Summary
Denne protokol beskriver en fysiologisk relevante, trykisoleret væske tilgang for hurtige og reversible induktion af varicosities i neuroner.
Abstract
Cytoskeletale varicosities er udvidede strukturer langs skafter af axoner med en høj grad af heterogenitet. De er til stede i hjerner med neurodegenerative sygdomme eller skader, men også i den normale hjerne. Her, beskriver vi et nyligt etableret micromechanical system hurtigt, pålideligt og reversibelt fremkalde cytoskeletale varicosities, tillader os at forstå de mekanismer, der regulerer varicosity dannelse og heterogene protein sammensætning. Dette system repræsenterer en roman midler til at vurdere virkningerne af kompression og shear stress på forskellige subcellulært rum af neuroner, adskiller sig fra andre in vitro- systemer, der hovedsagelig fokusere på effekten af stretching. Vigtigere, på grund af de unikke funktioner i vores system gjorde vi for nylig en nye opdagelse viser, at anvendelsen af trykisoleret væske kan hurtigt og reversibelt fremkalde cytoskeletale varicosities gennem aktivering af en forbigående receptor potentielle kanal. Vores biomekaniske system kan blive udnyttet bekvemt i kombination med narkotika perfusion, levende celle imaging, calcium imaging og patch klemme optagelse. Denne metode kan derfor vedtages for at studere mechanosensitive Ionkanaler, cytoskeletale transport forordning, cytoskeletale cytoskeleton dynamics, calcium signalering og morfologiske ændringer relateret til traumatisk hjerneskade.
Introduction
Varicosity dannelse eller hævelse/beading, langs axoner, er et fremtrædende træk ved neurodegeneration observeret i mange lidelser eller skader i centralnervesystemet, herunder multipel sclerose, Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, og traumatisk hjernen skade1,2. Trods de betydelige fysiologiske virkninger af cytoskeletale varicosities på aktionspotentialet formering og synaptisk transmission3forbliver hvor varicosities genereres ukendt. For nylig, ved hjælp af en nyligt oprettede microbiomechanical analyse på kulturperler hippocampus neuroner fra gnavere, vi fandt, at mekaniske stimuli kan fremkalde varicosities i disse neuroner med meget spændende funktioner. Første varicosity induktion er hurtig (< 10 s), og denne proces er uventet reversibel. Andet, varicosity indledning afhænger af styrken puffing pres: jo højere tryk, jo hurtigere indledning. For det tredje afhænger varicosity indledning af neuronal alder. Axoner af yngre neuroner vises mere lydhøre over for mekanisk stress, sammenlignet med dem af ældre neuroner. Fjerde, formen varicosities langs axoner af hippocampus neuroner, mens dendritter og indledende axon segmenter af disse neuroner viser ingen ændring på samme stønnende betingelse. Således, vores undersøgelse afslørede en roman funktion af neuronal polaritet. Disse resultater med in vitro -system er fysiologisk relevante. Ved hjælp af en i vivo model for mild traumatisk hjerneskade (mTBI), viste vi at cytoskeletale varicosities udviklet i en multi-focal mode i den somatosensoriske cortex af musene umiddelbart efter tæt-kraniet indvirkning, i overensstemmelse med vores in vitro- resultater4. Det er vigtigt at bemærke, at vores farvning og billeddannelse af mTBI mus kun give et snap shot af neuronal morfologiske ændringer, siden udfører i vivo time-lapse billeddannelse af neuronal morfologi under en mekanisk påvirkning er stadig ikke muligt.
Denne væske-puffing system tilladt os at fange unikke funktioner forbundet med mekanisk stress-induceret varicosity dannelse, men også til at bestemme den underliggende mekanisme. Ved at teste forskellige ekstracellulære løsninger, blokkere og oplukkere for forskellige kandidater mechanosensitive Ionkanaler, og cellulære Elektrofysiologi, konstateret vi at den forbigående receptor potentielle kation kanal underfamilie V medlem 4 (TRPV4) kanal, der er gennemtrængelig for Ca2 + og Na+ og aktiveres ved puffing er hovedsagelig ansvarlige for afsløring indledende mekanisk stress under cytoskeletale varicosity dannelse4. Dette blev yderligere bekræftet med siRNA knockout tilgang. Taget sammen, denne nye analyse system vi har udviklet med hippocampus neuron kultur, er meget værdifuldt for at studere micromechanical egenskaber af centrale neuroner, især i kombination med andre teknikker.
