Summary
Dit protocol beschrijft een fysiologisch relevante, hydrofoor vloeistof aanpak voor snelle en omkeerbare inductie van varicosities in de neuronen.
Abstract
Axonale varicosities zijn uitgebreide structuren langs de assen van axonen met een hoge mate van heterogeniteit. Ze staan niet alleen in de hersenen met neurodegeneratieve ziekten of verwondingen, maar ook in de normale hersenen. Hier beschrijven we een nieuw opgerichte micromechanische systeem om snel, betrouwbaar en omkeerbaar axonale varicosities, waardoor ons te begrijpen van de mechanismen inzake de vorming van de varicosity en de samenstelling van de heterogene eiwit. Dit systeem vertegenwoordigt een nieuwe middelen voor de evaluatie van de effecten van de compressie en afschuiving stress op verschillende subcellular compartimenten van neuronen, anders dan andere in vitro -systemen, die zich vooral op het effect van stretching richten. Nog belangrijker is, als gevolg van de unieke kenmerken van ons systeem, wij onlangs een nieuwe ontdekking gedaan waaruit blijkt dat de toepassing van de onder druk staande vloeistof snel en omkeerbaar axonale varicosities door middel van de activering van een voorbijgaande receptor potentiële kanaal veroorzaken kan. Onze biomechanische systeem kan gemakkelijk worden gebruikt in combinatie met de drug perfusie, levende cel imaging, beeldvorming van de calcium en patch klem opname. Deze methode kan derhalve worden vastgesteld voor de studie van mechanosensitive ionenkanalen, axonale vervoer verordening axonale cytoskelet dynamiek, calcium signalering en morfologische veranderingen met traumatisch hersenletsel.
Introduction
De vorming van de varicosity, of zwelling/beading, langs de axonen, is een opvallend kenmerk van neurodegeneratie waargenomen bij veel aandoeningen of verwondingen van het centrale zenuwstelsel, zoals multiple sclerose, ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, en traumatische hersenen letsel1,2. Ondanks de significante fysiologische effecten van axonale varicosities over actiepotentiaal propagatie en synaptische transmissie3is het onbekend hoe de varicosities worden gegenereerd. Onlangs, een nieuw opgerichte microbiomechanical assay op gekweekte hippocampal neuronen van knaagdieren gebruikt, we vonden dat een mechanische stimuli varicosities in deze neuronen met zeer intrigerende functies kunnen veroorzaken. Ten eerste, varicosity-inductie is snelle (< 10 s) en dit proces is onverwacht omkeerbaar. Ten tweede, de afhankelijk van de varicosity Inleiding sterkte puffend druk: hoe hoger de druk, hoe sneller de opening. Ten derde hangt varicosity initiatie in neuronale leeftijd. De axonen van jongere neuronen lijken ontvankelijker voor mechanische stress, vergeleken met die van oudere neuronen. Ten vierde, de vorm van de varicosities langs de axonen van hippocampal neuronen, terwijl de dendrites en eerste axon segmenten van deze neuronen geen verandering onder dezelfde puffende voorwaarde weergeven Onze studie bleek dus, een nieuwe functie van neuronale polariteit. Deze bevindingen met de in vitro -systeem zijn fysiologisch relevant. Met behulp van een in vivo -model voor licht traumatisch hersenletsel (mTBI), toonden we dat axonale varicosities ontwikkeld in een multi focale mode in de Somatosensorische cortex van de muizen onmiddellijk na sluiten-schedel impact, conform onze in vitro resultaten4. Het is belangrijk op te merken dat onze kleuring en beeldvorming van de mTBI muizen bieden slechts een onverwacht schot van neuronale morfologische veranderingen, sinds het uitvoeren van in vivo time-lapse beeldvorming van neuronale morfologie tijdens een mechanische impact is nog niet haalbaar.
Dit systeem van vloeistof-puffend konden we niet alleen unieke functies die zijn gekoppeld aan mechanische stress-geïnduceerde varicosity vorming, maar ook om te bepalen van het onderliggende mechanisme. Door het testen van verschillende extracellulaire oplossingen, de blokkers en openers van verschillende kandidaten van mechanosensitive ionenkanalen, en cellulaire electrofysiologie, vastgesteld wij dat de potentiële catie van voorbijgaande receptor kanaal onderfamilie V lid 4 (TRPV4) kanaal dat is luchtdoorlatend Ca2 + en nb+ en geactiveerd door puffend is voornamelijk verantwoordelijk voor het opsporen van de eerste mechanische spanning tijdens axonale varicosity formatie4. Dit wordt verder bevestigd met een knock-out-benadering van siRNA. Samen genomen, dit nieuwe systeem van de test die hebben we ontwikkeld met hippocampal neuron cultuur, is zeer waardevol voor het bestuderen van de eigenschappen van de micromechanische van centrale neuronen, vooral in combinatie met andere technieken.
