruk. Etter sluttplasseringen eksperimenter for dagen, ren oppsett som beskrevet tidligere med etanol å hindre vekst av miljøgifter over natten.
- Langvarig puffing
6. komplimenter metoder
Merk: Puffing analysen kan kombineres med en rekke ulike teknikker som er omtalt i delen innføring. Her er fokus på kjernen teknikker som brukes oftest sammen med puffing analysen, inkludert høyoppløselige fluorescens timelapse bildebehandling, kalsium imaging og utvinning analyser. Disse beskrives nedenfor.
-
Gjennomføre høyoppløselig fluorescerende tidsinnstilt bildebehandling ved å følge protokollen nedenfor
- Spore fluorescently-merket proteiner i nerveceller med 100 X olje linsen. Neurons er transfekterte med den riktige cDNA konstruere. Fange 150 rammer (totalt 300 s) med en 2 s intervall.
Merk: Noen ganger flere farger tidsinnstilt bildebehandling er utført for image bevegelse av flere fluorescently-merket protein samtidig. - Generere en kymograph via video fange programvare eller gjennom ImageJ (NIH).
Merk: Hastigheten og retningen på reise kan bestemmes av kymograph. * Sikker å merke retning i soma ligger fra regionen fanges. Reise mot soma er retrograd, mens reise fra soma til axonal spissen er anterograd. - Gjenta denne prosessen etter puffing, eller kymograph kan opprettes ved hjelp av image fange under puffing analysen.
Merk: Effekten av damper på axonal transport av mitokondrier og synaptic proteiner ble vist i en fersk papir4.
- Spore fluorescently-merket proteiner i nerveceller med 100 X olje linsen. Neurons er transfekterte med den riktige cDNA konstruere. Fange 150 rammer (totalt 300 s) med en 2 s intervall.
-
Kalsium bildebehandling
- Legge til 1 µL (for en 24-vel plate) eller 3 µL (for en 6-vel plate) på 5 mM Fluo-4 AM til kultur medier i en frisk og ruge på 37 ° C i 30 min.
- Vask cellene to ganger med 1 mL Hank's buffer.
Merk: Lastet neurons avgir grønne fluorescens gjennom en FITC filter. Loci betegne regioner merkbar kalsium i cellen. Kombinert med puffing, kan du se en økning i intensitet (økning i interne kalsium).
-
Varicosity utvinning
Merk: Umiddelbart etter et puffing eksperiment, en 20 min utvinning eksperiment kan utføres.- Ta bilder for 300 rammer (1200 s) med en 4 s intervall.
Merk: En celle transfekterte med løselig YFP/mCherry/GFP skal vise et moderat nivå (mindre enn 50%) av utvinning på slutten av tenkelig økten. Axonal utvinning, avhenger av flere faktorer, for eksempel det utviklingen scenen av kultivert neurons4. Dette kan også kombineres med høy oppløsning fluorescerende bildebehandling og kalsium imaging beskrevet ovenfor.
- Ta bilder for 300 rammer (1200 s) med en 4 s intervall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før puffing, viser axons vanligvis liten varicosity formasjon. Følgende damper med våre standard trykk (190 mmH2O høyde), axons begynner å utvikle mange perle-lignende varicosities. Dannelsen av varicosities er delvis reversibel, som vist av regionene axon tilbake til pre opphovnet tilstand etter en 10 min restitusjonsperiode (figur 2A-B). Etter en lengre periode utvinning (> 20 min), noen axons fullstendig gjenopprette. Suboptimal plassering av den puffing pipette samt nøyaktig plassering av på 190 mm over scenen kan ikke generere varicosities raskt. Optimale forhold skal resultere i varicosity-formasjonen i axons av unge neurons (rundt 7 DIV) i ca 5 s4.
Figur 1 : Skjematisk og fotografi av damper apparater. (A) fotografier viser samlede mikroskop oppsett. (B) Puffing apparatet viser glass pipette holdt av micromanipulator og koblet til gummi slangen. (C) fase kontrast bilder med fokus på flyet primære hippocampus neurons viser skyggen av pipette nederst til høyre. (D) ut av cellen flyet fokusert på puffing pipette tips. (E) skjematisk av avstander og beregnede press for å indusere varicosities. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant bilder av varicosity formasjon etter puffing. (A) avbildning av 7DIV, GFP transfekterte mus hippocampus neurons viser en axon pre og post puffing og etter en 10 min restitusjonsperiode. (B) Kymograph av tidsinnstilt bildebehandling av Nevron i (A). Røde piler indikerer varicosities som har dannet etter 150 s 190 mmH2O puffing (begynner på 30 s). Skala bar = 15 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Dekkglassvæske belegg løsning | |
| 780 ΜL | Eddiksyre acid17 mM lager: 50 µL eddiksyre i 50 mL av H2O |
| 200 ΜL | Poly-D-lysine (0,5 mg/mL stock) |
| 20 ΜL | Rotte hale kollagen (3 mg/mL stock) |
| Totalt volum bestemmes basert på antall coverslips å være belagt. | |
Tabell 1: dekkglassvæske belegg løsning. Gir oppskriften for å forberede dekkglassvæske belegg løsningen å overholde kulturperler cellene i coverslips.