Dette micromechanical system har vi etableret er unik og adskiller sig fra de tidligere eksisterende systemer i flere vigtige aspekter. Først, i dette system, neuronerne erfaring ud af flyet mekanisk stress i form af kompression og klipning. Under den mekanisk påvirkning, neuronal processer forbliver knyttet til coverslip overfladen og flytte ikke. Dette adskiller sig fra andre eksperimentelle systemer, der hovedsagelig involveret bøjning og i flyet stretching (eller spænding), for eksempel, afbøjning af bundtet axoner gerne flytte strings5,6 eller strække axoner dyrkes på micropatterned kanaler og elastisk membraner7,8. Desuden, selvom cytoskeletale varicosities kan også induceres i disse assays ligesom i vores væske-puffing system, processen i disse indstillinger tager meget længere tid (fra 10 min. til flere timer6,7,8) og vises irreversibel. Endelig, vores system ved hjælp af lokale væske puffing giver mulighed for undersøgelse af de fysiske funktioner af varicosity dannelse (fx., dendritter, dendritiske pigge, soma, cytoskeletale indledende segmenter, cytoskeletale terminaler), ud over dens tidsmæssige funktioner. Ved hjælp af dette system, opdagede vi flere uventede og unikke funktioner af cytoskeletale varicosity dannelse, især hurtigt indsættende, langsom reversibilitet og axon-dendrit polaritet.
Det system, som vi diskuterer i dette papir er kompatibel med mange teknikker til molekylære og Cellens biologi. For eksempel, for at studere virkningerne af mekanisk stress på neuronal morfologi og funktion, kan det bruges sammen med myelin coculture, time-lapse imaging af fluorescerende resonans energioverførsel (FRET) og total interne reflection fluorescens (JOHANNAS), calcium billeddannelse, og lappe klemme optagelse. I dette papir fokuserer vi på centrale elementer i systemet. Hippocampus neuron kultur, væske-puffing opsætning, høj opløsning time-lapse tænkelig nemlig cytoskeletale transport og calcium imaging er illustreret trin for trin nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle nedenfor beskrevne metoder er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Ohio State University.
1. Coverslip forberedelse
- Placere en eller flere kasser med 12 eller 25 mm coverslips i et glas bægerglas indeholder 70% salpetersyre og inkuberes coverslips ved rumtemperatur natten over.
Bemærk: Ikke vaskes 25 mm coverslips i det samme bæger som 12 mm coverslips. Det er bedre at vaske dem separat. - Overføre alle coverslips i en 4 L bægerglas fyldt med 2,5 L af Hedeselskabet2O og ryste bægerglasset indeholdende coverslips for 1 h ved 100 omdrejninger i minuttet. Brug gummi bands for at holde bægerglasset under omrystning. Gentag skylles med frisk 2,5 L ddH2O fire gange.
- Overføre renset coverslips til en tør kolbe med et metal dække. Bag coverslips i ovnen ved 225 ° C til 6 h og lad dem afkøle til stuetemperatur.
Bemærk: 25 mm coverslip er tilbøjelige til at bryde. Adskille coverslips én efter én og lufttørre, så bage dem i ovnen. - Gemme den tørret og renset coverslips ved stuetemperatur i en steriliseret plastikbeholder indtil brug.
-
Frakke af coverslips som følger:
- Forberede frisk belægning løsning i et centrifugeglas.
- Placere hvert coverslip i et godt af en 24-godt (eller 6-godt) plade. Anbring 30 (eller 100) µL af coverslip belægning løsning (tabel 1) på en 12 mm (eller 25 mm) coverslip og hvirvel. Der tilsættes 1 mL af sterile fosfatbufferet saltopløsning (PBS, vævskultur grade) til brønden. Disse plader kan enten bruges straks eller opbevares ved 4 ° C i steril PBS for op til en uge.
- På dagen for dissektion, fjerne PBS. Lufttørre og læg pladerne i UV-lys (30W) for 2-4 h.
Bemærk: Det sidste skridt skal udfyldes med UV-lys på i en celle kultur laminar flow hætte. Døren til emhætten bør ophæves lidt til at tillade luft flow til tørring af coverslips.
2. dissektion, Dissociation og kultur af hippocampus neuroner fra gravide mus/rotte
-
Dissektion og dissociation af hippocampus neuroner for kultur
- Tø protease enzym løsning (3 mg/mL protease 23 i SLD'ER, tabel 1) og pre varm plating medier (tabel 2) ved 37 ° C.
- Dissekere hippocampus og skyl med SLD'ER, efter de metoder, der er beskrevet i tidligere publikation14.
Bemærk: Fire hippocampi give nok celler for en 24-godt eller en 6-godt plade. - Fjerne SLD'ER, tilsættes 2 mL protease enzym, og Inkuber prøve ved 37 ° C, 5% CO2 for 15 min.