Dit micromechanische systeem dat wij hebben opgebouwd is uniek en verschilt van de eerder bestaande systemen in verschillende belangrijke aspecten. Eerst, ervaar de neuronen in dit systeem, uit-van-plane mechanische stress in de vorm van compressie en afschuiving. Tijdens de botsing zijn mechanische neuronale processen blijven gehecht aan het dekglaasje aan oppervlak en niet verplaatst. Dit verschilt van andere experimentele systemen die voornamelijk buigen en strekken van in-plane (of spanning), bijvoorbeeld, de uitwijking van gebundelde axonen als tekenreeksen5,6 verplaatsen of strekken axonen geteeld op micropatterned kanalen en rekbare membranen7,8. Bovendien, hoewel axonale varicosities kunnen ook worden opgewekt deze testen zoals in ons systeem van vloeistof-puffend, het proces in deze instellingen veel langer duurt (vanaf 10 min op verschillende uren6,-7,8) en verschijnt onomkeerbaar. Ten slotte, ons systeem met behulp van lokale vloeistof puffend staat het onderzoek van de ruimtelijke kenmerken van varicosity formatie (bv., dendrites, dendritische spines, soma, axonale eerste segmenten, axonale terminals), naast de tijdelijke functies. Met behulp van dit systeem, ontdekten we verschillende onverwachte en unieke functies van axonale varicosity formatie, vooral snelle begin traag reversibele en axon-dendriet polariteit.
Het systeem dat we in dit papier bespreken is compatibel met vele technieken voor moleculaire en celbiologie. Bijvoorbeeld, om te bestuderen van de gevolgen van mechanische belasting voor neuronale morfologie en functie, kan het worden gebruikt samen met myeline coculture, time-lapse imaging van fluorescerende resonantie energieoverdracht (FRET) en de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF), calcium beeldvorming, en patch klem opname. In dit document richten we ons op de belangrijkste onderdelen van het systeem. Hippocampal neuron cultuur, de vloeistof-puffend setup, high-resolution time-lapse imaging voor axonale vervoer en calcium imaging worden stapsgewijze hieronder geïllustreerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle onderstaande methoden zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Ohio State University.
1. dekglaasje aan voorbereiding
- Plaats een of meer vakken van 12 mm of 25 mm coverslips in een glas bekerglas van 70% salpeterzuur en na een nacht bebroeden de coverslips bij kamertemperatuur.
Opmerking: De 25 mm coverslips in het bekerglas van de dezelfde als de coverslips 12 mm niet wassen. Het is beter om ze te wassen afzonderlijk. - Pipetteer van alle coverslips in een bekerglas van de 4 L gevuld met 2.5 L van ddH2O en schud het bekerglas van de coverslips gedurende 1 uur bij 100 omwentelingen per minuut. Gebruik elastiekjes te houden van het bekerglas tijdens het schudden. Herhaal de spoeling met verse 2.5 L ddH2O viermaal.
- Schoongemaakte coverslips overbrengen in een droge fles of kolf met een metalen deksel. Bak de coverslips in een oven op 225 ° C gedurende 6 h en laten afkoelen tot kamertemperatuur.
Opmerking: De 25 mm dekglaasje aan is gevoelig voor breken. Coverslips door één afzonderlijke en droge lucht en bak ze in een oven. - Bewaar de gedroogde en schoongemaakte coverslips bij kamertemperatuur in een gesteriliseerde kunststoffles tot gebruik.
-
Jas de coverslips als volgt:
- Bereid verse coating-oplossing in een centrifugebuis.
- Plaats elke dekglaasje aan in een putje van een 24-well (of 6-well) plaat. 30 (of 100) µL van dekglaasje aan coating oplossing (tabel 1) op een dekglaasje van 12 mm (of 25 mm) aan en swirl plaats. Voeg 1 mL steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, weefselkweek rang) naar de waterput. Deze platen kunnen worden onmiddellijk gebruikt of bewaard bij 4 ° C in steriele PBS voor tot een week.
- Op de dag van de dissectie, verwijder de PBS. Luchtdroog en de platen onder UV-licht (30W) voor 2-4 h plaats.
Opmerking: De laatste stap moet worden aangevuld met het UV-licht op in een cel cultuur laminaire flow kap. De deur van de kap moet iets worden opgeheven zodat de luchtstroom voor het drogen van de coverslips.
2. dissectie, dissociatie, en cultuur van de Hippocampal neuronen van zwangere muis/Rat
-
Dissectie en dissociatie van hippocampal neuronen voor cultuur
- Ontdooi protease enzym oplossing (3 mg/mL protease 23 in SLDS, tabel 1) en vooraf warm plating media (tabel 2) bij 37 ° C.
- Hippocampus ontleden en spoel met SLDS, overeenkomstig de methoden beschreven in eerdere publicatie14.
Opmerking: Vier hippocampi bieden genoeg cellen voor een 24-well of één 6-well plaat. - SLDS verwijderen, voeg toe 2 mL protease enzym oplossing en Incubeer het monster bij 37 ° C, 5% CO2 voor 15 min.