| 1 x skive disseksjon løsning (SLDER), filtrert, pH = 7.4, butikken på 4 ° C | |
| 1 L | ddH2O |
| 82 mM | Na2så4 |
| 30 mM | Strikk2så4 |
| 10 mM | HEPES (gratis acid) |
| 10 mM | D-glukose |
| 5 mM | MgCl2 |
| 0,00% | Fenol rød (valgfritt) |
| Kontaktflate Media (PM, filtrere, lagre på 4 ° C) | |
| 439 mL | MEM Earle salter |
| 50 mL | FBS |
| : 11.25 mL | 20% D-glukose |
| 5 mL | Natrium pyruvate (100 mM) |
| 62.5 ΜL | L-glutamin (200 mM) |
| 5 mL | Penicillin/Streptomycin (P/S, 100 x) |
| Vedlikehold Media (MM, filtrere, lagre på 4 ° C) | |
| 484 mL | Neurobasal |
| 10 mL | B27 50 x supplement |
| 1,25 mL | L-glutamin (200 mM) |
| 5 mL | 100 x P/S |
| Alle løsninger er sterilisert med et filter med 0.2 mm porestørrelse. | |
Tabell 2: celle kultur medier oppskrifter. Inneholder oppskrifter for å forberede medier benyttet i dyrking av primære hippocampus Nevron celler.
| Hank's buffer (filter, pH = 7.4, butikken på 4° C | |
| 150 mM | NaCl |
| 4 mM | KCl |
| 1.2 mM | MgCl2 |
| 1 mM | CaCl2 |
| 10 mg/mL | D-glukose |
| 20 mM | HEPES |
Tabell 3: Hank's buffer oppskrift. Gir oppskrift for å utarbeide bufferen brukes i puffing protokollen og under live-celle bildebehandling.
| Pipetter trekke parametere | |||||
| Varme | Trekk | Hastighet | Forsinkelse | Trykk | Rampen |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
Tabell 4: Pipetter trekke parametere. Gir parametrene til angis pipette puller å få en åpning som er rundt 45 µm i diameter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prosedyren for denne microbiomechanical analysen er rett frem. Det vil gi pålitelige resultater, hvis alle trinn gjennomføres nøye. Det er flere viktige ting, hvis feilaktig utført, vil hindre vellykket datainnsamling. De avgjørende skritt begynne oppstrøms av faktiske puffing stimulans. Forsiktig disseksjon, dyrking og pleie av primære Nevron kultur er viktig. Hvis kulturperler neurons ikke er sunt, reagere de ikke konsekvent, siden de kanskje har allerede blitt primet for stress. Nedstrøms kulturen, grunninstallasjonen og kalibrering av puffing apparater å gi konsekvent press, som vil føre varicosities men ikke vil forårsake avdeling av cellene fra dekkglassvæske overflaten, må utføres med tålmodighet. Nøyaktig kalibrering av oppsettet kan ta 1 h på grunn av pipette tilstopping rør og ventil problemer. Det er viktig å sikre at væske renner ut av pipette med minimal motstand før du går videre med å plassere cellene i retten og plassering pipette spissen. Så langt som endringer i oppsettet er bekymret, kan en par puffing apparatet med perfusjon, patch clamping og andre mikroskop-baserte instrument, mest avhengig av den fysiske plassen gratis på sidene av mikroskopet.