- Vask hippocampus explants med 5-10 mL af plating medium to gange. Der tilsættes 5 mL plating medium. Adskille hippocampus explants i enkelte celler ved at generere en lille vortex ved hjælp af en pipette med 1 mL plastik tip. Undgå dannelsen af ilt bobler, indtil løsningen bliver overskyet og ingen store stykker af eksplantat fortsat, pipetteres op og ned omkring 40 gange.
Bemærk: Husk at forlade nogle medier under vasker, hippocampus explants bør forblive neddykket i mediet under hele processen. - Der centrifugeres celler på 1,125 x g i 3 min. Fjern supernatanten med celler neddykket i medierne. Resuspend celler i 145 mL plating medier. Tilføje 1 mL/hul i en cellesuspension til en 24-godt plade (3 mL/hul til en 6-godt plade).
Bemærk: 145 mL plating medier bruges til at producere en cellesuspension, der har en lav celle tæthed. Dette volumen vil tillade plating af celler i seks 24-godt plader, otte 6-godt plader eller forskellige kombinationer af 24 - eller 6-godt plader afhængigt af eksperimenter skal gennemføres. Hver brønd af 24-godt plade vil have omkring 3 x 104 celler9. - Inkuber celler i plating medier ved 37 ° C, 5% CO2 for 2-4 h, derefter fjerne alle plating medier og erstatte det med friske vedligeholdelse medier.
- Efter 2 dage (2 dage i vitro, 2DIV), Erstat halvdelen af medierne med 2 µM Ara-C (arabinosylcytosine) opløses i vedligeholdelse medier, der hæmmer væksten af fibroblaster, endotel og glial celler. Efter udsætter celler til Ara-C i to dage, skal du erstatte medierne med friske vedligeholdelse medier.
-
Transfektion for visualisering af celle morfologi
Bemærk: Transfect celler med fluorescerende konstruktioner af grøn fluorescerende proteiner (NGL), gul fluorescerende proteiner (YFP), mCherry, etc. til at belyse morfologi af individuelle neuroner.- Fortynd konstruktioner fra lager (1 µg/µL) i Opti-MEM medier (0,8 µg af construct i 50 µL af Opti-MEM medier) og vortex. Forberede 1 konstruere fortynding til hver brønd.
Bemærk: En 24-godt plade kræver 0,8 µg konstruktion i 50 µL af Opti-MEM medier. En 6-godt plade kræver 2.4 µg konstruktion i 150 µL Opti-MEM medier. - Fortyndet Liposom-medieret Transfektion reagens i Opti-MEM medier (1,5 µL Transfektion reagens i 50 µL af Opti-MEM medier) og vortex. Forberede 1 Transfektion fortynding til hver brønd.
Bemærk: En 24-godt plade kræver 1,5 µL Transfektion reagens i 50 µL af Opti-MEM medier. En 6-godt plade kræver 4,5 µL Transfektion reagens i 150 µL af Opti-MEM medier. - Forbered en 1:1 blanding (100 µL) af construct i Opti-Mem medier og Transfektion reagens i Opti-MEM medier og vortex. Inkuber blanding ved stuetemperatur i 20 min.
Bemærk: Pr. brønd, skal der være ca. 100 µL opløsning indeholdende konstruktion, Transfektion reagens og Opti-MEM medier hvis ved hjælp af en 24-godt plade (300 µL for 6-godt plade). - Fjern halvdelen af medierne (500 µL til 24-godt plade, 1,5 mL for 6-godt plade) fra hver brønd og overføre dette medie til en ren koniske rør. Holde dette rør i rugemaskinen. Derefter tilsættes 100 µL blanding (trin 2.2.3) til resterende medierne i brønden. Tillad at cellerne inkuberes ved 37 ° C i 20-30 min.
- Under inkubationen (trin 2.2.4), skal du tilføje et volumen af friske vedligeholdelse medier til medierne i den koniske rør (trin 2.2.4). Placer blandingen i den samme inkubator (37 ° C og 5% CO2).
- Efter inkubation, fjerne alle medier indeholdende Transfektion løsning fra brøndene og erstatte det med 1:1 blanding af gamle og frisk vedligeholdelse medier i den koniske rør (trin 2.2.5).
Bemærk: Afhængigt af størrelsen af konstruktioner, cellerne kan begynde at udtrykke inden for 12 timer; for større konstruktioner, kan 3-4 dage være nødvendig før peak udtryk for konstruktioner er nået.
- Fortynd konstruktioner fra lager (1 µg/µL) i Opti-MEM medier (0,8 µg af construct i 50 µL af Opti-MEM medier) og vortex. Forberede 1 konstruere fortynding til hver brønd.