- De hippocampus explantaten met 5-10 mL van plating medium tweemaal wassen. Voeg 5 mL medium plating. Distantiëren hippocampal explantaten in afzonderlijke cellen door het genereren van een kleine draaikolk met behulp van een precisiepipet met een 1-mL plastic tip. Pipetteer omhoog en omlaag ongeveer 40 keer, het vermijden van de vorming van zuurstofbellen, tot de oplossing troebel wordt en geen grote stukken explant blijven.
Nota: Herinner me verlaten sommige media tijdens wasbeurten, de hippocampal explantaten verzonken in het medium moeten blijven tijdens het hele proces. - Centrifugeer de cellen bij 1,125 x g gedurende 3 min. verwijderen het supernatant met de cellen ondergedompeld in de media. Resuspendeer de cellen in 145 mL plating media. 1 mL/putje van de celsuspensie toevoegen aan een 24-well plaat (3 mL/putje tot een 6-well-plate).
Opmerking: 145 mL plating media wordt gebruikt voor het produceren van een celsuspensie die een lage celdichtheid heeft. Dit volume zal toestaan de beplating van cellen in zes 24-Wells-platen, acht 6-Wells-platen of diverse combinaties van 24 - of 6-Wells-platen afhankelijk van de experimenten te worden uitgevoerd. Elk putje van de plaat 24-well zal ongeveer 3 x 104 cellen9hebben. - Incubeer de cellen in de media van de beplating bij 37 ° C, 5% CO2 voor 2-4 h, dan alle plating media verwijderen en vervangen door verse onderhoud media.
- Na 2 dagen (2 dagen in vitro, 2DIV), vervangen door de helft van de media 2 µM Ara-C (arabinosylcytosine) opgelost in onderhoud media die remt de groei van de fibroblasten, endotheliale en gliale cellen. Na bloot cellen aan Ara-C voor twee dagen, door de media te vervangen door verse onderhoud media.
-
Transfectie voor de visualisatie van cel morfologie
Opmerking: Transfect de cellen met fluorescerende constructies van groen fluorescent proteïne (GFP), gele fluorescerende eiwit (YFP), mCherry, etc. voor het verlichten van de morfologie van individuele neuronen.- Verdun de constructies uit voorraad (1 µg/µL) naar de Opti-MEM media (0.8 µg voor de construct in 50 µL van Opti-MEM media) en vortex. Maak 1 construct verdunning voor elk putje.
Opmerking: Een 24-well-plate vereist 0.8 µg voor construct in 50 µL van Opti-MEM media. Een 6-well-plate vereist 2.4 µg voor construct in 150 µL Opti-MEM media. - Verdunde liposomen-gemedieerde transfectiereagens in Opti-MEM media (1,5 µL van het transfectiereagens in 50 µL van Opti-MEM media) en vortex. Maak 1 transfectie verdunning voor elk putje.
Opmerking: Een 24-well-plate vereist 1.5 µL van transfectiereagens in 50 µL van Opti-MEM media. Een 6-well-plate vereist 4.5 µL van transfectiereagens in 150 µL van Opti-MEM media. - Bereiden een 1:1-mengsel (100 µL) van de constructie in Opti-Mem media en transfectie reagens in de Opti-MEM media en vortex. Laat het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten inwerken.
Let op: Per putje, moet er ongeveer 100 µL van de oplossing met constructie, transfectiereagens en Opti-MEM media als met behulp van een 24-well plaat (300 µL voor 6-well plaat). - De helft van de media (500 µL voor 24-well plaat, 1,5 mL voor 6-well plaat) te verwijderen van elk putje en breng deze media in een schone conische buis. Houd deze buis in de incubator. Voeg dan de 100 µL mengsel (stap 2.2.3) aan de resterende media in de put. Toestaan dat de cellen te incuberen bij 37 ° C gedurende 20-30 min.
- Toevoegen tijdens de incubatie (stap 2.2.4), een hoeveelheid verse onderhoud media aan de media in de conische buis (stap 2.2.4). Plaats het mengsel in de dezelfde incubator (37 ° C en 5% CO2).
- Na de incubatie, verwijder alle media met de oplossing van de transfectie van de putten en vervangen door de 1:1-mengsel van oude en verse onderhoud media in de conische buis (stap 2.2.5).
Opmerking: Afhankelijk van de grootte van de constructies, cellen kunnen gaan uiten binnen 12 uur; voor grotere constructies, 3-4 dagen kan nodig zijn voordat de expressie van de piek van de constructies wordt bereikt.
- Verdun de constructies uit voorraad (1 µg/µL) naar de Opti-MEM media (0.8 µg voor de construct in 50 µL van Opti-MEM media) en vortex. Maak 1 construct verdunning voor elk putje.
3. het opzetten van de puffende Pipetteer apparatuur
Opmerking: Er zijn vijf basisonderdelen voor deze set-up: de glazen pipet, de slang, de spuit, de micromanipulator en de buffer (Hank). Elke buffer met fysiologisch relevante zout concentraties kan worden gebruikt in deze set-up.