Dette systemet har to innebygde begrensninger som trenger oppmerksomhet. Oppsettet kan konsekvent initiere dannelsen av reversibel varicosities i axons av kultivert hippocampus neurons gjennom puffing væske til cellene. Det er imidlertid viktig å merke seg at nøyaktige trykket verdier til neurons i feltet puffing ikke er identiske. Væsketrykk som påvirker celler, beregnes basert på trykk Last måling fra en microfabricated silikon membran4,10, representerer det gjennomsnittlige trykket i midten av feltet puffing. Dermed er nøyaktige puffing trykket den høyeste i midten av feltet puffing og den laveste rundt kanten av feltet. Vi viste at trykket styrke korrelerer med utbruddet, størrelsen og antallet varicosities indusert4. Høyere trykk resulterte i raskere utbruddet, større og mer rikelig varicosities4. I vår nyere studier, har vi brukt et minimalt trykk (190 mmHg på spissen av puffing pipette) som kan fortsatt pålitelig indusere varicosities i de fleste axons4. Under denne tilstanden, varicosity utbruddet for unge neurons er normalt ca 5 s. Det er viktig å merke seg at med nøyaktig samme puffing system, verdien av utbruddet tiden kan variere, som ikke bare avhenger neuronal type, alder og subcellular rom, men kan også påvirkes av plasseringen av Nevron i feltet puffing. Til tross for varianten puffing press mottatt av neurons, analysen systemet fortsatt gir pålitelig verktøy for studerer mekanisk effekter på sentrale neurons, og gir svært konsekvent og reproduserbar eksperimentelle resultater.
Andre begrensning av systemet er tilstopping spørsmålet. For å oppnå fysiologisk relevante press, er åpningen av Pipetter liten, rundt 45 μm. Imidlertid liten åpning tendens til å tette med rusk fra plast slangen og rusk i pipette spissen kan tydelig ses under mikroskopet. Dette øker tiden fikse satt opp, i tilfelle en pipette tresko. Alle løsninger filtreres derfor nøye før du blir satt i sprøyten, rør og pipette. Det er også viktig å vaske puffing systemet med 70% etanol på starten og slutten av dagen, etterfulgt av vask med filtrerte Hank's buffer. For å løse potensielle tilstopping problemet, foreslår vi prøver å trekke flere pipetter. Det er viktig å bekrefte at løsningen er faktisk andpusten ut av pipette gjennom visualisering før eksperimenter. Når en god puffing systemet er opprettet, kan vanligvis vare resten av dagen.
Denne biomekaniske analysen, kombinert med Nevron kultur, presenterer en unik mulighet for å studere sentrale neuron mechanosensation etterligne fysiologiske og/eller patofysiologiske forhold. Dette systemet tillater oss å undersøke effektene av komprimering og skråstilling på neurons. Derimot ble andre systemer brukt til å undersøke i-flyet strekker seg5,6,7. Gjennomsnittlige trykket mottatt av neurons i midten av puffing områdene er 0,25 ± 0,06 nN/µm2 i vårt system4. Denne press på celler er sammenlignbare med elastisk modulus hippocampus neurons målt tidligere utnytte skanning force mikroskopi og bulk Reologi, for å identifisere optisk indusert deformasjon13,14, samt Press brukes til å endre veksten av neurite ledende kantene i vitro, målt ved skanning tvinge mikroskopi (0,27 ± 0,04 nN/µm2)16. Dette presset overstiger ikke trykket som kan genereres naturlig av mesenchymal celler i et E11 embryo, målt med mekanisk bestemt fluorescerende celle store olje microdroplets (1.6 ± 0,8 nN/µm)2,14.
Dette systemet har allerede blitt brukt i kombinasjon med kalsium bildebehandling, patch clamping, elektronisk mikroskop og mobilnettet analyse av en lukket skallen mTBI mus modell4. Analysen kan også brukes i kombinasjon med mikroskop-baserte eksperimenter, som fluorescens utvinning etter photobleaching (FRAP), til å undersøke protein turnover innen varicosities, samt bånd for å studere hvis protein-protein interaksjoner er endret under varicosity formasjon. I hovedsak er en metode som kan gjøres ved hjelp av et mikroskop og en levende celle imaging oppsett kan kobles til denne puffing analysen. Allsidigheten til denne analysen er svært verdifullt i å studere molekylære mekanismer underliggende ulike effekter på neuronal morfologi og funksjoner av micromechanical stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Alle dyr forsøk har vært gjennomført nasjonale institutter for helse dyr bruk retningslinjer. Dette arbeidet ble delvis støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (R01NS093073 og R21AA024873) til C. Gu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
References
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat. Med. 17, 495-499 (2011).
- Yang, J., et al. Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin. Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).
- Debanne, D.
- Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation. J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).
- Chung, R. S., et al. Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy. J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).
- Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury. Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).
- Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).
- Donkin, J. J., Vink, R. Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments. Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis. J. Micromech. Microeng. 23, 015002 (2013).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
- Franze, K., et al. Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact. Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