3. opsætning af stønnende Pipette apparatet
Bemærk: Der er fem grundlæggende komponenter til dette set-up: glas pipette, slangen, sprøjten, micromanipulator og buffer (Hank). En buffer, der har fysiologisk relevante salt koncentrationer kan anvendes i dette set-up.
- Træk en borosilicate pipette at have omkring 45 µm diameter åbningen spids med en mikropipette aftrækker og specifikationerne i tabel 3.
Bemærk: Det blev konstateret, at 45 µm er en passende størrelse for diameteren af pipette åbning under forsøgsbetingelser. Små variationer i åbningen størrelse bør ikke væsentligt påvirker resultater. Det er vigtigt at bemærke, at større afvigelser fra dette antal stadig burde arbejde nemlig varicosity induktion ved at justere højden på sprøjten, der er knyttet til pipette via slanger, men dette kræver rekalibrering af værdien pres. - Indsæt den un-trak ende af pipetten i tynd gummi slange.
Bemærk: Slangen væggen skal være tynde og stive til at minimere den flydende modstand, sikrer, at højden af sprøjten er direkte proportionalt med trykket af væske strømmer gennem pipetten med ubetydelig modstand. Slangen bør ikke længere end ca. 0,6 m i længde, yderligere minimere modstanden. - Tilslut anden enden af slangen til en 10-mL plastik sprøjte via et stik med en turn-stand ventil.
Bemærk: Plast sprøjten skal holdes på et konstant og målelige højde til at sikre et noejagtigt maal for formodede tryk strømmer fra pipetten. En højde af 190 mm blev udnyttet, da dette giver minimal tryk men pålideligt inducerer varicosities i axoner. Andre højdeværdier kan også bruges, hvis presset bevirke, at cellerne til at løsne sig fra coverslip overfladen. Det anbefales at benytte den samme indstilling under hele forsøget. - Indsæt pipetten i skrue toppen af micromanipulator at holde pipetten på plads. Skrue metal, flad toppet skruen knyttet til micromanipulator arm, så det holder un-trak slutningen af pipette lige over hvor gummi slange er fastgjort. Vinkel afpipetteres i en 45° vinkel med overfladen af neuron-holdige coverslips.
Bemærk: Micromanipulator skal konstrueres, så der pipetten kan afholdes uden snærende gummi slange. Micromanipulator skal tillade bevægelse af pipette i x, y og z retninger for præcist at placere det inden for rækkevidde af cellerne. Grafik samt et fotografi af apparatet er angivet nedenfor (figur 1). - Tænd et fluorescens filter, åbne blænden, og sikre en fluorescerende plet kan ses kommer gennem målet. Bruger micromanipulator, flytte pipetten til en position, der liner op spidsen med fluorescerende stedet og sænke afpipetteres i en position lige over højden af celle kultur parabol (35 mm x 10 mm). Når det er i position, tænde den gennemlysning og slukke fluorescens.
- Brug af pincet, tilføje en coverslip (med celler opad mod pipetten) fra celle kultur plade til celle kultur fadet indeholdende ca. 2 mL af Hank's buffer ved stuetemperatur.
- Placere kultur skål indeholdende coverslip på anvendelsesområdet.
- Bruger fine fokus knop og 20 X mål, fokusere på et fly om fire fuld sving over celler (ca. 0.4 mm). Brug micromanipulator til at placere pipette tip, så det er fokuseret og i midten, venstre side af flyet set gennem øjet-stykker.
Bemærk: Dendritter er fremskrivninger, der skal være i den samme ramme som cellen kroppen de stammer fra. For at fremkalde cytoskeletale varicosities, bør man følge længere fremskrivninger fra cellen kroppen til mediale og distale axoner.
4. kalibrering af presset fra Pipette udnytter en elastisk membran System
- Setup stønnende pipette apparatet med de nøjagtige samme parametre som beskrevet ovenfor i et system, der indeholder en microfabricated silikone membran (500 µm i diameter) og 50 µm tykt og fokusere mikroskop på overfladen af membranen.
Bemærk: Dette system er designet til at måle små pres værdier og en forklaring af systemet har været offentliggjort før10. Denne måling skal kun gøres en gang for pustende eksperimenter hvis den nøjagtige samme indstilling af puffing bruges. - Fokusere mikroskopet på arrays af mikroprikker (4 µm i diameter) og 10 µm apart, målt mellem centre. Drej stopventilen og tillade væske til at flyde ud af en pipette. Undersøge udbøjning af membranen i svar på den væske trykket med en Konfokal mikroskop.
- Udnytte en lineær model for at bestemme den tilsvarende pres i forbindelse med udbøjning af membranen.