- Trek een borosilicaat-pipet te hebben rond 45-µm-diameter opening tip met behulp van een trekker van de micropipet en de specificaties in tabel 3.
Opmerking: Bleek dat 45 µm is een geschikte grootte voor de diameter van de pipet openen onder proefomstandigheden. Lichte variaties in de grootte van de opening mag niet aanzienlijk beïnvloeden resultaten. Het is belangrijk op te merken dat grotere afwijkingen van dit nummer nog voor varicosity inductie werken moeten door het aanpassen van de hoogte van de spuit die is gekoppeld aan de pipet via buizen, maar dit vergt herijking van de waarde van de druk. - Sluit de un-getrokken uiteinde van de pipet op dunne rubberen slang.
Opmerking: De muur van de buis moet dun en rigide te minimaliseren de vloeiende weerstand, ervoor te zorgen dat de hoogte van de spuit is recht evenredig met de druk van de vloeistof stroomt door de pipet met te verwaarlozen weerstand. De slang moet niet langer dan ongeveer 0,6 m in lengte tot verdere minimaliseren de weerstand. - Sluit het andere uiteinde van de buis aan een kunststof spuit van 10 mL via een aansluiting met een draai-baar ventiel.
Opmerking: De kunststof spuit moet plaatsvinden op een constante, meetbare hoogte om een nauwkeurige maatstaf voor de veronderstelde druk die voortvloeien uit de pipet. Een hoogte van 190 mm werd gebruikt, aangezien dit minimale druk biedt maar betrouwbaar varicosities in axonen induceert. Andere hoogtewaarden kunnen ook worden gebruikt als de druk de cellen veroorzaken los van het oppervlak met een dekglaasje aan. Het is aanbevolen om gebruik van dezelfde instelling gedurende het gehele experiment. - Plaats de pipet in de bovenkant van de schroef van de micromanipulator om de pipet op zijn plaats houden. Schroef de metalen, platte bekroond schroef gekoppeld aan de micromanipulator-arm, zodat houdt het un-getrokken einde van de pipet net boven waar de rubber slang is gekoppeld. Hoek de pipet op een hoek van 45° met het oppervlak van het neuron-bevattende coverslips.
Opmerking: De micromanipulator moet worden gebouwd, zodat de pipet plaatsvinden kan zonder het beklemmende van de rubber slang. De micromanipulator mogen de motie van de pipet in de x-, y- en z-richting te nauwkeurig plaatsen binnen het bereik van de cellen. Een afbeelding, evenals een foto van het apparaat vindt u hieronder (Figuur 1). - Een fluorescentie-filter inschakelen, opent u het diafragma en zorgen voor dat een fluorescerende plek te zien komen door de doelstelling. Met behulp van de micromanipulator, de pipet verplaatsen in een positie die lijnen de tip met de fluorescerende plek en lager de pipet in een positie net boven de hoogte van de cel cultuur schotel (35 x 10 mm). Zodra het in positie, de doorvallend licht inschakelen en uitschakelen van fluorescentie.
- Met pincet, toevoegen een dekglaasje aan (met de cellen naar boven richting de pipet) uit de cel cultuur plaat aan de cel cultuur schotel met ongeveer 2 mL Henks buffer bij kamertemperatuur.
- Zet de schotel van de cultuur met de dekglaasje aan op het toepassingsgebied.
- Met behulp van de fijne focus knop en 20 X doelstelling, focussen op een vliegtuig over vier volledige bochten boven de cellen (ongeveer 0,4 mm). Gebruik de micromanipulator om de positie van het pipette uiteinde, zodat het is gericht, en in het centrum, de linkerkant van het vliegtuig zoals gezien door de ogen-stukken.
Opmerking: Dendrites zijn prognoses die in hetzelfde frame als de cel lichaam die ze afkomstig zijn moeten uit. Om te induceren axonale varicosities, moet men langer projecties van de cel lichaam volgen naar mediaal en DISTAAL axonen.
4. kalibreren van de druk van de pipet met behulp van een elastische-membraan systeem
- Opstelling van de puffende Pipetteer apparaat met exact dezelfde parameters zoals hierboven beschreven over een systeem met een microfabricated silicone membraan (500 µm in diameter) en 50 µm dik en concentreren van de Microscoop op de oppervlakte van het membraan.
Opmerking: Dit systeem is ontworpen voor het meten van kleine druk waarden en een uitleg van het systeem is gepubliceerd vóór10. Deze meting moet alleen worden gedaan eenmaal voor puffend experimenten als de exacte dezelfde instelling van puffend wordt gebruikt. - Richten de Microscoop op de arrays van microdots (4 µm in diameter) en 10 µm uit elkaar, zoals gemeten tussen centra. Zet van de afsluiter en laat vloeistof te stromen uit de pipet. Bekijk de uitwijking van het membraan in reactie op de vloeistof druk met een confocal microscoop.