Bemærk: Mens en nylig undersøgelse konstateret, at en fordrejning af w =-3.143 ± 0,69 µm blev fremstillet for 190 mm sprøjte højde, dette produceret et tryk på 0,25 ± 0,06 nN/µm2 fra den aktuelle opsætning af pipetten, som er inden for den fysiologiske og patologiske område, selv om den sprøjte højden er ikke den eneste faktor. Andre faktorer har indflydelse den nøjagtige trykværdi på neuroner samt, herunder pipette åbning, positionering (afstand og vinkel) af pipette tip i forhold til cellerne, og selv fleksibiliteten af slangen4,10.
5. pustende at fremkalde Varicosities
- Når pipetten er i position, fokusere mikroskopet på en plan, der indeholder et område af interesse. Placere celler og processer i den venstre halvdel af imaging feltet (set af live capture af kameraet) inden for området stønnen, mens den højre halvdel er uden for pustende område.
Bemærk: På grund af omfattende udvækst af axoner og dendrites af neuroner, det er usandsynligt, at alle processer af en neuron er inden for samme stønnen. Dette er faktisk en fordel ved dette system, som giver mulighed for undersøgelse af den lokale virkning af pustende. Der er to typer af pustende, der kan udnyttes til at fremkalde varicosities: lang varighed pustende og puls pustende. -
Puffing
- Lang varighed puffing
- Placer sprøjten på højden, 190 mm over den coverslip, der indeholder kulturperler neuroner4. Begynde time-lapse billeddannelse af interesseområde med en optimeret eksponeringstid afsløre klare neuronal morfologi. Optage mindst 15 frames på en 2 s interval (30 s alt) som baseline. Intervallet kan justeres baseret på forsøget. På rammen 16, åbne turn-stand stopventilen af sprøjten og tillade væske til at flyde til 75 rammer (150 s). På ramme 75, slå ventilen så væske flow stopper. Stoppe videooptagelse.
Bemærk: Dette bør fremkalde cytoskeletale varicosities i neuroner 7-9 DIV inden for 5-10 s, mens ældre neuroner tage længere tid at form varicosities.
- Placer sprøjten på højden, 190 mm over den coverslip, der indeholder kulturperler neuroner4. Begynde time-lapse billeddannelse af interesseområde med en optimeret eksponeringstid afsløre klare neuronal morfologi. Optage mindst 15 frames på en 2 s interval (30 s alt) som baseline. Intervallet kan justeres baseret på forsøget. På rammen 16, åbne turn-stand stopventilen af sprøjten og tillade væske til at flyde til 75 rammer (150 s). På ramme 75, slå ventilen så væske flow stopper. Stoppe videooptagelse.
- Puls (2 s varighed) puffing
- Placer sprøjten i den korrekte højde (190 mm). Begynde time-lapse imaging og optage mindst 15 frames (30 s) på en 2 s interval. På rammen 16, åbne ventilen på sprøjten og tillade væske til at flyde så lukke ventilen efter 2 s. Vent 5-20 s (afhængigt af frekvensen der skal testes) før du åbner ventilen igen. Gentag åbning og lukning af ventilen for at skabe flydende pulser, og fortsætte i en samlet periode på 150-300 s. Fortsæt time-lapse imaging i 20 min. til at fange opsving fase.
Bemærk: Når intervallet er længere end 10 s, bælgfrugter fremkalde drastisk mindre varicosities. På et 20 s interval, kan ingen varicosities være fremkaldt af pulser4. For at få pålidelig, ensartet varicosity dannelse, tilrådes det sprøjte højden bør være omkring 190 mm. sprøjte højde og væsketryk bør ikke være op til et punkt, hvor cellerne begynde at løsrive fra coverslip overfladen.
- Placer sprøjten i den korrekte højde (190 mm). Begynde time-lapse imaging og optage mindst 15 frames (30 s) på en 2 s interval. På rammen 16, åbne ventilen på sprøjten og tillade væske til at flyde så lukke ventilen efter 2 s. Vent 5-20 s (afhængigt af frekvensen der skal testes) før du åbner ventilen igen. Gentag åbning og lukning af ventilen for at skabe flydende pulser, og fortsætte i en samlet periode på 150-300 s. Fortsæt time-lapse imaging i 20 min. til at fange opsving fase.
- Før en dag med brug, rense set-up (pipette, slangen og sprøjten) af flydende om 10 mL 70% Ethanol gennem set-up. Efter ethanol vask, gennemstrømning set-up til prime system for at dagen brug 10 mL af Hank's buffer (eller ønskede buffer). Efter efterbehandling eksperimenter for dagen, rense set-up som tidligere beskrevet med ethanol til at forhindre vækst af forureninger natten over.
- Lang varighed puffing
6. komplimenterede metoder
Bemærk: Stønnende analysen kan kombineres med en række forskellige teknikker, der er beskrevet i afsnittet Introduktion. Her er fokus på de centrale teknikker, der bruges oftest sammen med det stønnende assay, herunder højopløselige fluorescens timelapse imaging, calcium billeddannelse og inddrivelse assays. Disse er beskrevet nedenfor.
-
Foretage høj opløsning fluorescerende time-lapse billeddannelse ved at følge protokollen nedenfor
- Spore bevægelser fluorescently markeret proteiner i neuroner med en 100 X olie linse. Neuroner er transfekteret med den korrekte cDNA konstruktion. Fange for 150 billeder (i alt 300 s) med en 2 s interval.
Bemærk: Nogle gange, multiple-farve time-lapse imaging udføres for at billede bevægelse af mere end én fluorescently markeret protein samtidigt. - Generere en kymograph enten via den video-optagelse software eller gennem ImageJ (NIH).
Bemærk: Den hastighed og retning for indtastning af rejse kan bestemmes ved hjælp af kymograph. * Sikker på være at bemærke den retning soma ligger fra regionen fanget. Rejse mod soma er retrograd, mens rejse væk fra soma på cytoskeletale spidsen er anterograd. - Gentag denne proces stønnen, eller en kymograph kan oprettes ved hjælp af billedoptagelse under den stønnende assay.
Bemærk: Virkningerne af puffing cytoskeletale transport af mitokondrier og synaptic proteiner blev vist i en nylig papir4.
- Spore bevægelser fluorescently markeret proteiner i neuroner med en 100 X olie linse. Neuroner er transfekteret med den korrekte cDNA konstruktion. Fange for 150 billeder (i alt 300 s) med en 2 s interval.
-
Calcium imaging
- Tilføj 1 µL (for en 24-godt plade) eller 3 µL (for en 6-godt plade) 5 mm Fluo-4 AM til kultur medier i et godt og inkuberes ved 37 ° C i 30 min.
- Cellerne vaskes to gange med 1 mL Hank buffer.
Bemærk: Indlæst neuroner udsender grønne fluorescens gennem et FITC filtersæt. Loci betegne regioner af mærkbare calcium i cellen. Når det kombineres med pustende, ses en stigning i intensitet (stigning i indre calcium niveau).
-
Varicosity inddrivelse
Bemærk: Umiddelbart efter en stønnen eksperiment, en 20 min recovery eksperiment kan foretages.- Capture billeder til 300 rammer (1.200 s) med en 4 s interval.
Bemærk: En celle, transfekteret med opløselige YFP/mCherry/NGL skal vise et moderat niveau (mindre end 50%) af inddrivelse ved udgangen af imaging-session. Cytoskeletale opsving afhænger af en række faktorer, såsom udviklingsstadiet af kulturperler neuroner4. Dette kan også kombineres med høj opløsning fluorescerende imaging og calcium imaging beskrevet ovenfor.
- Capture billeder til 300 rammer (1.200 s) med en 4 s interval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før pustende, vise axoner normalt lidt varicosity dannelse. Følgende pustende med vores normaltryk (190 mmH2O højde), axoner begyndelsen at udvikle mange perle-lignende varicosities. Dannelsen af varicosities er delvist reversibel, som det fremgår af regioner af axon vender tilbage til deres pre kvældet tilstand efter en 10 min opsving periode (figur 2A-B). Efter en længere periode med opsving (> 20 min), nogle axons helt inddrive. Ikke-optimal placering af den stønnende pipette samt nøjagtig positionsbestemmelse af sprøjten på 190 mm over scenen kan ikke generere varicosities hurtigt. Optimale betingelser bør resultere i varicosity dannelse i axoner af unge neuroner (omkring 7 DIV) i ca. 5 s4.