- Gebruik maken van een lineair model om te bepalen van de corresponderende druk doorbuiging van het membraan is gekoppeld.
Opmerking: Hoewel een recente studie bleek dat een afbuiging van w =-3.143 ± 0.69 µm voor 190 mm spuit hoogte was verkregen, dit geproduceerd een druk van 0,25 ± 0,06 nN/µm2 van de huidige Pipetteer setup, die binnen het bereik van fysiologische en pathologische, hoewel de spuit hoogte is niet de enige bepalende factor. Andere factoren beïnvloeden de waarde van de precieze druk op de neuronen zo goed, met inbegrip van de pipet openen, positionering (afstand en hoek) van het uiteinde van de pipet ten opzichte van de cellen, en zelfs de flexibiliteit van de buis4,10.
5. puffend om te induceren Varicosities
- Zodra de pipet bevindt zich in positie, richten de Microscoop op een vliegtuig dat een regio van belang bevat. Plaats de cellen en de processen in de linker helft van het imaging veld (gezien door een live opname van de camera) binnen de puffende gebied, terwijl de rechterhelft is buiten puffend gebied.
Opmerking: Als gevolg van uitgebreide uitvloeisel van axonen en dendrites van neuronen, het is onwaarschijnlijk dat alle processen van een neuron binnen hetzelfde puffende gebied zijn. Dit is eigenlijk een voordeel van dit systeem, waarmee het onderzoek van het plaatselijke effect van puffend. Er zijn twee soorten puffend die kunnen worden gebruikt om te induceren varicosities: lange duur puffend en pulse puffend. -
Puffend
- Lange duur puffend
- Plaats de spuit op het hoogtepunt, 190 mm boven het dekglaasje aan met gekweekte neuronen4. Time-lapse beeldvorming van interessegebied beginnen met een geoptimaliseerde belichtingstijd onthullen duidelijk neuronale morfologie. Het opnemen van ten minste 15 frames met een 2 s interval (30 s in totaal) als de basislijn. Het interval kan worden aangepast op basis van het experiment. Bij frame 16, open de beurt-baar afsluiter van de spuit en vloeistof te stromen voor 75 frames toestaan (150 s). Bij frame 75, uitschakelen het ventiel zodat fluid flow stopt. Video-opname te stoppen.
Opmerking: Dit moet induceren axonale varicosities in neuronen 7-9 DIV binnen 5-10 s, overwegende dat oudere neuronen langer te aan formulier varicosities.
- Plaats de spuit op het hoogtepunt, 190 mm boven het dekglaasje aan met gekweekte neuronen4. Time-lapse beeldvorming van interessegebied beginnen met een geoptimaliseerde belichtingstijd onthullen duidelijk neuronale morfologie. Het opnemen van ten minste 15 frames met een 2 s interval (30 s in totaal) als de basislijn. Het interval kan worden aangepast op basis van het experiment. Bij frame 16, open de beurt-baar afsluiter van de spuit en vloeistof te stromen voor 75 frames toestaan (150 s). Bij frame 75, uitschakelen het ventiel zodat fluid flow stopt. Video-opname te stoppen.
- Pulse (2 s duur) puffend
- Plaats de injectiespuit op de juiste hoogte (190 mm). Time-lapse imaging beginnen en ten minste 15 frames opnemen (30 s) met een 2 s-interval. Bij frame 16, open de klep van de spuit en toestaan vloeistof te stromen, sluit het ventiel na 2 s. wacht 5-20 s (afhankelijk van de frequentie te beproeven) voordat u de klep weer opent. Herhaal openen en sluiten van de klep maken vloeistof pulsen en blijven voor een totale periode van 150-300 s. doorgaan time-lapse imaging voor 20 min te vangen van de fase van herstel.
Opmerking: Wanneer het interval is langer dan 10 s, de pulsen induceren drastisch minder varicosities. Met een 20 s interval, kunnen geen varicosities worden opgewekt door de pulsen4. Met het oog op een betrouwbare, consistente varicosity formatie, is het raadzaam moet de spuit hoogte ongeveer 190 mm. hoogte spuit en materiaaldruk moet niet worden verhoogd tot een punt waar cellen beginnen loskoppelen van het dekglaasje aan oppervlak.
- Plaats de injectiespuit op de juiste hoogte (190 mm). Time-lapse imaging beginnen en ten minste 15 frames opnemen (30 s) met een 2 s-interval. Bij frame 16, open de klep van de spuit en toestaan vloeistof te stromen, sluit het ventiel na 2 s. wacht 5-20 s (afhankelijk van de frequentie te beproeven) voordat u de klep weer opent. Herhaal openen en sluiten van de klep maken vloeistof pulsen en blijven voor een totale periode van 150-300 s. doorgaan time-lapse imaging voor 20 min te vangen van de fase van herstel.
- Voordat een dag van gebruik, schoon u de set-up (Pipet, leidingen en spuit) door stroomt over 10 mL 70% Ethanol door de set-up. Na de ethanol wassen, 10 mL Henks buffer (of gewenste buffer) doorstromen de opzet om het systeem voor die dag gebruik prime. Na afwerking experimenten voor de dag, schoon de set-up als eerder beschreven met ethanol om te voorkomen dat de groei van verontreinigende stoffen 's nachts.
- Lange duur puffend
6. het complimenteren van methoden
Opmerking: De puffende bepaling kan worden gecombineerd met een scala aan verschillende technieken die worden beschreven in de sectie Inleiding. Hier is de focus op de core-technieken die het vaakst worden gebruikt samen met de puffende assay, met inbegrip van hoge-resolutie fluorescentie timelapse imaging, calcium imaging en herstel testen. Deze worden hieronder besproken.
-
Hoge-resolutie fluorescentie time-lapse imaging voeren door het volgen van het protocol hieronder
- De beweging van fluorescently-gelabelde proteïnen binnen neuronen met een 100 X olie lens te volgen. Neuronen zijn transfected met de juiste cDNA constructie. Vangen voor 150 frames (total 300 s) met een interval van 2 s.
Opmerking: Soms meerdere-kleur time-lapse imaging is uitgevoerd naar het verkeer van meer dan één fluorescently-tagged eiwit gelijktijdig image. - Het genereren van een Kymograaf via de video vastleggen software of via ImageJ (NIH).
Opmerking: De snelheid en de directionaliteit van de reis kunnen worden bepaald met behulp van de Kymograaf. * Zeker worden te merken de richting het soma uit de regio ligt veroverde. Reizen naar het soma is retrograde, terwijl reizen uit de buurt van het soma naar de axonale tip anterograde. - Herhaal dit proces na puffende, of een Kymograaf kan worden gemaakt met behulp van de Fotolader tijdens de puffende assay.
Opmerking: De effecten van puffend over axonale vervoer van mitochondriën en synaptische eiwitten werden getoond in een recente papier-4.
- De beweging van fluorescently-gelabelde proteïnen binnen neuronen met een 100 X olie lens te volgen. Neuronen zijn transfected met de juiste cDNA constructie. Vangen voor 150 frames (total 300 s) met een interval van 2 s.
-
Calcium-imaging
- Voeg 1 µL (voor een 24-well-plate) of 3 µL (voor een 6-well-plate) van 5 mM Fluo-4 AM aan de cultuur media in een goed en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Wassen van de cellen tweemaal met 1 mL Henks buffer.
Opmerking: Geladen neuronen uitzenden groene fluorescentie door middel van een FITC filter set. Loci duiden regio's aanzienlijke calcium binnen de cel. Wanneer gecombineerd met puffend, kan een stijging van de intensiteit (verhoging interne calcium niveau) worden gezien.
-
Varicosity herstel
Opmerking: Onmiddellijk na een puffende experiment, een 20 min herstel experiment kan worden uitgevoerd.- Opnames voor 300 frames (1200 s) met een interval van 4 s.
Opmerking: Een cel transfected met oplosbare YFP/mCherry/GFP moet tonen een gematigd niveau (minder dan 50%) van herstel tegen het einde van de imaging-sessie. Axonale herstel hangt af van een aantal factoren, zoals de ontwikkelings fase van beschaafde neuronen4. Dit kan ook gecombineerd worden met hoge resolutie fluorescerende beeldvorming en calcium imaging hierboven beschreven.
- Opnames voor 300 frames (1200 s) met een interval van 4 s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorafgaand aan puffend, Toon axonen normaal weinig varicosity formatie. Volgende puffend met onze standaarddruk (190 mmH2O hoogte), het begin van de axonen tot het ontwikkelen van vele kraal-achtige varicosities. De vorming van varicosities is gedeeltelijk omkeerbaar, zoals blijkt uit de regio's van de axon terug te keren naar hun pre gepofte staat na een herstelperiode van 10 min (Figuur 2A-B). Na een langere periode van herstel (> 20 min), sommige axonen volledig herstellen. Suboptimaal positionering van de puffende Pipet, alsmede nauwkeurige positionering van de spuit op 190 mm boven het podium kan niet genereren varicosities snel. Optimale omstandigheden moeten resulteren in de vorming van de varicosity in de axonen van jonge neuronen (rond 7 DIV) in ongeveer 5 s4.