Figur 1 : Skematisk og fotografi af puffing apparater. (A) fotografier, der viser samlede mikroskop set-up. (B) Puffing apparatet viser glas pipette indehaves af micromanipulator og tilsluttet gummi slange. (C) fase kontrast billeder med fokus på flyet af primære hippocampus neuroner viser skyggen af pipette i nederste højre. (D) ud af cellen flyet fokuseret på puffing pipette tip. (E) skematisk af afstande og beregnede pres for at fremkalde varicosities. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant billeder af varicosity dannelse efter pustende. (A) billeddannelse af 7DIV, normal god landbrugspraksis transfekteret mus hippocampus neuroner viser en axon pre og post pustende og efter en 10 min tilbagebetalingsperioden. (B) Kymograph af time-lapse billeddannelse af neuron i (A). Røde pile indikerer varicosities, der har dannet efter 150 s af 190 mmH2O puffing (starter ved 30 s). Skalalinjen = 15 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Coverslip belægning løsning | |
| 780 ΜL | Eddikesyre acid17 mM lager: 50 µL eddikesyre i 50 mL H2O |
| 200 ΜL | Poly-D-lysin (0,5 mg/mL stock) |
| 20 ΜL | Rotte hale kollagen (3 mg/mL stock) |
| Det samlede volumen bestemmes baseret på antallet af coverslips skal belægges. | |
Tabel 1: Coverslip belægning løsning. Giver opskriften til at forberede den coverslip belægning løsning anvendes til at sammenføje kulturperler celler til coverslips.
| 1 x skive dissektion løsning (SLD'ER), filtreret, pH = 7.4, opbevares ved 4 ° C | |
| 1 L | Hedeselskabet2O |
| 82 mM | Na2så4 |
| 30 mM | K2så4 |
| 10 mM | HEPES (fri syre) |
| 10 mM | D-glukose |
| 5 mM | MgCl2 |
| 0,00% | Phenol rød (valgfri) |
| Plating medier (PM, filtrere, opbevares ved 4 ° C) | |
| 439 mL | MEM Earle salte |
| 50 mL | FBS |
| 11,25 mL | 20% D-glukose |
| 5 mL | Natrium pyruvat (100 mM) |
| 62,5 ΜL | L-glutamin (200 mM) |
| 5 mL | Penicillin/Streptomycin (P/S, 100 x) |
| Vedligeholdelse medier (MM, filtrere, opbevares ved 4 ° C) | |
| 484 mL | Neurobasal |
| 10 mL | B27 50 x supplement |
| 1,25 mL | L-glutamin (200 mM) |
| 5 mL | 100 x P/S |
| Alle løsninger er steriliseret med et filter med 0,2 mm porestørrelse. | |
Tabel 2: celle kultur medier opskrifter. Giver opskrifter til at forberede medier udnyttes i dyrkning af primære hippocampus neuron celler.
| Hank's buffer (filter, pH = 7.4, butik på 4° C | |
| 150 mM | NaCl |
| 4 mM | KCl |
| 1,2 mM | MgCl2 |
| 1 mM | CaCl2 |
| 10 mg/mL | D-glukose |
| 20 mM | HEPES |
Tabel 3: Hank's buffer opskrift. Giver opskriften til at forberede bufferen udnyttet i stønnen protokollen og under live-celle billeddannelse.
| Der afpipetteres trække parametre | |||||
| Varme | Trække | Hastighed | Forsinkelse | Pres | Rampe |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
Tabel 4: afpipetteres trække parametre. Giver parametrene, der indstilles på pipette aftrækker at opnå en åbning, der er omkring 45 µm i diameter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proceduren for denne microbiomechanical assay er ligetil. Det vil producere pålidelige resultater, hvis alle dets trin udføres omhyggeligt. Der er flere vigtige skridt, der hvis forkert udført, vil hindre vellykket dataindsamling. De kritiske trin begynder opstrøms af den faktiske anvendelse af stønnende stimulus. Omhyggelig dissektion, dyrkning og pleje af den primære neuron kultur er i højsædet. Hvis de kulturperler neuroner ikke er sundt, vil de ikke reagere konsekvent, da de måske har allerede blevet grundmalet for stress. Neden for kulturen, den indledende opsætning og kalibrering af apparatet stønnen at levere konsekvent pres, der vil fremkalde varicosities, men vil ikke forårsage detachment af cellerne, fra coverslip overflade, skal udføres med tålmodighed. Nøjagtig kalibrering af set-up kan tage 1 h pipette tilstopning, slange og ventil problemer. Det er afgørende at sikre, at væske løber ud af pipetten med minimal modstand før du flytter videre med markedsføring cellerne i fadet og positionering pipette tip. Så vidt angår ændringer af set-up kan et par stønnende apparatet med perfusion, patch fastspænding og eventuelle andre mikroskop-baseret instrument, for det meste afhængig af den fysiske plads på siderne af mikroskopet.