Figuur 1 : Schema en foto van het apparaat puffend. (A) foto's tonen algemene Microscoop set-up. (B) toestellen tonen de glazen pipet puffend gehouden door de micromanipulator en verbonden met de rubber slang. (C) fase contrast beelden met focus op vlak van primaire hippocampal neuronen schaduw van Pipetteer in de bodem juiste tonen. (D) Out van cel vlak gericht op puffend pipette uiteinde. (E) schema van afstanden en berekende druk voor inducerende varicosities. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatief beelden van varicosity formatie na puffend. (A) beeldvorming van 7DIV, GFP transfected muis hippocampal neuronen tonen een axon pre en post puffend en na een herstelperiode van 10 min. (B) Kymograaf van time-lapse beeldvorming van neuron in (A). Rode pijlen geven aan varicosities die gevormd na 150 s van 190 mmH2O puffend (vanaf 30 s). Schaal bar = 15 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Dekglaasje aan coating oplossing | |
| 780 ΜL | Azijnzuur acid17 mM voorraad: 50 µL azijnzuur in 50 mL H2O |
| 200 ΜL | Poly-D-lysine (0,5 mg/mL stockoplossing) |
| 20 ΜL | Rat staart collageen (3 mg/mL stockoplossing) |
| Het totale volume wordt bepaald op basis van het aantal coverslips worden bekleed. | |
Tabel 1: dekglaasje aan coating oplossing. Biedt het recept voor het voorbereiden van het dekglaasje aan coating oplossing gebruikt om te kleven gekweekte cellen aan de coverslips.
| 1 x segment dissectie oplossing (SLDS), gefilterd, pH = 7.4, bewaren bij 4 ° C | |
| 1 L | ddH2O |
| 82 mM | NB2zo4 |
| 30 mM | K2zo4 |
| 10 mM | HEPES (vrij zuur) |
| 10 mM | D-glucose |
| 5 mM | MgCl2 |
| 0,00% | Fenol rood (optioneel) |
| Plating Media (PM, filteren, opslaan bij 4 ° C) | |
| 439 mL | MEM Earle's zouten |
| 50 mL | FBS |
| 11.25 mL | 20% D-glucose |
| 5 mL | Natrium pyruvaat (100 mM), |
| 62,5 ΜL | L-glutamine (200 mM) |
| 5 mL | Penicilline/streptomycine (P/S, 100 x) |
| Onderhoud Media (MM, filteren, opslaan bij 4 ° C) | |
| 484 mL | Neurobasal |
| 10 mL | B27 50 x supplement |
| 1,25 mL | L-glutamine (200 mM) |
| 5 mL | 100 x P/S |
| Alle oplossingen zijn gesteriliseerd met behulp van een filter met poriegrootte van 0,2 mm. | |
Tabel 2: cel voedingsbodems recepten. Biedt de recepten voor het voorbereiden van media gebruikt in het kweken van primaire hippocampal neuron cellen.
| Henks buffer (filter, pH = 7.4, winkel op 4° C | |
| 150 mM | NaCl |
| 4 mM | KCl |
| 1.2 mM | MgCl2 |
| 1 mM | CaCl2 |
| 10 mg/mL | D-glucose |
| 20 mM | HEPES |
Tabel 3: de recept van de buffer van de Henks. Het recept voor het voorbereiden van de buffer gebruikt in de puffende protocol en tijdens live-cel imaging biedt.
| Pipetteer trekken parameters | |||||
| Warmte | Trek | Velocity | Vertraging | Druk | Oprit |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
Tabel 4: Pipetteer trekken parameters. Bevat de parameters worden ingesteld op de trekker van de pipet op het verkrijgen van een opening die is ongeveer 45 µm in diameter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De procedure voor deze microbiomechanical assay is ongecompliceerd. Het zal produceren betrouwbare resultaten, als alle zijn stappen zorgvuldig worden uitgevoerd. Er zijn verschillende belangrijke stappen die, als onjuist wordt uitgevoerd, succesvolle gegevensverzameling belemmeren zal. De kritische stappen beginnen stroomopwaarts van de daadwerkelijke toepassing van de puffende stimulus. Zorgvuldige dissectie, kweken en zorg van de primaire neuron cultuur staan. Als de beschaafde neuronen niet gezond zijn, zullen ze niet reageren consequent, omdat zij zou hebben reeds al primer voor stress. Stroomafwaarts van de cultuur, de initiële set-up en de kalibratie van de puffende toestel niet blootstellen aan het bieden van consistente druk, die zal veroorzaken varicosities maar niet zal leiden tot onthechting van de cellen van het dekglaasje aan oppervlak, met geduld moet worden uitgevoerd. Nauwkeurige kalibrering van de set-up duurt 1U als gevolg van de pipet verstopping, buis of klep kwesties. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de vloeistof uit de pipet met minimale weerstand stroomt voordat vooruit met het plaatsen van de cellen in de schotel en positionering van het uiteinde van de pipet. Wat betreft wijzigingen in de opzet zijn, kan een het puffende apparaat met perfusie, patch klemmen en ieder ander Microscoop-gebaseerd instrument, meestal afhankelijk van de fysieke ruimte vrij op de zijkanten van de Microscoop te koppelen.