Dette system har to iboende begrænsninger, der kræver opmærksomhed. Set-up kan konsekvent initiere dannelsen af reversibel varicosities i axoner af kulturperler hippocampus neuroner gennem stønnende væske til cellerne. Det er dog vigtigt at bemærke, at de nøjagtige pres værdier til neuroner inden for samme stønnen ikke er identiske. Det væsketryk, der påvirker cellerne, beregnet på grundlag af pres belastning måling fra en microfabricated silikone membran4,10, repræsenterer den gennemsnitlige pres i midten af feltet stønnen. Den nøjagtige stønnende pres er således den højeste i midten af feltet stønnen og den laveste rundt i kanten af feltet. Vi viste, at pres styrke korrelerer med symptomdebut, størrelsen og antallet af varicosities induceret4. Højere tryk resulterede i hurtigere indsættende, større, og mere rigelig varicosities4. I vores nyere undersøgelser brugte vi en minimal tryk (190 mmHg på spidsen af stønnende pipette), der stadig pålideligt kan fremkalde varicosities i de fleste axoner4. På denne betingelse, varicosity debut for unge neuroner er normalt omkring 5 s. Det er vigtigt at bemærke, at med den nøjagtige samme puffing system, værdien af gang kan variere, der ikke kun afhænger af neuronal type, alder og subcellulært rum, men kan også være påvirket af placeringen af neuron i feltet stønnen. Trods variation af stønnende pres modtaget af neuroner, denne analyse system stadig giver et pålideligt middel til at studere mekaniske effekter på centrale neuroner, og giver meget konsekvent og reproducerbar eksperimentelle resultater.
Den anden begrænsning af systemet er dens tilstopning spørgsmål. For at opnå fysiologisk relevante pres, er åbningen af pipetter lille, omkring 45 μm. Men den lille åbning tendens til at tilstoppe med vragrester fra den plastslanger og vragrester i pipette tip kan ses tydeligt under mikroskop. Dette øger mængden af tid prepping set-up, i tilfælde af en pipette træsko. Alle løsninger er derfor omhyggeligt filtreret før sættes ind i sprøjten, slanger og pipette. Det er også vigtigt at vaske den stønnende system med 70% ethanol i starten og slutningen af dagen, efterfulgt af vask med filtreret Hank buffer. For at løse den potentielle tilstopning problem, foreslår vi forsøger at trække flere pipetter. Det er vigtigt at bekræfte, at løsningen er faktisk pustede ud af pipette gennem visualisering før du starter eksperimenterne. Når en god stønnende system er etableret, kan det normalt vare resten af dagen.
Denne Biomekanisk analyse, kombineret med neuron kultur, præsenterer en unik mulighed for at studere centrale neuron mechanosensation efterligne fysiologiske og/eller patofysiologiske forhold. Dette system gør det muligt for os at undersøge effekten af kompression og klipning på neuroner. I modsætning hertil er blev andre systemer brugt til at undersøge i flyet strækker5,6,7. Det gennemsnitlige tryk modtaget af neuroner i midten af de stønnende områder er 0,25 ± 0,06 nN/µm2 i vores system4. Dette pres på celler er sammenlignelig med elasticitetsmodul af hippocampus neuroner målt tidligere udnytte scanning force mikroskopi og bulk reologi, for at identificere optisk induceret deformation13,14, samt pres bruges til at ændre vækst af neurite forkanterne in vitro målt ved at scanne kraft mikroskopi (0,27 ± 0,04 nN/µm2)16. Dette pres overstiger ikke det pres, der kan genereres naturligvis af mesenchymale celler i embryonet E11 målt ved hjælp af mekanisk specifikke fluorescerende celler mellemstore olie microdroplets (1,6 ± 0,8 nN/µm)2,14.
Dette system har allerede med succes brugt i kombination med kalcium imaging, patch fastspænding, elektronisk mikroskop og cellulære analyse af en lukket kraniet mTBI musen model4. Analysen kan også bruges i kombination med mikroskop-baserede eksperimenter, såsom fluorescens opsving efter photobleaching (FRAP), til at undersøge protein turn-over i varicosities, samt ærgre sig for at studere hvis protein-protein interaktioner er ændret under varicosity dannelse. Det væsentlige, en metode, der kan gøres ved hjælp af et mikroskop og en levende celle imaging set-up kan parres med denne stønnende assay. Alsidigheden af dette assay er værdifulde i at studere de molekylære mekanismer bag forskellige effekter på neuronal morfologi og funktion af micromechanical stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Alle dyreforsøg har gennemført i overensstemmelse med de nationale institutter for sundhed dyr brug retningslinjer. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra National Institutes of Health (R01NS093073 og R21AA024873) til C. Gu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
References
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat. Med. 17, 495-499 (2011).
- Yang, J., et al. Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin. Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nat. Rev. Neurosci. 5, 304-316 (2004).
- Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation. J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).
- Chung, R. S., et al. Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy. J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).
- Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury. Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).
- Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).
- Donkin, J. J., Vink, R. Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments. Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis. J. Micromech. Microeng. 23, 015002 (2013).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
- Franze, K., et al. Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact. Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