Dit systeem heeft twee intrinsieke beperkingen die aandacht nodig hebben. De set-up kan consequent het initiëren van de vorming van omkeerbare varicosities in de axonen van gekweekte hippocampal neuronen via puffende vloeistof naar de cellen. Het is echter belangrijk op te merken dat de precieze druk-waarden op de neuronen binnen hetzelfde puffende veld niet identiek zijn. De materiaaldruk die invloed op de cellen, berekend op basis van meting van de belasting van de druk van een microfabricated silicone membraan4,10, de gemiddelde druk in het middelpunt van de puffende veld vertegenwoordigt. De exacte puffende druk is dus de hoogste in het midden van de puffende veld en het laagst rond de rand van het veld. We toonden aan dat de kracht correlaten van de druk met het begin, de grootte en het aantal varicosities4 geïnduceerde. Hogere druk resulteerde in snellere begin, groter, en overvloediger varicosities4. In onze recente studies gebruikten we een minimale druk (190 mmHg op het puntje van de puffende pipet) die nog steeds betrouwbaar varicosities in meeste axonen4kan veroorzaken. Onder deze voorwaarde, varicosity begin voor jonge neuronen is normaal ongeveer 5 s. Het is belangrijk op te merken dat met de exacte dezelfde puffend systeem, de waarde van de begin tijd verschillen kan, die niet alleen afhankelijk van de neuronale type, leeftijd en subcellular compartiment, maar kan ook worden beïnvloed door de positie van het neuron op de puffende gebied. Ondanks de variatie van de puffende druk ontvangen door de neuronen, deze bepaling systeem nog biedt een betrouwbare manier voor het bestuderen van mechanische effecten op centrale neuronen, en levert zeer consistente en reproduceerbare experimentele resultaten.
De tweede beperking van het systeem is de clogging kwestie. Om te bereiken fysiologisch relevante druk, is de opening van de pipetten klein, rond 45 μm. Echter, de kleine opening neiging om verstoppen met puin van de kunststof buizen en het puin in de pipet tip duidelijk kan worden gezien onder de Microscoop. Dit verhoogt de hoeveelheid tijd prepping de set-up, in het geval van een pipet klomp. Alle oplossingen zijn daarom zorgvuldig gefilterd voordat zij in de spuit, leidingen en Pipetteer wordt genomen. Het is ook belangrijk om te wassen de puffende systeem met 70% ethanol aan het begin en eind van de dag, gevolgd door wassen met gefilterde Henks buffer. Om de potentiële clogging probleem oplossen, is het raadzaam de proberen te trekken van meerdere pipetten. Het is essentieel om te bevestigen dat de oplossing eigenlijk uit de pipet door visualisatie gepofte is voordat de experimenten. Zodra een goed puffende systeem wordt gevestigd, kan het meestal duren voor de rest van de dag.
Deze biomechanische assay, gecombineerd met de cultuur van het neuron, presenteert een unieke gelegenheid voor het bestuderen van de centrale neuron mechanosensation nabootsen van fysiologische en/of pathofysiologische omstandigheden. Dit systeem maakt het mogelijk het effect van de compressie en afschuiving op neuronen te onderzoeken. In tegenstelling, werden andere systemen gebruikt om te onderzoeken in-plane uitrekkende5,6,7. De gemiddelde druk ontvangen door de neuronen in het midden van de puffende gebieden is 0,25 ± 0,06 nN/µm2 in ons systeem4. Deze druk op de cellen is vergelijkbaar met de elasticiteitsmodulus van hippocampal neuronen uitgedrukt eerder met behulp van scanning kracht microscopie en bulk reologie, ter identificatie van optisch geïnduceerde vervorming13,14, alsmede druk gebruikt voor het wijzigen van de groei van neurite leading randen in vitro gemeten door het scannen van kracht microscopie (0,27 ± 0,04 nN/µm2)16. Deze druk niet meer dan de druk die kan gegenereerd worden uiteraard door mesenchymale cellen in het embryo van een E11, zoals gemeten met behulp van mechanisch specifieke fluorescerende cel middelgrote olie microdruppels (1.6 ± 0.8 nN/µm)2,14.
Dit systeem heeft al met succes gebruikt in combinatie met calcium imaging, patch klemmen, elektronische microscoop en cellulaire analyse van een gesloten schedel mTBI muis model4. De bepaling kan ook worden gebruikt in combinatie met Microscoop gebaseerde experimenten, zoals fluorescentie herstel na photobleaching (FRAP), eiwit verloop binnen varicosities onderzoeken, evenals het FRET te studeren als eiwit-eiwitinteractie worden gewijzigd tijdens de vorming van de varicosity. In wezen, een methode die kan worden gedaan met behulp van een microscoop en een levende cel imaging set-up kan gekoppeld worden aan deze puffende assay. De veelzijdigheid van deze test is zeer waardevol bij het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de verschillende effecten op de morfologie van de neuronale en functies door micromechanische stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Alle dierproeven zijn uitgevoerd overeenkomstig de nationale instituten van gezondheid dier gebruik richtsnoeren. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01NS093073 en R21AA024873) aan C. Gu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
References
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat. Med. 17, 495-499 (2011).
- Yang, J., et al. Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin. Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).
- Debanne, D.
- Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation. J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).
- Chung, R. S., et al. Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy. J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).
- Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury. Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).
- Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).
- Donkin, J. J., Vink, R. Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments. Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis. J. Micromech. Microeng. 23, 015002 (2013).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
- Franze, K., et al. Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact. Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
